新城疫病毒Mukteswar株反向遗传平台的建立_魏家阳.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):3 0-3 5P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e新城疫病毒M u k t e s w a r株反向遗传平台的建立 收稿日期:2 0 2 2-0 1-1 4 基金项目:国家自然科学基金项目(3 1 8 7 3 0 1 8);国家现代农业产业技术体系建设专项资金(C A R S-4 1-G 1 3);湖北省自然科学基金重点类项目(2 0 2 1 C F A 0 1 9);湖北省科技创新项目重大专项(2 0 2 0 A B A 0 1 6);湖北省农业科技创新中心重大科技研发(2 0 2 0-6 2 0-0 0 0-0 0 2-0 1)作者简介:魏家阳(1 9 9 6-),女,湖南长沙人,硕士,主要从事新城疫病毒分子生物学研究。*通讯作者魏家阳1,2,李 丽2,王国康2,徐英英2,曾 哲2,罗青平2,邵华斌2,温国元2,商 雨2*,潘兹书1*(1.武汉大学生命科学学院,湖北武汉4 3 0 0 7 2;2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室,畜禽病原微生物学湖北重点实验室,湖北武汉4 3 0 0 6 4)摘 要:为了建立新城疫疫苗株M u k t e s w a r株的反向遗传操作系统,根据M u k t e s w a r株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过O v e r l a pP C R和I n-F u s i o n无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至p A C N R-T 7中,获得了M u k t e s w a r株全长c D NA克隆质粒p A C-M u k t e s w a r。将其和3个辅助质粒(p VA X-N P、p VA X-P和p c D NA-L)共转染至预先感染了痘病毒v T F 7-3的B HK-2 1细胞,成功拯救出重组病毒r M u k t e s w a r。对r M u k t e s w a r的生长曲线、最小致死剂量的平均致死时间(MD T)等生物学特性进行测定,结果显示r M u k t e s w a r具有和野生株相似的增殖特性和毒力。成功建立了新城疫疫苗株M u k t e s w a r的反向遗传操作系统,为研发高效率表达外源病原体蛋白的新城疫载体疫苗奠定了基础。关键词:新城疫病毒;M u k t e s w a r株;反向遗传操作系统中图分类号:S 8 5 2.6 5 9.5文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 3 0-0 6 新城疫病毒(N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s,N D V)是一种以禽类作为宿主的R NA病毒,其基因组为单股、负链、不分节段的R NA1。N D V按照毒力可以分为强毒株、中等毒力毒株和弱毒株。弱毒力毒株可在家禽体内有限复制,并能刺激系统免疫反应,可开发为活疫苗应用于新城疫的防控。随着反向遗传学技术的发展,体外操作N D V的基因组很容易实现,N D V被开发成载体应用于基因工程疫苗的研究。以N D V为载体开发基因工程疫苗有很多优势:安全性高,N D V在宿主的细胞质内复制,且病毒的生活周期中不会出现D NA,因此,病毒的基因组与宿主基因组重组的概率极低;生产成本低,N D V可在鸡胚内增殖很高的滴度;免疫方式多样,可以采用滴鼻、点眼、喷雾和饮水等多种方式免疫;免疫保护效果好,N D V可以刺激机体产生多种免疫反应,包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫;遗传稳定性好,多个研究表明外源基因的插入不影响N D V的稳定性,而且多代次传代后的病毒能很好地表达外源基因。因此,在N D V反向遗传学平台被建立以来,大量的基因工程疫苗被研究和评估2-3。另外,由于N D V具有严格的宿主限制性,能够进入大多数哺乳动物细胞(包括人类细胞)以及肿瘤细胞,但不能在细胞内复制,同时哺乳动物(包括人类)不存在针对N D V的预先免疫,因此,N D V可应用于预防哺乳动物传染病或治疗人类的相关疾病4。常用于疫苗载体的N D V包含L a S o t a、C l o n e-3 0和T S 0 9-C等弱毒株5-7。以N D V中等毒力毒株B C株和弱毒株L a S o t a株为载体,构建表达人副流感病 毒3型(H u m a np a r a i n f l u e n z av i r u st y p e3,H P I V 3)HN蛋白的重组新城疫病毒N D V-B C/HN和N D V-L S/HN;感染D F-1细胞2 4h,其中N D V-B C/HN的H P I V 3 HN mR NA表达水平明显高于N D V-L S/HN或野生型H P I V 3;动物试验结果显示,N D V-B C/HN免疫效果较好,诱导产生的抗体水平高于N D V-L S/HN组8。以上结果表明,中等毒力的N D V为载体构建的重组N D V可以快速和高效表达外源蛋白,刺激机体产生较强的免疫反应。另外,随着外源基因的插入,病毒基因组的增大,病毒的复制效率降低,以弱毒株为载体的重组病毒感染能力进一步下降,从而影响到免疫效果9。因此,为了提高N D V载体疫苗的免疫效果,可以尝试更多以中等毒力N D V为基础的载体疫苗的研发。本研究以N D V M u k t e s w a r中等毒力株为研究对象,构建了该毒株的反向遗传学操作平台并拯救DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.026出了M u k t e s w a r株病毒,对该病毒的生物学特性进行了测定。N D V M u k t e s w a r株反向遗传学平台的建立,可为研制高效表达外源病原体免疫蛋白的新城疫载体疫苗奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 病毒基因组提取试剂盒,A x y g e n公司产品;2P h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y eP l u s)、2 R a p i dT a qM a s t e rM i x、反转录试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品;D p nI、I n-F u s i o nHDC l o n i n gK i t,宝生物工程(大连)有限公司产品;胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒,美国Om e g a公司产品;无 内 毒 素 质 粒 提 取 试 剂 盒、胎 牛 血 清 和DMEM培养基,赛默飞世尔生物化学制品有限公司产品;F I T C标记的羊抗鸡I g G抗体,北京博奥森生物技术有限公司产品。1.1.2 仪器设备 P C R仪,美国T h e r m oF i s h e r公司产品;凝胶成像系统,上海勤翔科学仪器有限公司产品;隔水式电热恒温培养箱,武汉市方正仪器设备有限公司产品;鸡胚孵化机,山东德州利民孵化机研制中心产品;C O2培养箱,美国S HE L-L A B公司产品;倒置荧光显微镜,日本O l y m p u s公司产品。1.1.3 细胞、病毒和质粒、鸡胚 大肠 埃希氏菌DH 5 感受态细胞,宝生物工程(大连)有限公司产品;B HK-2 1细胞、重组牛痘病毒(v T F 7-3)、N D V-M u k t e s w a r株尿囊液、p A C N R-T 7载体,辅助质粒p c D NA-L、p VA X-N P、p VA X-P质粒,由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室构建并保存;S P F鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 N D V M u k t e s w a r株基因组的提取和c D NA的制备 取2 0 0L N D V M u k t e s w a r株病毒尿囊液,按照病毒基因组提取试剂盒说明书进行病毒R NA提取,提取的R NA用3 0L无R NA酶水洗脱。再按照反转录试剂盒说明书的步骤,将R NA反转录成c D NA,冻存于-8 0备用。1.2.2 N D V M u k t e s w a r株全长c D NA克隆的构建 以N C B I上公布的N D V M u k t e s w a r株的序列(G e n B a n k登录号为:J F 9 5 0 5 0 9.1)为参考,设计9对引物(A 1-F&A 1-RA 9-F&A 9-R)(表1),相邻的扩增片段间设计有3 0b p5 0b p的重叠序列,第1个片段的上游引物和第9个片段的下游引物带有1 5 b p的载体锚定序列。以M u k t e s w a r株c D NA为模板,扩增9个小片段A 1-A 9,以A 1、A 2和A 3的P C R回收产物为模板,A 1-F和A 3-R为引物,通过O v e r l a pP C R的方法获取融合片段B 1,融合片段B 2和B 3以相同的方法获得。另设计了一对引物(V-T 7 F,V-T 7 R)用于载体线性化。首先通过I n-F u s i o n无缝克隆的方式,将融合片段克隆至p A C N R-T 7中,获得质粒p A C N R-B 1,经酶切鉴定和测序正确后,依次将融合片段B 2和B 3插入载体质粒中,最终获得全长克隆c D N A质粒p A C-M u k t e s w a r(图1)。图1 N D VM u k t e s w a r株感染性克隆的构建策略F i g.1 C o n s t r u c t i o ns t r a t e g yo f i n f e c t i o u sc l o n eo fN D VM u k t e s w a r s t r a i n表1 构建过程中所用的引物T a b l e1 P r i m e r s f o r c o n s t r u c t i o n引物名称P r i m e rn a m e引物序列5 -3 P r i m e r s e q u e n c eV-T 7 Fg g g t c g g c a t g g c a t c t cV-T 7 Rc c t a t a g t g a g t c g t a t t a c g c g gA 1-Fa c g a c t c a c t a t a g ga c c a a a c a g a g a a t c c g t g a g a t a c gA 1-Ra g g t t a c a g g c a g a a g a a t c g a g a t g aA2-Fa a t c a t c t c g a t t c t t c t g c c t g t a a cA2-Rg a g g c g g g a g a a g g t t a t c g c t tA3-Fg c g a t a a c c t t c t c c c g c c t c tA3-Ra g a g a a c t t g t c a g a c g g a c a t a a c t cA4-Fc t g a g t t a t g t c c g t c t g a c a a g t t c tA4-Rc t t t t g t t c a c c t a c a t c c g g t a g t t t t t tA5-Fa g a a a a a a c t a c c g g a t g t a g g t g a a c aA5-Rg t a a g g g g a c a a t t c t g a a t t c c c c gA6-Fc g g g g a a t t c a g a a t t g t c c c c t t aA6-Rt g c t c a g a t t g g t g a c a g g g t c a tA7-Fa a t a t g a c c c t g t c a c c a a t c t g a g c a t g t t t t t a a a a g a c a a g g cA7-Rc t t a a t c a c g g t g t t t g t t g t g t c a a c a a g c c c c t g a aA8-Fc t t g t t g a c a c a a c a a a c a c c g t g a t t a a g a t t g c a c t gA8-Rc c t c t c t c t c c c t g a t c a a a t t a a g g c t c t t c c t a g a c a t g tA9-Fa g a g c c t t a a t t t g a t c a g g g a g a g a g a g g a c a g g g aA9-Ra t g c c a t g c c g a c c ca c c a a a c a a a g a t t t g g t g a a t g a c a t g a c1.2.3 M u k t e s w a r株病毒的拯救 将生长状态良好的B HK-2 1细胞传代至6孔板中,待细胞密度达到8 0%9 0%时,感染0.0 1 MO I的表达T 7R NA聚合酶重组牛痘病毒。感染2h后,将p A C-M u k-t e s w a r质粒与3个辅助质粒(p VA X-N P、p VA X-P和p c D NA-L)按照质量比例4112共转染13魏家阳等:新城疫病毒M u k t e s w a r株反向遗传平台的建立B HK-2 1细胞,转染6h后,P B S洗涤细胞2次,加入含有0.0 1g/m L双抗和0.2g/m LT P C K-胰酶的DMEM培养基继续培养9 6h1 2 0h,收获细胞培养物,反复冻融3次,用0.2 2m孔径的滤器过滤,接种9日龄1 0日龄S P F鸡胚,每枚2 0 0L,培养4d 5d,收集鸡胚尿囊液。测定其血凝(H e m a g-g l u t i n i n,HA)效价,对HA阳性样品进行R T-P C R检测及测序鉴定。鉴定正确的病毒尿囊液命名为r M u k t e s w a r。在S P F鸡胚上传3代后,分装保存于-8 0。1.2.4 间接免疫荧光检测 将B HK-2 1细胞传至9 6孔板,待细胞密度达到约8 0%时,接种病毒尿囊液。感染7 2h后弃去培养基,用P B S洗涤3次,以4 0m L/L多聚甲醛固定细胞3 0m i n;用P B S洗涤3次,5m L/LT r i t o nX-1 0 0(P B S配置)处理室温2 0m i n,P B S洗3次;用3 0g/LB S A封闭细胞1h,封闭后用P B S洗3次;以N D V阳性血清为一抗,以F I T C标记的羊抗鸡I g G抗体为二抗进行间接免疫荧光试验,荧光显微镜下观察结果。1.2.5 病毒生物学特性的鉴定 1.2.5.1 鸡胚半数感染量(E I D5 0)将r M u k t e s w a r和野生M u k t e s w a r株病毒尿囊液进行1 0倍梯度稀释,1 0-61 0-9稀释度分别接种3枚9日龄S P F鸡胚,每枚0.1m L,培养4d,收集鸡胚尿囊液。测定其血凝效价。记录结果,根据R e e d-M a e n c h方法计算病毒的E I D5 0。1.2.5.2 5 0%细胞感染量(T C I D5 0)将重组r M u k-t e s w a r和野生M u k t e s w a r株病毒尿囊液进行1 0倍梯度稀释,每个稀释度 接种B HK-2 1细 胞(9 6孔板),设置3个重复孔,0.1m L/每孔。3 7、体积分数为5%C O2培养箱培养1 2 0h后,通过间接免疫荧光试验判定病毒感染情况,记录结果,根据R e e d-M a e n c h方法计算病毒的滴度。1.2.5.3 生长曲线 将重组r M u k t e s w a r和野生M u k-t e s w a r株以0.0 1MO I接种于铺有B HK-2 1细胞的1 2孔板中,于感染后1 2、2 4、3 6、4 8、6 0、7 2、8 4、9 6h收取细胞培养上清,测定其T C I D5 0,绘制病毒的生长曲线。1.2.5.4 最小致死剂量的平均致死时间(MD T)将病毒 液进行1 0倍梯度稀释,1 0-7、1 0-8、1 0-9、1 0-1 0、1 0-1 1共5个稀释度各接种5枚9日龄鸡胚,0.1m L/枚。3 7培养,连续观察7d,记录各个鸡胚的死亡时间。7d后,将所有活胚冷却,检测HA效价,HA大于27判定为阳性,否则判定为阴性。按照公式计算最小致死量的平均致死时间。MDT=(在x小时死亡胚数)x小时+(在y小时死亡胚数)y小时/死亡总胚数1.2.5.5 1日龄雏鸡的脑内致病指数(I C P I)将重组r M u k t e s w a r和野生M u k t e s w a r株病毒尿囊液用灭菌生理盐水稀释,分别以颅内接种的方式接种1 0只1日龄S P F雏鸡,每只5 0L。另取1 0只接种5 0L灭菌生理盐水作为对照,每天观察记录鸡群健康情况,并对试验鸡进行评定:正常的记0分,发病的记1分,死亡的记2分,连续观察8d,最后按公式求出I C P I。I C P I=8d累计发病数1+8d累计死亡鸡数28d累计观察鸡的总数2 结果2.1 N D V M u k t e s w a r株全长质粒的构建与鉴定通过R T-P C R获得M u k t e s w a r株基因组的9个片段(图2),用重叠P C R获得3个融合片段B 1、B 2、B 3(图3)。用I n-F u s i o n克隆方式,将3个融合片段依次克隆至p A C N R-T 7载体质粒中,获得全长质粒p A C-M u k t e s w a r,用限制性内切酶H i nd进行酶切鉴定(图4),酶切条带与预期大小1 17 9 7b p、38 5 7b p和21 6 2b p相符。将酶切鉴定结果正确的质粒送往公司测序,结果序列正确,证明全长质粒p A C-M u k t e s w a r构建成功。2.2 r M u k t e s w a r株全长质粒的拯救与鉴定将构建成功的M u k t e s w a r株全长质粒p A C-M u k t e s w a r与实验室构建保存的辅助质粒p VA X-N P、p VA X-P和p c D NA-L共转染至B HK-2 1细胞,培养4d后,反复冻融3次,接种9日龄S P F鸡胚,培养4d5d,选择HA阳性的尿囊液进行病毒R NA的提取,R T-P C R检测及测序分析均与预期相符,表明r M u k t e s w a r拯救成功。将鉴定正确的病毒感染B HK-2 1细胞后,利用间接免疫荧光检测病毒(图5),感染病毒的B HK-2 1细胞可以观察到绿色荧光,对照组未检测到荧光信号。2.3 r M u k t e s w a r株病毒的生物学特性为了比较r M u k t e s w a r株病毒与野毒株的生物学特性与毒力差异,对两株病毒的鸡胚增殖滴度、细胞生 长 曲 线 和 毒 力 进 行 检 测。结 果 显 示r M u k-t e s w a r株病毒在鸡胚中增殖的病毒含量为1 09.6 3E I D5 0/m L(表2),感染B HK-2 1细胞后在7 2h达到平台期,滴度为1 07.6 3T C I D5 0/m L(图6),与野毒株的增殖特性相似。毒力指标检测结果显示r M u k-t e s w a r株的MD T为5 6h,略大于野毒株,I C P I为1.4 2,符合中等毒力的特征。23动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)M.D NA标准D L20 0 0;19.M u k t e s w a r株基因组片段M.D NA M a r k e rD L20 0 0;1-9.F r a g m e n t so fM u k t e s w a r s t r a i ng e n o m e图2 M u k t e s w a r株基因组9个小片段扩增结果F i g.2 Am p l i f i c a t i o nr e s u l t so f 9f r a g m e n t so fM u k t e s w a r s t r a i ng e n o m eM.D NA标准D L50 0 0;13.融合片段B 1B 3M.D NA M a r k e rD L50 0 0;1-3.F u s i o nf r a g m e n t so fB 1-B 3图3 融合片段扩增结果F i g.3 Am p l i f i c a t i o nr e s u l t so f f u s i o nf r a g m e n t sM.D NA标准D L1 50 0 0;12.p A C-M u k t e s w a r质粒M.D NA M a r k e rD L 1 50 0 0;1-2.p A C-M u k t e s w a rp l a s m i d图4 p A C-M u k t e s w a rH i nd酶切鉴定F i g.4 I d e n t i f i c a t i o no fp A C-M u k t e s w a rb yH i ndA.r M u k t e s w a r感染的B HK-2 1细胞;B.阴性对照A.B HK-2 1c e l l si n f e c t e dw i t hr M u k t e s w a rs t r a i n;B.N e g a t i v ec o n-t r o l图5 r M u k t e s w a r株感染B HK-2 1细胞的间接免疫荧光检测结果(2 0 0)F i g.5 I n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nr e s u l t so fB HK-2 1c e l l s i n f e c t e dw i t hr M u k t e s w a r s t r a i n表2 r M u k t e s w a r株病毒的特性与毒力指标T a b l e2 C h a r a c t e r i s t i c sa n dv i r u l e n c e i n d e x e so f r M u k t e s w a r s t r a i n毒株V i r u ss t r a i nE I D5 0/m LT C I D5 0/m LMD T/hI C P Ir M u k t e s w a r1 09.6 31 07.6 35 61.4 2M u k t e s w a r1 09.6 81 07.2 04 6.41.4 4图6 r M u k t e s w a r株在B HK-2 1细胞的生长曲线F i g.6 G r o w t hc u r v eo f r M u k t e s w a r s t r a i n i nB HK-2 1c e l l s3 讨论N D V作为一种安全高效的病毒载体,可开发成用于动物疫病防控的多联多价基因工程疫苗。目前应用于载体开发的N D V多为弱毒力毒株,如L a S o-t a、T S 0 9-C等。由于外源基因的插入,病毒基因组的增大,在感染细胞内基因组的复制效率降低。以弱毒株为载体表达外源基因,将导致病毒的毒力会进一步降低,最终影响免疫效果。另外,N D V特异性母源抗体(m a t e r n a l d e r i v e da n t i b o d y,MD A)的存33魏家阳等:新城疫病毒M u k t e s w a r株反向遗传平台的建立在会降低新城疫载体疫苗的效力,研究表明,新城疫疫苗对含有MD A的商业鸡的免疫效果较差1 0。为了克服病毒毒力下降和MD A干扰导致的免疫效果不佳的问题,学者们探索了不同的解决方案,包括构建嵌合病毒、增加免疫剂量、多次免疫、利用细胞因子刺激恢复B细胞的免疫应答,或者使用复制能力更强的疫苗株1 1-1 2。N D V中等毒力毒株复制能力较强,可引起禽类全身感染,通常比低毒力毒株具有更强的免疫原性1 3。本研究以N D V中等毒力株M u k t e s w a r株作为研究对象,构建其反向遗传操作平台,将为后续开发更高效的基因工程疫苗奠定基础。M u k t e s w a r株作为中等毒力活疫苗,在国内广泛应用,可在接种后3d内迅速产生保护作用,并可维持1年以上的免疫保护1 4,表明M u k t e s w a r株是开发基因工程疫苗的理想载体。本研究首先构建r M u k t e s w a r株 的 基 因 组c D NA克 隆p A C-M u k-t e s w a r,并将其与3个辅助质粒共转染到预感染v T F 7-3的B HK-2 1细胞,成功获得子代重组病毒r M u k t e s w a r。重 组 病 毒r M u k t e s w a r株 与 亲 本M u k t e s w a r株具有相似的粒径大小、形态结构、鸡胚增殖滴度和生长曲线。MD T和I C P I测定结果表明重组病毒r M u k t e s w a r株与亲本M u k t e s w a r株对鸡胚和雏鸡的致病性无显著差异,且均属于中等毒力毒株的范畴。综上所述,本研究利用反向遗传操作技术建立了新城疫中等毒力疫苗株M u k t e s w a r的反向操作系统,后期可将r M u k t e s w a r株开发为减毒活疫苗以及表达外源病原体免疫原性蛋白的疫苗载体,以期获得外源蛋白高效率的表达系统,提高N D V载体疫苗的免疫原性和保护效果,为安全高效的N D V载体疫苗的研发和广泛应用提供支撑。参考文献:1 K I M S H,S AMA LS.I n n o v a t i o ni n N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u sv e c t o r e da v i a ni n f l u e n z av a c c i n e sJ.V i r u s e s,2 0 1 9,1 1(3):3 0 0.2 NA TH B,VAN D NA,S A I N IH M,e ta l.E v a l u a t i o no fJ a p a-n e s ee n c e p h a l i t i sv i r u sEa n dN S 1p r o t e i n s i mm u n o g e n i c i t yu-s i n gar e c o m b i n a n tN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u si nm i c eJ.V a c-c i n e,2 0 2 0,3 8(7):1 8 6 0-1 8 6 8.3 YU Q,L IY,D I M I T R OV K,e ta l.G e n e t i cs t a b i l i t yo faN e w-c a s t l ed i s e a s ev i r u sv e c t o r e di n f e c t i o u sl a r y n g o t r a c h e i t i sv i r u sv a c c i n ea f t e r s e r i a l p a s s a g e s i nc h i c k e ne m b r y o s-S c i e n c ed i r e c tJ.V a c c i n e,2 0 2 0,3 8(4):9 2 5-9 3 2.4 S UN W N.N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s(N D V)e x p r e s s i n gt h es p i k ep r o t e i no fS A R S-C o V-2a sa l i v ev i r u sv a c c i n ec a n d i d a t eJ.B i oM e d,2 0 2 0,6 2(7 8 3 0):1 0 3 1 3 2.5 Z HAO W,Z HAN GP,B A IS.e ta l.H e t e r o l o g o u sp r i m e-b o o s tr e g i m e n sw i t h HA d V-5a n dN D Vv e c t o r se l i c i ts t r o n g e ri m-m u n er e s p o n s e st oE b o l av i r u st h a nh o m o l o g o u sr e g i m e n si nm i c eJ.A r c hV i r o l,2 0 2 1,1 6 6(1 2),3 3 3 3-3 3 4 1.6 MUR R M,G RUN DC,B R E I THAU P T A,e ta l.P r o t e c t i o no fc h i c k e n sw i t hm a t e r n a l i mm u n i t ya g a i n s t a v i a n i n f l u e n z av i r u s(A I V)b yv a c c i n a t i o nw i t han o v e l r e c o m b i n a n tN e w c a s t l e d i s-e a s ev i r u sv e c t o rJ.A v i a nD i s,2 0 2 0,6 4(4):4 2 7-4 3 6.7 XUL,Q I NZ,Q I AOL,e ta l.C h a r a c t e r i z a t i o no f t h e r m o s t a b l eN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u sr e c o m b i n a n t se x p r e s s i n gt h eh e m a g-g l u t i n i no fH 5 N 1a v i a n i n f l u e n z av i r u s a sb i v a l e n t v a c c i n e c a n-d i d a t e sJ.V a c c i n e,2 0 2 0,3 8(7):1 6 9 0-1 6 9 9.8 HUAN GZ,MUR P HYBR.R e c o m b i n a n t n e w c a s t l ed i s e a s ev i-r u se x p r e s s i n ga f o r e i g nv i r a l a n t i g e ni sa t t e n u a t e da n dh i g h l yi mm u n o g e n i c i np r i m a t e sJ.JV i r o l,2 0 0 5,7 9(2 1):1 3 2 7 5-1 3 2 8 4.9 K R I S HNAMUR THYS,HUAN GZ,S AMA LSK.R e c o v e r yo f av i r u l e n t s t r a i no fN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s f r o mc l o n e dc D-NA:E x p r e s s i o no f a f o r e i g ng e n e r e s u l t s i ng r o w t hr e t a r d a t i o na n da t t e n u a t i o nJ.V i r o l o g y,2 0 0 0,2 7 8(1):1 6 8-1 8 2.1 0 D I M I T R OVKM,T AY L O RTL,MA R C ANOVC,e t a l.N o-v e l r e c o m b i n a n tN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s-b a s e d i no v ov a c c i n e sb y p a s sm a t e r n a l i mm u n i t y t op r o v i d e f u l l p r o t e c t i o n f r o me a r-l yv i r u l e n t c h a l l e n g eJ.V a c c i n e s(B a s e l),2 0 2 1,9(1 0):1 1 8 9.1 1 S T E G L I CHC,G RUN DC,R AMPK,e t a l.C h i m e r i cN e w c a s-t l ed i s e a s ev i r u sp r o t e c t sc h i c k e n sa g a i n s ta v i a ni n f l u e n z ai nt h ep r e s e n c eo fm a t e r n a l l yd e r i v e dN D Vi mm u n i t yJ.P L o SO n e,2 0 1 3,8(9):e 7 2 5 3 0.1 2 Z HAN G T,L I U Y,WAN G H,e ta l.R e c o m b i n a n tN D Ve x-p r e s s i n gc y t o k i n e so r f l i Cc o n f e r s aq u i c k i mm u n e r e s p o n s e a-g a i n s tN D Vc h a l l e n g e a n d r e s i s t a n c e t om a t e r n a l a n t i b o d yJ.V e tM i c r o b i o l,2 0 1 6,1 9 6:1 0 7-1 1 7.1 3 A F ON S O C L.V i r u l e n c ed u r i n g N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s e sc r o s ss p e c i e sa d a p t a t i o nJ.V i r u s e s,2 0 2 1,1 3(1):1 1 0-1 3 0.1 4 D ONGB,T AN G N,GUAN Y,e ta l.T y p ea n da b u n d a n c eo fs i a l i ca c i dr e c e p t o r so nh o s tc e l lm e m b r a n ea f f e c t i n f e c t i v i t ya n dv i r a l t i t e ro fd i f f e r e n ts t r a i n so fN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u sJ.JV i r o lM e t h,2 0 2 2,3 0 2:1 1 4 4 8 8.43动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):3