芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优...及促进果树枝条降解效果研究_张家星.pdf

62中国果树，2023（2）：62-67本文于 2022-08-10 收到，2022-08-29 收到修改稿。*山西省 1331 工程资助项目（20211331-15）；山西省重点研发计划重点项目（201903D211002）；国家重点研发计划项目（2019YFC1710802）；山西省农业科学院农业科技创新工程项目（YGC2019KQ06、YGC2019TD08、YGC2019TD07）。张家星 E-mail：；闫敏为通信作者，E-mail：。DOI：10.16626/ki.issn1000-8047.2023.02.011芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优化及促进果树枝条降解效果研究*张家星1,2，姚怡敏1,2，闫敏1,2，李磊3，张强1,2，杨治平1,2，史向远4（1 山西省土壤环境与养分资源重点实验室，太原 030031）（2 山西农业大学生态环境产业技术研究院）（3 山西农业大学园艺学院）（4 山西农业大学山西有机旱作农业研究院）摘要为确定芽孢杆菌腐熟菌剂的高效固态发酵工艺参数并研究该菌剂在促进果树枝条堆肥进程中降解的效果，采用单因素试验结合多因素正交试验的方法对芽孢杆菌的发酵参数进行了优化，并测定了该菌剂对果树枝条堆肥过程中纤维素与木质素降解的影响。结果表明，在麸皮固体培养基中添加 30%玉米粉、0.2%葡萄糖、0.1%胰蛋白胨、0.015%硫酸镁，控制培养基接种量为 20%、固液比为 10.8、发酵温度为 28 即可实现芽孢杆菌的高效培养，有效菌落数最高达 1 150.00108cfu/g。此外，果树枝条中添加 2.5%芽孢杆菌腐熟菌剂进行堆肥可显著促进纤维素与木质素的降解，降解率分别提高 191.00%与 107.01%。关键词果树枝条堆肥；芽孢杆菌；发酵工艺；纤维素；木质素中图分类号：S66文献标志码：A文章编号：1000-8047(2023)02-0062-06O Op pt ti im mi iz za at ti io on n o of f f fe er rm me en nt ta at ti io on n p pr ro oc ce es ss s o of f b ba ac ci il ll lu us s c co om mp po os st ti in ng g a ag ge en nt t a an nd d i it ts s e ef ff fe ec ct to on n p pr ro om mo ot ti in ng g f fr ru ui it t b br ra an nc ch he es s d de eg gr ra ad da at ti io on nZHANG Jiaxing1,2,YAO Yimin1,2,YAN Min1,2,LI Lei3,ZHANG Qiang1,2,YANG Zhiping1,2,SHI Xiangyuan4(1 Shanxi Province Key Laboratory of Soil Environment and Nutrient Resources,Taiyuan 030031)(2 Institute of Eco-environment andIndustrial Technology,Shanxi Agricultural University)(3 College of Horticulture,Shanxi Agricultural University)(4 Shanxi Institute of Organic Dryland Farming,Shanxi Agricultural University)A Ab bs st tr ra ac ct tIn order to determine the suitable parameters for bacillus decomposing agent in the solid-state fermentationand evaluate its effect on promoting the degradation of fruit branches in composting process.The optimum fermentationparameters of bacillus were determined by single factor test and multi-factor orthogonal test in this study,and the effect ofthis agent on lignin and cellulose degradation in fruit branch composting was verified.The results showed that in thesolid-state fermentation of bacillus agent,the highest colony count of 1 150.00108cfu/g was achieved in bran medium withthe addition of 30%corn meal,0.2%glucose,0.1%tryptone and 0.015%magnesium sulfate.And the fermentationconditions were controlled at the inoculation amount of 20%,solid-liquid ratio of 10.8 and fermentation temperature of28.Furthermore,the degradation rates of cellulose and lignin increased by 191.00%and 107.01%by adding 2.5%bacillus agent to the fruit branch during the composting.K Ke ey y w wo or rd ds scomposting of fruit tree branches;bacillus;fermentation technology;cellulose;lignin我国是果树产业第一大国，2018 年我国农业生产中果树修剪残枝的年总量已达 4 650 万 t1-2。果树枝条中有机组分含量高，是潜在的有机资源，堆肥处理能够实现有机废弃物的减量化与无害化，堆肥产物也可作为肥料使用，成为实现果树枝条有机资源高效循环利用的有效手段3-5。果树枝条中纤维素与木质素含量较高，木质素分子含有多种复杂稳定的键型，降解难度大6，纤维素则多被木质素包裹，微生物利用转化困难7-9，最终导致枝条堆肥进程缓慢。因此，纤维素与木质63张家星，姚怡敏，闫敏，等：芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优化及促进果树枝条降解效果研究素降解缓慢是果树枝条堆肥进程中的主要限速步骤。近年来，向堆肥物料中添加微生物菌剂的生物降解法操作简单、降解效果好且对环境友好10-12，可以达到快速堆肥的目的13，在堆肥工程中得到了较多应用14。其中细菌抗逆性强、适应性好、繁殖迅速、培养难度小且成本低15，通常被优先作为加速堆肥腐熟的功能菌种开发使用。武肖莎等16与李龙涛等17的研究均证实芽孢杆菌不仅具有较强的木质纤维素降解能力，同时其生长快、稳定性好，可以在堆肥的高温环境中保持较高的活性。因此，以芽孢杆菌为主体的腐熟菌剂在促进果树枝条的堆肥工艺中有较高的应用前景。与传统的液体菌剂相比，基于固态发酵制备的固体菌剂在制作、保存以及运输上更有优势，但芽孢杆菌腐熟菌剂的固态发酵工艺研究起步较晚，发酵载体、发酵条件的研究较为单一18，发酵工艺发展缓慢，在推广与应用上存在一定限制。基于上述问题，本研究以有效菌落数为参考指标，对芽孢杆菌腐熟菌剂的固体培养基组成以及固态发酵条件进行完善与优化。以期寻找适用于芽孢杆菌腐熟菌剂的高效固态发酵工艺，同时对该菌剂产品促进果树枝条降解的效果进行评价，评估其作为果树枝条堆肥腐熟菌剂的可行性。本研究对推动芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺的发展及其在废弃果树枝条堆肥工程中的应用具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料芽孢杆菌腐熟菌剂：来源于山西农业大学农业环境与资源研究所，经检测为芽孢杆菌复合菌剂，由海内氏芽孢杆菌（Bacillus haynesii）、同温层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）和阿耶波多氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）组成，各菌株混合比例为111。种子培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。堆肥材料：废弃苹果枝条，取自万荣解店果园，枝条经风干后粉碎为粒径 1 mm 的颗粒备用。1.2试验设计1.2.1固体培养基组成筛选设置单因素试验，向麸皮固体培养基中分别加入不同辅料、碳源19、氮源20以及无机盐用于芽孢杆菌固态培养，接种菌剂 7 d 后进行有效菌落数测定。试验中以纯麸皮为培养基的处理为对照（CK），每个处理设 3 次重复。以麸皮为基础底物，辅料（添加量为 20%）分别设置有药渣（T1）、沼渣（T2）、玉米粉（T3）、高粱粉（T4）和谷子粉（T5）；碳源（添加量为 0.2%）分别设置有葡萄糖（B1）、麦芽糖（B2）、蔗糖（B3）、淀粉（B4）和乳糖（B5）；氮源（添加量为 0.2%）分别设置有蛋白胨（C1）、胰蛋白胨（C2）和酵母粉（C3）；无机盐（添加量为 0.010%）分别设置有氯化钙（D1）、硫酸锰（D2）、硫酸亚铁（D3）、磷酸氢二钾（D4）和硫酸镁（D5）。1.2.2固体培养基组成优化基于上述单因素试验确定的固体培养基最优组成，设置四因素三水平正交试验21（表 1），以发酵 7 d 后的有效菌落数为参考指标，确定芽孢杆菌固体发酵培养基中各组成的最佳用量。表 1正交试验因素与水平水平因素/%A 辅料B 碳源C 氮源D 无机盐1100.10.10.0052200.20.20.0103300.30.30.0151.2.3发酵条件优化在固体发酵培养基最优组成的基础上，对芽孢杆菌固态发酵过程中的接种量、固液比以及发酵温度设置三因素三水平正交试验（表 2），以发酵 7 d后的有效菌落数为参考指标，确定适用于芽孢杆菌发酵培养的最佳条件。表 2正交试验因素与水平水平因素A 接种量/%B 固液比C 温度/12010.828225113033011.2321.2.4腐熟菌剂促进果树枝条降解研究以风干并粉碎的颗粒状果树枝条（粒径 1 mm）为底物进行堆肥试验，枝条中添加 2.5%剂量芽孢杆菌腐熟菌剂的处理为试验处理，无菌剂添加的果树枝条为对照处理，2 个处理在相同的条件下进行堆肥试验，每个处理设 3 次重复。堆肥试验控制含水率为 60%，堆肥周期为 60 d，前 20 d 每隔 2 d 采样1 次，随后每 7 d 采样 1 次，对果树枝条堆肥过程中纤维素与木质素的降解率进行测定。64张家星，姚怡敏，闫敏，等：芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优化及促进果树枝条降解效果研究1.3测定仪器与方法试验主要设备有上海博讯牌立式压力蒸汽灭菌锅、THZ-C-1 型全温台式振荡器、HWS-380 型人工气候箱和 ANKOM 2000i 全自动纤维素分析仪。各处理有效菌落数的计算采用稀释涂布平板法。纤维素与木质素的含量基于酸碱液洗涤法测定，降解率的计算方法如下。纤维素降解率（%）（初始纤维素含量降解后纤维素含量）/初始纤维素含量100木质素降解率（%）（初始木质素含量降解后木质素含量）/初始木质素含量1001.4数据处理采用 Excel 2010 软件对试验数据进行基本计算与制图，采用 SPSS 21.0 软件对试验数据进行统计分析。2结果与分析2.1固体培养基组成筛选对于辅料的选择（图 1-A），麸皮固体培养基中以玉米粉（T3）为辅料的处理达到最高有效菌落数（321.06108cfu/g），与不添加辅料的处理（CK）相比提高了 112.57%。以沼渣（T2）或谷子粉（T5）为辅料的处理有效菌落数与 CK 相比分别提高33.38%和 40.98%，而以药渣（T1）和高粱粉（T4）为辅料的处理对菌落的繁殖没有显著影响，有效菌落数未实现有效提升。c b a c b c 0 100 200 300 400 500 T1T2T3T4T5CK菌落数/（108cfu/g）辅料aabcb0 100 200 300 400 500 B1B2B3B4B5菌落数/（108cfu/g）碳源bac0 100 200 300 400 500 C1C2C3菌落数/（108cfu/g）氮源b bc d c a 0 100 200 300 400 500 D1D2D3D4D5菌落数/（108cfu/g）无机盐ABCD注：图中不同小写字母表示处理间差异显著（P0.05）。图 1固体培养基组成对芽孢杆菌有效菌落数的影响在碳源的选择上（图 1-B），添加葡萄糖（B1）与麦芽糖（B2）更有利于目标菌种的繁殖，其中以葡萄糖为碳源的处理有效菌落数最高，达 353.33108cfu/g，其次是以蔗糖（B3）和乳糖（B5）为碳源的处理，而以分子量较大的可溶性淀粉（B4）为碳源的处理中菌落繁殖的效果最差，有效菌落数只有 202.44108cfu/g。在氮源的选择上也呈现出相似的规律（图1-C）。麸皮固体培养基中添加蛋白胨（C1）或胰蛋白胨（C2）为氮源时促进菌群繁殖的效果均显著高于分子量较大的酵母粉（C3），其中胰蛋白胨作为外源氮源时促进菌落繁殖的效果最好，有效菌落数达 230.43108cfu/g，比以蛋白胨和酵母粉为氮源的处理分别提高 18.35%和 116.30%。如图 1-D 所示，麸皮固体培养基中添加不同无机盐对菌落繁殖的影响存在显著差异。与其他处理相比，添加硫酸镁（D5）的处理有效菌落数最高，达 334.00108cfu/g，比添加其他无机盐的处理提高19.51%125.56%，添加硫酸亚铁（D3）的处理中有效菌落数最少，不利于目标菌种的繁殖。单因素试验结果表明，在芽孢杆菌菌剂的固态发酵中，麸皮固体培养基的最适组成有辅料玉米粉、碳源葡萄糖、氮源胰蛋白胨以及无机盐硫酸镁。2.2固体培养基组成优化芽孢杆菌腐熟菌剂固体培养基中各组分添加量的正交试验结果见表 3。各因素根据极差 R 值从65张家星，姚怡敏，闫敏，等：芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优化及促进果树枝条降解效果研究大到小排列依次为 B 葡萄糖、D 硫酸镁、A 玉米粉以及 C 胰蛋白胨，说明固体培养基中影响有效菌落数的因素从主到次排序为葡萄糖硫酸镁玉米粉胰蛋白胨。其中，有效菌落数随着玉米粉以及硫酸镁添加量的增加而增加，在玉米粉添加量为30%、硫酸镁添加量为 0.015%时，有效菌落数均可达到较高水平（K 值最大）。而葡萄糖添加量为0.2%、胰蛋白胨添加量为 0.1%时，也可达到相对较高的有效菌落数。因此，在麸皮固体培养基中添加30%玉米粉、0.2%葡萄糖、0.1%胰蛋白胨、0.015%硫酸镁时最有利于芽孢杆菌腐熟菌剂的培养。该条件对应的处理 T8 在本试验中得到了最高的有效菌落数，可以确认该组合为适用于芽孢杆菌腐熟菌剂的固体培养基最优组成。表 3固体培养基养分组成正交试验结果处理A 玉米粉/%B 葡萄糖/%C 胰蛋白胨/%D 硫酸镁/%菌落数/（108cfu/g）T1100.10.10.005249.33T2100.20.20.010304.67T3100.30.30.015283.33T4200.10.20.015289.33T5200.20.30.005284.00T6200.30.10.010241.33T7300.10.30.010382.00T8300.20.10.015846.67T9300.30.20.005219.33K1837.33920.671 337.33752.67K2814.671 435.33813.33928.00K31 448.00744.00949.331 419.33k1279.11306.89445.78250.89k2271.56478.44271.11309.33k3482.67248.00316.44473.11R633.33691.33524.00666.67影响因素BDAC2.3发酵条件优化发酵条件（接种量、固液比、发酵温度）对芽孢杆菌有效菌落数的影响如表 4 所示。结果显示，温度因素所对应的极差 R 值最大，接种量对应的极差最小，各因素按极差大小排序为温度固液比接种量，说明发酵条件中温度对有效菌落数的影响最大，其次是固液比，而接种量对菌落繁殖的影响最小。通过 K 值的比较可以发现，随着发酵温度从28 增加到 32，培养基中有效菌落数大体呈下降趋势，在温度为 28 时有效菌落数最高。而对于固液比，有效菌落数随着固液比的增加而增加，在固液比为 10.8 时达到较高水平。接种量对芽孢杆菌有效菌落数的影响则相对较小，在接种量为20%时达到较高的有效菌落数水平。试验结果表明，基于固体培养基的最优组成，培养基接种量为20%、固液比为 10.8、发酵温度为 28 的组合（处理 T1）可实现芽孢杆菌腐熟菌剂的高效培养。表 4发酵条件正交试验结果处理A 接种量/%B 固液比C 温度/菌落数/（108cfu/g）T12010.8281 150.00T2201132383.33T32011.230533.33T42510.832340.00T5251130370.00T62511.228556.67T73010.830563.33T8301128473.33T93011.232246.67K12 066.672 053.332 180.00K21 266.671 226.671 466.67K31 283.331 336.67970.00k1688.89684.44726.67k2422.22408.89488.89k3427.78445.56323.33R800.00826.671 210.00影响因素CBA2.4芽孢杆菌腐熟菌剂对果树枝条降解的影响经发酵所得的芽孢杆菌腐熟菌剂对果树枝条降解的影响如图 2 所示。添加芽孢杆菌腐熟菌剂可以明显提高废弃果树枝条堆肥进程中纤维素与木质素的降解效率。如图 2-A 所示，堆肥启动后，对照处理中纤维素的降解主要集中在前 20 d，堆肥结束后纤维素最终降解率为 19.58%。当果树枝条中添加 2.5%的芽孢杆菌腐熟菌剂进行堆肥时，纤维素的降解速度与效率均明显提升，当堆肥进行到第 20 d时纤维素的降解率从 17.56%提高到 42.12%，且随着堆肥的进行，纤维素降解率持续提高，在堆肥结束后纤维素降解率达 56.98%，比对照处理高出191.00%。以上结果说明，芽孢杆菌腐熟菌剂的使用可显著提高果树枝条堆肥过程中纤维素组分的降解速度与效率。与纤维素相比，堆肥过程中废弃果树枝条木质素的降解率较低且降解周期较短（图 2-B）。在未添加芽孢杆菌腐熟菌剂的对照处理中，木质素的降解66张家星，姚怡敏，闫敏，等：芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优化及促进果树枝条降解效果研究01020304050600102030405060纤维素降解率/%时间/d无菌剂添加的对照处理添加2.5%芽孢杆菌腐熟菌剂的处理A01020304050600102030405060木质素降解率/%时间/dB图 2芽孢杆菌腐熟菌剂对堆肥过程中果树枝条纤维素与木质素降解率的影响主要集中在堆肥启动后 15 d 内，其降解率在第 15 d时达 17.89%，在堆肥结束后木质素的降解率仅为21.43%。而在添加了 2.5%芽孢杆菌腐熟菌剂的堆肥处理中，枝条木质素的降解效率显著提升，在堆肥启动 15 d 后提高到 36.39%，堆肥结束后木质素的最终降解率达 44.35%，比对照处理高出 107.01%。以上结果证实，芽孢杆菌腐熟菌剂的添加在促进废弃果树枝条降解上切实有效，其促进纤维素降解的效果要明显优于木质素。3讨论与结论在芽孢杆菌固体培养基组成筛选中，玉米粉中淀粉、多糖、维生素以及矿物质等养分更为丰富，这或许是其促进芽孢杆菌繁殖效果最为显著的主要原因。葡萄糖属于单糖，分子量小，是微生物代谢的主要能量来源，可以直接被微生物利用，因此是促进芽孢杆菌繁殖的最优碳源。胰蛋白胨分子量较小且含有丰富的氨基酸，养分可利用率高，是促进芽孢杆菌增殖的最适氮源。无机盐具有平衡渗透压、促进微生物酶活性、提供矿物质养分等作用，对微生物的繁殖代谢具有重要影响22，其中硫酸镁中的镁元素可作为微生物生长的重要养分，参与碳水化合物的新陈代谢以及核酸的合成等。王晓洁等23也发现镁离子的添加可以促进侧孢短芽孢杆菌中抗菌肽的产生，证实镁离子是促进芽孢杆菌增殖与代谢的有效养分。在其他菌剂的固态发酵研究中，殷兆丽24发现固体培养基以麸皮和玉米粉为主要底物，添加氮源芝麻饼和菜籽粕、无机盐磷酸二氢钾和硫化镁可以有效促进酵母菌复合菌剂的培养效果。邓奥宇等25发现培养温度为 37、接种量为 8%的条件有利于木质素降解细菌 MZ-9 的培养。李文兵等26则发现内生芽孢杆菌 CK41 在温度为 37、接种量为 4%的条件下培养效果更好。而本研究中芽孢杆菌的固态发酵中，以麸皮为主要底物，添加 30%玉米粉、0.2%葡萄糖、0.1%胰蛋白胨、0.015%硫酸镁制成固体培养基，控制发酵条件中接种量为 20%、固液比为 10.8、发酵温度为 28 时最利于芽孢杆菌的培养。这说明不同微生物的生长代谢习性不同，因此最适发酵条件（培养基组成与发酵环境）也会存在明显差异。此外，本研究中经固态发酵后芽孢杆菌的有效菌落数最高达 1 150.00108cfu/g，比付冰妍等18用于促进园林废弃物降解的芽孢杆菌菌剂的固态发酵结果高出 4.06 倍，证实本研究中芽孢杆菌腐熟菌剂固态发酵工艺参数优化取得了较好的效果，这可能与固体培养基中更丰富的养分组成有关。在微生物菌剂促进纤维素与木质素降解研究方面，刘心吾等27发现，在玉米秸秆中添加木质纤维素降解菌 X-08 后，木质素和纤维素的降解率分别达 24.51%和 20.47%；杨文敏28通过对园林废弃物中添加 15.4%的黄孢原毛平革菌和康氏木霉复合菌后，将纤维素与木质素的最高降解效率分别提高到27.55%与 24.68%。而本研究中，在废弃果树枝条中添加 2.5%芽孢杆菌腐熟菌剂，将纤维素与木质素的降解率分别提高到 56.98%与 44.35%，促进物料降解的效果远好于其他菌种，说明该芽孢杆菌腐熟菌剂在促进果树枝条降解上切实有效。此外，添加芽孢杆菌腐熟菌剂后果树枝条纤维素的降解率要显著高于木质素，这也再次证实了木质素的降解难度要远高于纤维素29。本研究确定了适用于芽孢杆菌腐熟菌剂固态发酵的最优培养基组成与发酵条件，在麸皮固体培养基中添加 30%玉米粉、0.2%葡萄糖、0.1%胰蛋白胨、0.015%硫酸镁，控制培养基接种量为 20%、固液比为 10.8、发酵温度为 28 即可实现芽孢杆菌的高效培养。同时，该芽孢杆菌腐熟菌剂被证实是促进废弃果树枝条中纤维素与木质素降解的有效功能菌剂。67张家星，姚怡敏，闫敏，等：芽孢杆菌腐熟菌剂发酵工艺优化及促进果树枝条降解效果研究参考文献1 刘瑜，戚智勇，赵佳颖，等.我国城市园林废弃物及其资源化利用现状.再生资源与循环经济，2020，13（8）：38-44.2 曹刚，李红旭，赵明新，等.微生物菌剂浓度对梨树废弃枝条堆肥化处理的影响.甘肃农业科技，2017（12）：43-46.3 Kaur A,Katyal P.Microbial interventions for composting of organic andlignocellulose waste.Applied Biochemistry and Microbiology,2021,57(1):127-132.4 余韵，刘勇，烟亚萍，等.园林废弃物堆肥对楸树苗木生长和养分状况的影响.福建农林大学学报（自然科学版），2020，49（4）：492-497.5 郝丹，张璐，孙向阳，等.金盏菊栽培中园林废弃物堆肥与牛粪替代泥炭的效果分析.植物营养与肥料学报，2020，26（8）：1556-1564.6 陈芙蓉，曾光明，郁红艳，等.堆肥化中木质素的生物降解.微生物学杂志，2008，28（1）：88-93.7 Wang W X,Zhu Y S,Du J,et al.Influence of lignin addition on theenzymatic digestibility of 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