新生儿高苯丙氨酸血症筛查及PAH基因变异和缺失分析_马翠霞.pdf

98 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023新生儿高苯丙氨酸血症筛查及 PAH 基因变异和缺失分析马翠霞1 封露露1 马倩倩2 李 扬3 封纪珍11.石家庄市妇幼保健院遗传科（河北石家庄 050051）；2.石家庄市第四医院体检中心（河北石家庄 050000）；3.石家庄市妇幼保健院产前诊断科（河北石家庄 050051）摘要：目的 了解石家庄市新生儿高苯丙氨酸血症（HPA）的发病率、临床分型以及相关基因的变异特征。方法 选择2017年3月至2021年5月在石家庄市新生儿疾病筛查中心进行HPA筛查的487 380名新生儿，经免疫荧光法检测其足跟血苯丙氨酸浓度，采用基因测序技术对可疑阳性患儿苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因进行检测，患儿父母采用Sanger法进行目标基因变异验证，进一步将基因测序结果与正常人比对，找出片段缺失区域并进行分析。结 果 487 380名新生儿中筛查出阳性儿191例，确诊HPA 104例，均为PAH缺乏症，发病率为1/4686。104例患儿中共检测出62种基因变异，包括错义变异37种、剪接变异10种、无义变异7种、同义变异2种、整码变异1种以及杂合缺失5种。PAH基因常见的变异位点有c.158GA（18.7%）、c.728GA（10.5%）、c.611AG（6.7%）、c.331CT（4.8%）和c.721CT（4.8%），并发现未报道基因片段缺失（外显子6杂合缺失）及基因变异（c.630TG、c.61-1GA、c.912+5GT和c.1055+241CA）。结论 石家庄市HPA发病率较高，为1/4686；发现了62种PAH基因变异，包括5种片段缺失；此外发现5种未报道的基因变异，丰富了基因数据库。关键词：高苯丙氨酸血症；发病率；苯丙氨酸羟化酶；基因变异；新生儿 Screening of newborns with hyperphenylalaninemia and analysis of PAH gene mutation and deletion MA Cuixia1,Feng Lulu1,Ma Qianqian2,Li Yang3,Feng Jizhen1(1.Department of Heredity,Shijiazhuang Maternal And Child Health Care Hospital,Shijiazhuang 050051,Hebei,China;2.Medical Examination Center,The Fourth Hospital of Shijiazhuang,Shijiazhuang 050000,Hebei,China;3.Department of Prenatal Diagnosis,Shijiazhuang Maternal And Child Health Care Hospital,Shijiazhuang 050051,Hebei,China)Abstract:Objective To understand the incidence,clinical typing,and variant characteristics of related genes in neonates with hyperphenylalaninemia(HPA)in Shijiazhuang.Methods 487,380 newborns underwent HPA screening in Shijiazhuang Disease Screening and Diagnosis Center from March 2017 to May 2021 were selected.The phenylalanine concentration in heel blood samples was detected by immunofluorescence,the phenylalanine hydroxylase(PAH)related genes of suspected positive children were detected by gene sequencing,and the target gene variants were verified by the Sanger sequencing in the parents of the children,and the results of gene sequencing were further compared with the normal people to fragment deletion regions.Results Among the 487,380 neonates,191 were screened positive and 104 were diagnosed as HPA,all with PAH deficiency,with a prevalence of 1/4686.A total of 62 genetic variations were detected in 104 children,including 37 missense mutations,10 splice mutations,7 nonsense mutations,2 synonymous mutations,1 full code mutation and 5 heterozygous deletions.The most common variants of PAH gene are c.158GA(18.7%),c.728GA(10.5%),c.611AG(6.7%),c.331CT(4.8%)and c.721CT(4.8%),and unreported gene fragment deletions(exon 6 heterozygous deletion)and gene variants(c.630TG,c.61-1GA,c.912+5GA)were found.Conclusions The prevalence of HPA in Shijiazhuang was high at 1/4686;62 PAH gene variants,including 5 fragment deletions,were identified;in addition,5 unreported gene variants were found,which enriches the gene database.Key words:hyperphenylalaninemia;incidence rate;phenylalanine hydroxylase;gene mutation;newborndoi:10.12372/jcp.2023.21e1659 论 著 基金项目：河北省医学科学研究课题计划（No.20210689）通信作者：封纪珍 电子信箱： 99 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）主要是由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）或其辅酶四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏引起的常染色体隐性遗传病，为最常见的一种氨基酸代谢障碍性疾病1。HPA在不同地区、不同人群间发病率有很大不同，相关PAH基因的变异位点也有很大差异。本研究通过分析石家庄市新生儿HPA筛查及患儿基因检测结果，了解石家庄市新生儿HPA发病及基因变异情况，完善石家庄HPA患儿的基因突变谱，为进一步遗传咨询提供理论依据。1 对象与方法1.1 研究对象选择石家庄市新生儿疾病筛查中心负责的22个区县107所医疗机构2017年3月至2021年5月出生的新生儿495 740例。纳入标准：出生后320 d；充分哺乳（68次以上）后采集足跟血。排除标准：重复报告；数据不完整；死亡；失访。本研究获石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准（No.202036），研究对象监护人签署知情同意书。1.2 方法1.2.1 足跟血采集方法 75%乙醇消毒，使用一次性采血针刺于足跟内或外侧，深度8 mm的血斑，自然晾干，置48 保存，每周定期送至筛查中心，筛查中心收到样本后于5个工作日内进行检测并出具可疑结果。1.2.2 筛查方法及诊断标准 苯丙氨酸（Phe）测定采用免疫荧光法，试剂为芬兰Labsystems新生儿 Phe 浓度测定试剂盒，仪器为芬兰 Wallac 公司半自动VICTOR2D 1420 时间分辨荧光免疫分析仪。严格按照说明书进行检测。初筛及复查血Phe浓度2.0 mg/dL（120 mol/L）为阳性。筛查阳性者召回采血测定Phe浓度仍2.0 mg/dL，并且苯丙氨酸/酪氨酸（Phe/Tyr）2.0确诊为HPA；进行尿蝶呤谱分析以区分 PAH 缺乏症和 BH 4 缺乏症。患儿根据治疗前最高血 Phe 浓度分为经典型苯丙酮尿症（classic phenylketonuria，cPKU，Phe 1 200 mol/L）、轻度PKU（mild phenylketonuria，mPKU，360 mol/LPhe1 200 mol/L）和轻度高苯丙氨酸血症（mild hyperphenylalaninemia，MHP，120 mol/LPhe360 mol/L）。1.2.3 PAH基因检测 采用基因测序技术对患儿及其父母PAH基因进行检测。患儿及其父母静脉血用乙二胺四乙酸抗凝后严格按照说明提取DNA，并对提取物进行质检，后进行基因组文库构建。标记探针与文库DNA杂交，用磁珠结合探针以抓取目的基因，磁珠被磁力架吸附洗脱纯化，目的基因得以富集，进而进行高通量测序。所有数据进行单核苷酸序列多态性分析（single nucleotide polymorphisms，SNP），检测到的变异位点按照美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南进行致病性分析。未报道的新发变异使用MutationTaster、GERP+、SIFT、PolyPhen_2、REVEL等功能预测软件进行致病性预测。对发现的致病变异在其所在片段上、下游设计引物进行扩增及Sanger测序，进一步验证测序结果，采用Sanger法对患儿父母进行目标基因变异验证，基因测序相关工作由北京迈基诺医学检验所完成。1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数标准差表示，非正态分布的以中位数M（P25P75）表示。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用2检验。以PA（39/209，18.7%）、c.728GA（22/209，10.5%）、c.611AG（14/209，6.7%）、c.331C T（10/209，4.8%）、c.721CT（10/209，4.8%）、c.442-1GA（8/209，3.8%）、c.1068CA（7/209，3.3%）、c.1197AT（7/209，3.3%）。PAH基因变异位点分布不均匀，涵盖范围较广，主要在外显子7（40/209，19.1%）、外显子2（39/209，18.7%）、外显子3（23/209，11.0%）、外显子6（22/209，10.5%）、外显子11（22/209，10.5%）。104例HPA患儿中3例为杂合变异（2.9%），3例为纯合变异（2.9%），98例为复合杂合变异（94.2%）。62种变异位点中涉及6种变异类型，包括37个错义变异、10个剪接变异、7个无义变异、2个同义变异、1个整码变异、5个杂合变异。在MHP患儿中最常见的变异位点有c.158GA（37/209，17.7%）、c.728GA（8/209，3.8%）、c.611AG（8/209，3.8%）、c.320AG（5/209，2.4%）；mPKU患儿中最常见的变异位点有c.721C T（9/209，4.3%）、c.728GA（7/209，3.4%）、c.611A G（4/209，1.9%）；cPKU患儿中最常见的变异位点有c.728GA（7/209，3.45%）、c.331CT（6/209，2.9%）、c.1068CA（5/209，2.4%）、c.442-1G A（4/209，1.9%）。2.3 PAH基因片段缺失及未报道基因变异情况石家庄市新生儿HPA患儿中发现5种杂合缺失，分别位于外显子1及上游区域、内含子1、内含子3、外显子45、外显子6，片段缺失分析结果见图1。经HGMD文献数据库检索外显子6杂合缺失未有与PAH相关的报道。表1 487 380例新生儿HPA筛查情况及临床表型性别例数阳性例数确诊类型发病率MHPmPKUcPKU合计男252 521102311113551/4591女234 8598930127491/4793合计487 3801916123201041/468617C037437A19C010404B19C159535C17C046689D20C237842EA.外显子1及上游区域杂合缺失；B.内含子1杂合缺失；C.内含子3杂合缺失；D.外显子45杂合缺失；E.外显子6杂合缺失（HGMD文献数据库检索未报道缺失）图 1 HPA 患儿 PAH 基因缺失重复分析结果基因变异位点 c.630 TG、c.61-1 GA、c.912+5GT和c.1055+241CA经HGMD文献 101 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023数据库检索未有相关报道，ClinVar数据库无该位点致病性结果分析。1例患儿同时携带c.630TG与c.61-1GA两个位点，临床表型为MHP，这两个位点蛋白功能预测软件预测为有害、未知，ACMG致病性分析为临床意义未明、疑似致病性变异。c.912+5GT蛋白功能预测软件为未知，ACMG致病性分析为临床意义未明，该患儿临床表型为mPKU。c.1055+241CA蛋白功能预测软件为未知，ACMG致病性分析为临床意义未明，该患儿临床表型为MHP。见图2。递质多巴胺和5-羟色胺合成障碍，损害神经系统。HPA根据病因分为PAH缺乏症和BH4缺乏症，在我国85%90%为PAH缺乏症3。HPA 在不同的国家和地区发病率有很大差异，有资料显示，欧洲不同国家 HPA 的发病率为1/3000 1/30000 4，在亚洲国家中泰国较低为1/3277405。我国HPA发病率在南、北方地区有所不 同，南方地区发病率在1/819761/10567之间6-7，北方地区在1/54521/3495之间8-9。石家庄市发病率为 1/4686，明显高于南方地区，与北方地区一致，符合 HPA 南低北高的特点。本研究 HPA患儿基因变异以错义变异为主，发生率较高的位 点为c.158GA（p.R53H）、c.728GA（p.R243Q）与c.611AG（p.Y204C），与一些学者研究结果一 致5,10-11，青岛、陕西与本地区略有差异12-13。青岛c.611AG（p.Y204C）发生频率较低，陕西c.728GA（p.R243Q）与c.721CT（p.R241C）发生频率最高，甘肃c.1068CA与c.1238GC发生频率较高。本组携带 c.158 GA（p.R 53 H）变异位点的39例患儿中37例临床表型为MHP（1例患儿携带3个变异位点，其中2个为c.158GA），1例患儿为mPKU，1例为cPKU。这与相关研究的结论，即c.158GA（p.R53H）变异对PAH酶活性影响较低一致11。1例cPKU患儿所携带的位点为c.158GA、c.194TC和c.842+2TA，预测这3个位点的复合作用对PAH酶活性的影响较大。携带c.728GA（p.R 243 Q）变异的 21 例患儿中 8 例临床表型为MHP，7例为mPKU，6例为cPKU患儿（1例患儿携带2个c.728GA变异位点，为纯合变异）。相关研究显示c.728GA（p.R243Q）变异对酶活性影响较大14，而本研究中携带该变异的患儿临床表型与此结论略有差异。携带c.611AG（p.Y204C）变异的14例患儿中8例临床表型为MHP，4例为mPKU，2例为cPKU。有研究显示c.611AG（p.Y204C）变异对PAH酶活性影响不大15，2例cPKU患儿携带的变异位点分别为c.611AG和c.331CT、c.611AG和c.1068CA，考虑c.331CT与c.1068CA这两种变异可能对PAH酶活性的影响作用较大。本研究中变异位点导致的不同临床表型与其他研究结果较A.c.630TG错义变异；B.c.61-1GA剪接变异；C.c.912+5GT剪接变异；D.c.1055+241CA剪接变异图 2 HPA 患儿 HGMD 文献数据库未报道基因测序图ABCD3 讨论食物中蛋白质分解形成的Phe在正常状态下由肝脏PAH作用转变为Tyr，如果PAH缺乏会导致血中Phe含量升高，通过血脑屏障在脑部蓄积，进而导致神经系统损害2。BH4是Phe、Tyr代谢过程中的辅酶，BH4还原酶缺乏也会导致HPA，引起神经 102 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023为一致6。中国人群PAH缺乏症患者携带包括点变异和片段缺失的多种基因变异。石家庄市新生儿HPA患儿中变异频率最高的区域是外显子7，而河南地区为外显子616。本组5种片段缺失中外显子6杂合缺失在HGMD数据库未有PAH基因相关性的报道，该患儿携带的另外1个位点为c.611AG，临床表型为mPKU，与前期研究中变异c.611AG（p.Y204C）对 PAH 酶活性影响情况一致 23。HGMD 数据库中未报道的基因变异为c.630TG、c.61-1GA、c.912+5GT和c.1055+241CA，其中c.630TG与c.61-1GA存在于同一例患儿，该患儿临床表型为MHP。携带c.912+5GT变异的患儿，另1个变异为外显子45片段缺失，临床表型为mPKU；携带c.1055+241CA变异的患儿，另1个变异为c.721CT，临床表型为MHP。本研究显示，石家庄 HPA 患儿基因变异以错义变异为主，发生率较高的位点为 c.158 GA、c.728GA和c.611AG，分布区域以外显子7为主。本研究明确了石家庄市HPA患儿基因变异的类型和特点，发现外显子6杂合缺失以及c.630TG、c.61-1GA、c.912+5GT和c.1055+241CA 5个变异在HGMD数据库无相关报道，丰富和完善了石家庄市HPA患儿的基因变异图谱，为患儿家庭进行遗传咨询和产前诊断提供了重要的补充资料。参考文献：1 中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组,中华预防医学会出生缺陷预防与控制专业委员会新生儿筛查学组.高苯丙氨酸血症的诊治共识 J.中华儿科杂志,2014,52(6):420-423.2 顾学范,叶军.新生儿疾病筛查 M.上海:上海科学技术文献出版社,2003:138-1663 叶军,邱文娟,韩连书,等.新生儿筛查诊断的 223 例高苯丙氨酸血症的诊治及随访 J.中华预防医学杂志,2007,41(3):189-192.4 Loeber JG.Neonatal screening in Europe;the situation in 2004 J.J Inherit Metab Dis,2007,30(4):430-438.5 Pangkanon S,Charoensiriwatana W,Janejai N,et al.Detection of phenylketonuria by the newborn screening program in Thailand J.Southeast Asian J Trop Med Public Health,2009,40(3):525-529.6 赵振东,黄慈丹,许海珠,等.海南省 380 996 名新生儿苯丙酮尿症筛查及苯丙氨酸羟化酶基因分析 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