响应面优化超声波微波协同提取灵芝子实体多糖工艺_张柳莲.pdf

45 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 2 期及抗氧化活性分析J/OL.食品工业科技:1-172022-08-03.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2021110283.5 胡可秀.山楂饮料的研制J.饮料工业,2007(4):13-15.6 苏刚.山楂黄酮保健饮料的研制J.食品工业科技,2000(1):61-62.7 陈瑛,鲁周民,李志西.火棘果汁饮料生产工艺及生产过程中HACCP质量控制研究J.食品科学,2007(8):598-601.8 鲁长征,山永凯,任蓓蕾,等.HACCP体系在沙棘果汁生产中的应用J.国际沙棘研究与开发,2010,8(2):44-48.9 周小理,陈树俊.HACCP在浊型沙棘果汁饮料生产中的应用J.食品工业科技,2002(3):89-91.10 谢蓝华,陈佳,杨勇福,等.HACCP体系在植物蛋白饮料生产中的应用J.饮料工业,2019,22(4):47-50.响应面优化超声波微波协同提取灵芝子实体多糖工艺张柳莲1，黄清铧1，王丽宁1，马年方1，梁磊2*，王庆福1*1.广东省科学院生物与医学工程研究所，广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心，广东省生物质高值化利用工程实验室，广州市植物纤维综合利用重点实验室，药食同源功效成分研发与应用协同创新中心，药食同源崖柏精油产业化研究工程中心（广州 510316）；2.广东省科学院（广州 510316）摘要为提高灵芝多糖提取率,研究超声波-微波协同提取灵芝子实体多糖工艺,通过单因素试验,选取超声波功率、微波功率、料液比3个影响因素,以多糖提取率为响应值进行响应面优化。结果表明,超声波-微波协同提取灵芝子实体多糖,提取率显著高于传统提取法,灵芝子实体多糖最佳提取工艺为超声波功率638 W、微波功率400 W、料液比145(g/mL)、提取温度90、提取次数2次。利用最佳工艺提取的灵芝子实体多糖提取率为26.990.71 mg/g。关键词灵芝子实体多糖;超声波;微波;协同提取Response Surface Optimization of Ultrasonic-microwave Assisted Extraction of Ganoderma lucidum Polysaccharide ZHANG Liulian1,HUANG Qinghua1,WANG Lining1,MA Nianfang1,LIANG Lei2*,WANG Qingfu1*1.Institute of Biological and Medical Engineering,Guangdong Academy of Sciences,Guangdong Plant Fiber Comprehensive Utilization Engineering Technology Research and Development Center,Guangdong Engineering Laboratory of Biomass High-Value Utilization,Guangzhou Key Laboratory of Biomass Comprehensive Utilization,Collaborative Innovation Center for Research and Application of Effective Ingredients in Homologous Medicine and Food,Engineering Center of Essential Oil Industrialization of Homologous Medicine and Food Congeners(Guangzhou 510316);2.Guangdong Academy of Sciences(Guangzhou 510316)Abstract The microwave-ultrasound extraction process for polysaccharides of G.lucidum by using response surface experimental methods was optmized.Based on the results of single factor experiments,ultrasonic power,microwave power and solid-liquid ratio were chosen as influencing factors for response surface analysis.The results showed the extraction rate of G.lucidum polysaccharides was significantly higher than the traditional methods.The optimal extraction process was that ultrasonic power 638 W,microwave power 400 W,material-liquid ratio 145(g/mL),extraction temperature 90 and extraction for 2 times.In this condition,the max extraction rate was 26.990.71 mg/g.Keywords G.lucidum polysaccharides;ultrasonic wave;microware;synergistic extraction灵芝（Ganoderma lucidum）为担子菌纲多孔菌目多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma）1，古籍记载灵芝具有“善养心神，增智慧不忘”的功效2，现代医学研究发现，灵芝具有提高免疫力3-4、抗肿瘤5、抗炎症6、抗衰老7和抗动脉粥样硬化8等方面功效，是真菌类保健食品市场的主要品种。灵芝多糖是灵芝的主要活性物质，传统的灵芝多糖提取法主要有热水浸提法9、微波法10、超声波法11等，但这些传统提取方法存在提取时间长、提取率较低等缺点。利用超声波和微波在天然产物提取方面的优势，通过单因素试验及响应面设计试验，以多糖提取率为指标，探究微波功率、超声波功率、料液比对多糖提取率的影响，优化灵芝子实体多糖的微波-超声波协同提取工艺，以期为灵芝多糖高效提取提供理论依据。食品工业 2023 年第44卷第 2 期 46 工艺技术1材料与方法1.1仪器与试剂灵芝子实体（采用纯甘蔗渣栽培所获得子实体）；无水乙醇、苯酚、浓硫酸等（均为国产分析纯）。XH-300U电脑微波超声紫外光组合催化合成仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；PLC017台式高速冷冻离心机（广州市得菲科学仪器有限公司）；722G紫外可见分光光度计（上海仪电分析器有限公司）。1.2方法1.2.1多糖含量测定多糖含量测定方法采用苯酚硫酸法，参照S/N 42602015出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸。标准曲线的制备：分别精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL于10 mL 100 mg/L的葡萄糖标准溶液具塞试管中，用蒸馏水补齐至1.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，快速加入5 mL硫酸，静置10 min后摇匀，置于30 水浴中反应20 min，在490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线y=0.723x-0.002 8，R2=0.999。1.2.2不同提取方法比较微波-超声协同波提取法：提取温度90、提取时间20 min、料液比140（g/mL）、微波功率300 W、超声波功率500 W。热水浸提法：提取温度90、提取时间2 h、料液比140（g/mL）、提取次数2次。超声波提取法：超声功率500 W、超声时间40 min、料液比140（g/mL）、提取次数2次。微波提取法：微波功率400 W、微波时间20 min、料液比140（g/mL）、提取次数2次。提取结束后，以8 000 r/min离心10 min，提取液定容到100 mL，取5 mL滤液加入4倍体积的无水乙醇，以8 000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀加5 mL水溶解，即得灵芝粗多糖提取物，备用。1.2.3单因素试验按照1.2.2的基础提取参数，研究不同超声功率、微波功率、提取时间、提取次数、提取温度、料液比等因素条件对灵芝总多糖提取率的影响，各因素水平分别为料液比（120，130，140，150和160 g/mL）、提取时间（10，20，30，40和50 min）、提取温度（50，60，70，80和90）、超声波功率（200，400，600，800和1 000 W）、微波功率（100，300，500，700和900 W）、提取次数（1，2，3和4次）。提取结束后，以8 000 r/min离心10 min，收集滤液备用。1.2.4响应面优化灵芝子实体多糖提取试验结合单因素试验结果，应用Box-Behnken的中心组合试验设计原理，根据单因素试验结果，对试验结果影响较大的因素进行优化试验，分别选取超声波功率（500，600和700 W）、微波功率（200，300和400 W）、料液比（130，140和150 g/mL）三因素三水平设计响应面试验，每个自变量的低、中、高试验水平分别以-1，0和1进行编码，以灵芝总多糖提取率为响应值优化灵芝子实体多糖提取条件。2结果与分析2.1不同提取方法比较微波-超声协同波提取法与超声波提取法、热水提取法、微波提取法相比较结果见表1。微波-超声波协同提取法对灵芝子实体总多糖的提取率最高，为23.89 mg/g，且提取时间最短，说明该提取方法的提取效果显著优于其他3种提取方法。表1不同提取方法对灵芝子实体多糖提取率的影响提取方法提取率/(mgg-1)提取时间/min微波-超声波协同提取23.89a20超声波提取15.34b40微波提取9.81c20热水浸提21.81d120注:不同字母表示具有显著性(P0.05)。2.2单因素试验结果由图1单因素提取试验结果可知，灵芝总多糖提取率随着超声波功率提高而快速升高，功率大于600 W时，继续提高超声波功率，总多糖提取率逐步下降，可能是由于超声波功率过高使得部分多糖被打断成小分子，在醇沉过程被去除，从而导致多糖提取率下降。微波功率100 W时，灵芝总多糖提取率较低，仅为96.98 mg/g，微波功率300 W及以上时，灵芝子实体多糖提取率趋于稳定，多糖提取率在155 mg/g以上，这可能是由于微波功率100 W时，提取温度难以达到设置温度，影响提取效果。提取时间对灵芝子实体多糖提取率具有一定的影响，随着提取时间延长，灵芝子实体多糖提取率逐步升高，提取时间超过30 min时，多糖提取率上升变慢，因此最终选择提取时间30 min。料液比结果显示，多糖提取率随料液比减小先增大后降低，料液比140（g/mL）时，提取率达到最高，为19.08 mg/g。随着提取次数增加，多糖提取率逐步提升，提取次数2次时，提取率趋于稳定，说明利用超声波微波协同提取多糖提取效率高，由于提取次数对提取率影响较小，选择提取次数2次。单因素结果显示，微波功率、超声波功率和料液比3个因素对多糖提取率影响较大，因此，继续对这3个因素进行响应面试验优化。2.3响应面优化提取灵芝子实体多糖结果与分析2.3.1响应面优化数据模型建立与显著性分析在单因素试验结果的基础上，利用响应面分析方法对微波-超声波协同提取灵芝总多糖工艺进行优化，试验水平因素设计方案和结果见表2。利用Design-*通 信 作 者；基 金 项 目：广 州 市 重 点 研 发 计 划（202103000080），广东省特支计划（2019TQ05N232），广东省科学院专项资金项目（2022GDASZH-2022010110），广东省科技特派员项目（GDKTP2021017800）47 工艺技术 食品工业 2023 年第44卷第 2 期表2响应面法优化试验结果编号因素提取率/(mgg-1)超声波功率/W微波功率/W料液比/(gmL-1)15003001 3021.2225003001 5019.2236004001 5027.2246002001 3021.8156003001 4023.4666004001 3024.6477003001 3022.4086003001 4023.2296003001 4023.81107003001 5022.87115004001 4025.93125002001 4019.69136002001 5018.28147004001 4026.05157002001 4020.52166003001 4026.52176003001 4025.81表3方差分析差异来源平方和自由度均方F值P值模型105.280 5911.697 838.656 6040.004 8A超声波7.766 43617.766 4365.747 3020.047 7B微波功率63.110 96163.110 9646.703 240.000 2C料液比0.837 94110.837 9410.620 0920.456 8AB0.013 84110.013 8410.010 2420.922 2AC1.525 95211.525 9521.129 2320.323 2BC8.997 35318.997 3536.658 2030.036 5A213.462 7113.462 79.962 6390.016 0B20.282 30210.282 3020.208 9090.661 5C27.641 53517.641 5355.654 8730.049 0残差9.459 2371.351 319失拟项0.501 44530.167 1480.074 6380.970 5净误差8.957 78542.239 446总计114.739 716灵芝子实体多糖响应面优化提取试验结果如表2所示。通过方差分析可见（表3），模型具有极显著性线性相关（P值=0.004 80.01），说明试验设计可靠。相关系数R2=0.917 6，说明响应值的改变有91.76%来源于因素变量的改变，即实测值和预测值之间具有较高相关性，方程的拟合度较好，失拟项不显著，所建模型可行。变化系数C.V.=5.06，说明试验具有较高的可信度和精确度，A项（P=0.047 7 0.05）、B项（P=0.000 20.01）、A2项（P=0.016 0 0.05）、C2项（P=0.0490.05）、BC项（P=0.036 5 0.05）对响应值的影响达到显著水平，3个影响因素对灵芝总多糖提取率的影响依次为BAC。2.3.2响应面优化分析通过Design-Expert 8.0.6.1软件分析3个因素之间的交互作用对灵芝子实体多糖提取率影响，用三维响应面曲线和二维等高线图作为回归方程的图解，说明因变量和自变量之间的关系12，响应面中等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著。响应面图与等高线图相对应，响应面图曲面越陡峭，则该因素对响应值的影响越显著13。由图2结果可见，料液比和微波功率对灵芝总多糖提取率的响应面等高线显椭圆形，曲面较陡峭，说明两因素交互作用显著。而料液比和超声波功率对灵芝总多糖提取率影响的响应面和等高图显近圆形，说明两因素交互作用不显著。灵芝子实体多糖提取率随液体比例的增加呈先增加后减少的趋势；提取率随微波功率的变化逐步增加，增加幅度较小；提取率随超声波功率的增加先增加后减少，从试验结果优化得到超声波功率为638.17 W时提取率达到最大值；料液比和超声波功率的交互作用与微波功率和超声波功率交互作用相比，前者对提取率的影响大于后者，通过模型计算得Expert 8.0.6.1软件对表3的数据进行分析处理，并对灵芝子实体多糖提取率响应值与超声波功率（A）、微波功率（B）、料液比（C）3个因素进行回归拟合，建立数学回归模型，各因素对灵芝子实体多糖影响拟合方程为Y=24.56+0.99A+2.81B-0.32C+0.059AB+0.62AC+1.5BC-1.79A2-0.26B2-1.35C2。图1单因素试验结果食品工业 2023 年第44卷第 2 期 48 工艺技术到最优提取料液比145.24（g/mL），微波功率400 W；为方便试验，灵芝子实体多糖最佳提取工艺为超声波功率638 W、微波功率400 W、料液比145（g/mL）、提取温度90、提取次数2次；利用最佳工艺提取灵芝总多糖，提取率为26.990.71 mg/g。图2不同因素交互效应响应面图3结论利用响应面试验优化一种基于微波-超声辅助工艺的有效提取方法，通过方差分析表明，建立的拟合模型由二次多项式数学表示：Y=24.56+0.99A+2.81B-0.32C+0.059AB+0.62AC+1.5BC-1.79A2-0.26B2-1.35C2。模型的统计分析结果证实试验值的高可靠性和准确性，可用于优化、确定最佳提取条件：超声波功率638.17 W，料液比145.24（g/mL），微波功率400 W，提取温度90，提取次数2次，提取时间30 min。理论提取率预计为27.62 mg/g，在调节超声波功率638 W和料液比145（g/mL）条件下，提取率为26.99 mg/g，与模型预测结果相近，说明所建模型与采用的优化方法可靠，适用于灵芝子实体多糖的提取工艺优化和分析。参考文献：1 戴玉成,曹云,周丽伟.中国灵芝学名之管见J.真菌学报,2013,32(6):947-952.2 彭杨芷,苏悦,芦光亮,等.灵芝主要功效现代研究进展J.亚太传统医药,2016,12(18):71.3 LI C,CUI Y,LU J,et al.Spectrum-effect relationship of immunologic activity of Ganoderma lucidum by UPLC-MS/MS and component knock-out methodJ.Food Science and Human Wellness,2021,10(3):278-288.4 LI Q Z,CHANG Y Z,HE Z M,et al.Immunomodulatory activity of Ganoderma lucidum immunomodulatory protein via PI3K/Akt and MAPK signaling pathways in RAW264.7 cellsJ.Journal of Cellular Physiology,2019,234(12):1-12.5 MOHAN K,PADMANABAN A M,UTHAYAKUMAR V.Anti-cancer effect of the polysaccharide extract from the Ganoderma lucidum against HeLa cell linesJ.Bangladesh Journal of Pharmacology,2017,12(1):56-57.6 WADT N,OKAMOTO M,HI E,et al.Anti-inflammatory and antimicrobial evaluation of Ganoderma lucidum extractsJ.Emirates Journal of Food and Agriculture,2015,27(7):577-584.7 丁文乔.灵芝水提物对嗜热四膜虫的抗衰老作用及其分子机制研究D.哈尔滨:哈尔滨师范大学,2022.8 杨燕燕,谢金东,周建华,等.灵芝多糖对ApoE(-/-)动脉粥样硬化小鼠TLR4/NF-B信号通路的影响J.中国中医基础医学杂志,2019,25(1):56-59,6.9 王会宾,陈丽芳,叶克难.响应面法优化热水浸提灵芝孢子多糖工艺J.食品工业,2019,40(3):41-45.10 张妙彬,潘丽晶,陈继敏,等.灵芝多糖的微波法提取及抗氧化活性研究J.中国食用菌,2013,32(4):35-37.11 唐晓璇,王成忠,李双.响应面法优化灵芝多糖超声提取工艺J.山东工业大学学报,2014,28(3):37-41.12 梁磊,黄清铧,王庆福.响应面优化微波-超声波协同提取灵芝三萜工艺及其清除自由基活性J.菌物学报,2017,36(4):512-521.13 WU Y,YI L,LI E,et al.Optimization of Glycyrrhiza polysaccharide liposome by response surface methodology and its immune activitiesJ.International Journal of Biological Macromolecules,2017,102:68-75.