湘黄鸡鸡蛋中氟苯尼考的残留消除规律研究_贺宇文.pdf

现代农业科技2023 年第 7 期动物科学湘黄鸡鸡蛋中氟苯尼考的残留消除规律研究贺宇文1隆雪明1刘曙光1谭美英1*李 裕1郑四清2黄 勇1李艳平1张 敏1王鹏超1（1湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙 410006；2耒阳市畜牧水产事务中心，湖南耒阳 421800）摘要为了研究湘黄鸡鸡蛋中氟苯尼考的残留消除规律，本试验采用氟苯尼考的标准治疗剂量拌料给药饲喂产蛋高峰期的湘黄鸡，连续用药 5 d，从给药前 1 d 开始收集鸡蛋以备检测，连续收集 30 d，使用液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氟苯尼考及其代谢产物氟苯尼考胺的含量。结果表明，在停药第 15 天时，湘黄鸡鸡蛋中氟苯尼考、氟苯尼考胺的残留量低于现行农业农村部指定检测方法的检出限。关键词湘黄鸡；鸡蛋；氟苯尼考；氟苯尼考胺；消除规律中图分类号S831.4文献标识码A文章编号 1007-5739（2023）07-0172-03DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.07.047开放科学（资源服务）标识码（OSID）：氟苯尼考（Florfenicol，又名氟甲砜霉素）为甲砜霉素的单氟衍生物，与氯霉素、甲砜霉素同属于酰胺醇类抗生素。氟苯尼考是动物专用的广谱抗菌药，通过作用于细菌 70S 核糖体的 50S 亚基，抑制肽酰基转移酶活性进而阻断核糖体上肽链合成。对革兰阳性菌、革兰阴性菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次体等均有抑制效果，而且毒副作用比氯霉素小，广泛用于畜、禽、水产动物的疾病治疗。在鸡的养殖中，氟苯尼考最常用于治疗呼吸道感染。湘黄鸡（又名黄郞鸡）是优良的湖南省地方鸡种，属肉蛋兼用型，在湖南省内分布较广1。湘黄鸡有着与其他鸡种不同的特点：体型小，成年母鸡体重一般仅为 1.3 kg；体脂低；呈味氨基酸特别是谷氨酸含量高；运动能力强，多数是山野林地圈养2。湘黄鸡曾被国家外贸部评为“名贵项鸡”，在湖南省内和粤港澳市场享有很高声誉3。近年来，湖南省内抽检，有多例湘黄鸡鸡蛋检出氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的情况。因此，通过试验了解湘黄鸡在使用标准治疗剂量的氟苯尼考时其鸡蛋中氟苯尼考的消除规律，可为监管部门分析湘黄鸡使用氟苯尼考时可能带来的食品安全风险提供科学数据，也可为湘黄鸡养殖户提供参考，以规范用药和弃蛋期，保证进入市场的湘黄鸡鸡蛋产品质量。1材料与方法1.1供试材料1.1.1试验动物。供试产蛋期湘黄母鸡购自湖南省耒阳市某专业湘黄鸡养殖场。1.1.2仪器设备。超高效液相-串联质谱仪，型号：5500QTRAP（SCIEX 公司）；离子源：ESI（）。高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司）。MV5 氮吹仪（54 位，美国 LabTech 公司）。1.1.3药品、标准品、试剂。动物试验用 2%氟苯尼考粉为市售商品，使用前用高效液相色谱法确认其含量为 2.05%。所使用的氟苯尼考标准品、氟苯尼考胺标准品、氟苯尼考-D3 标准品、氟苯尼考胺-D3 标准品均为天津阿尔塔科技有限公司产品。乙酸乙酯（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均为 Merck 公司产品。氨水（分析纯）、甲酸（分析纯）为国药集团产品。50%乙腈水溶液：去离子水和乙腈等体积混合。0.5%甲酸乙腈水溶液：取 2.5 mL 甲酸，用 50%乙腈水溶液溶解并定容至 500 mL。饱和正己烷：取 500 mL正己烷，用 50%乙腈水溶液混合至饱和。1.2试验设计采用半开放的养殖场地，对外购的 90 只产蛋期湘黄母鸡进行全群圈养。采用自动喂料器、自动喂水器给料给水，使其在新鸡舍适应 1 个月以上。确定全群采食、产蛋率稳定时开始试验。按照 中华人民共作者简介贺宇文（1964），男，湖南双峰人，副教授，从事畜禽水产养殖与质量安全研究工作。*通信作者收稿日期 2022-09-01172和国兽药典（2020 年版）中氟苯尼考治疗给药剂量添加到饲料中，即 50 mg/（kg BWd），用药周期为 5 d。从用药前 1 d 开始收集鸡蛋，连续收集 30 d。每天16：00 左右将当天收集的鸡蛋，随机选取 18 枚用于检测。因为用药当天的鸡蛋残留量个体差异大，所以对用药第 1 天的鸡蛋样品进行测定。1.3样品前处理方法1.3.1样品制备。每 3 枚鸡蛋去壳匀浆混匀制成 1 个样品，每天共 6 个样品，放入-80 冰箱冻存。最后将全部样品取出，一并进行检测。1.3.2提取与净化。准确称取 5.0 g 匀质的鸡蛋样品置于 50 mL 离心管中，加入 10 L 氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3 内标溶液，15 mL 乙酸乙酯和 0.5 mL 氨水，涡旋提取 1 min，转速 8 000 r/min 离心 5 min，上清液转入另一个 50 mL 离心管。重复提取 1 次，合并上清液。取 6 mL 上清液放入 15 mL 离心管，50 氮吹至近干，用 1 mL 0.5%甲酸乙腈水溶液复溶，涡旋 30 s，加入 5 mL 饱和正己烷涡旋 1 min，转速 8 000 r/min 离心 1 min，弃去上层正己烷。重复操作 3 次。取下清液过 0.22 m 滤膜，装入进样瓶中。将用药前 1 d 的样品作为阴性对照，添加氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品制成阳性添加样品。阳性添加样品使用同样的提取与净化方法进行处理。1.4上机测定方法1.4.1色谱方法参数。采用美国 Waters ACQUITYUPLC C18色谱柱（2.1 mm100.0 mm，1.7 m），流动相为水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序：01.0 min，流动相 A 为 95%，B 为 5%；1.03.0 min，流动相 A 由95%降至 5%，保持 2 min；5.1 min 时，流动相 A 由 5%增至 95%，保持至 6.0 min。流速 0.3 mL/min，柱温35，进样量 5 L。1.4.2超高效液相-串联质谱仪参数。扫描方式为正离子扫描（氟苯尼考胺、氟苯尼考胺-D3）和负离子扫描（氟苯尼考、氟苯尼考-D3）；质谱扫描方式为多反应离子监测（MRM）；电喷雾电压为+5 500 V/-4 500 V；参考监测离子对质谱参数见表 1。1.4.3上机顺序。取适量混合标准工作液，稀释配制成氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 g/L，同位素内标氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3 浓度均为 10 g/L 的系列标准工作溶液。标准工作液、样品上机液依次上机进样。2结果与分析2.1标准曲线根据不同浓度氟苯尼考、氟苯尼考胺标准工作液的定量子离子信号经内标修正过的积分面积与浓度一一对应，建立标准曲线。根据标准曲线拟合得到氟苯尼考的线性回归方程y=0.082 45x0.012 26（r=0.999 05，R2=0.998 10）和氟苯尼考胺的线性回归方程y=0.324 52x0.024 43（r=0.999 02，R2=0.998 04）。表明氟苯尼考、氟苯尼考胺在 0.550.0 g/L 范围内响应信号与浓度之间呈良好的线性关系。由线性回归方程计算得到样品中的氟苯尼考、氟苯尼考胺的含量。2.2测定结果由表 2 可知，用药第 2 天起，湘黄鸡鸡蛋中氟苯尼考的含量已达到最大值，然后持续稳定在较高含量，直到停药第 7 天开始大幅下降。到停药第 15 天时，氟苯尼考的残留量降至方法检出限以下，随后的1 周一直稳定在方法规定的检出限以下，但仍能被仪器检测到。鸡蛋氟苯尼考胺的残留量从用药第 2 天起缓慢上升，停药第 1 天达到较高值，在停药第 4 天时到达最高值，然后在停药第 810 天时骤减，在停药第 14 天时，氟苯尼考胺的残留量降至方法检出限以下，随后的 1 周虽然一直低于方法规定的检出限，但仍能被仪器检测到。3结论与讨论测定鸡蛋中的氟苯尼考和氟苯尼考胺最常用的方法有高效液相色谱法4和液相色谱-串联质谱法。高效液相色谱法测定结果准确，但灵敏度不如液相色谱-串联质谱法5。液相色谱-串联质谱法采用内标法测定氟苯尼考时，可以达到与高效液相色谱法相同的表 1MRM 特征离子与质谱条件名称氟苯尼考氟苯尼考-D3氟苯尼考胺氟苯尼考胺-D3保留时间/min5.455.453.013.01母离子（m/z）356.0359.0248.2251.1子离子（m/z）119.0185.1336.1185.0339.0130.1151.4230.1130.1233.1解簇电压/V-75-75-75-90-908686868080碰撞能量/V-44-27-14-27-153035193418贺宇文等：湘黄鸡鸡蛋中氟苯尼考的残留消除规律研究173现代农业科技2023 年第 7 期动物科学准确度，而灵敏度比高效液相色谱法高 12 个数量级。本试验的检测方法参照中国农业科学院编写的禽肉和禽蛋中酰胺醇类药物及代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法，是目前农业农村部指定用于测定禽肉和禽蛋中酰胺醇类药物及代谢物残留量的方法。该方法禽蛋中氟苯尼考、氟苯尼考胺的检出限为 0.5 g/kg，定量限为 1 g/kg。本试验结果显示，当停药第 15 天时，氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量已低于检出限，但由于试验使用的超高效液相-串联质谱仪（5500 QTRAP）是较新一代的产品，仪器灵敏度相对较高，能检测出比方法检出限（0.5 g/kg）更低的含量。停药第 21 天时，湘黄鸡鸡蛋中的氟苯尼考、氟苯尼考胺仍能被仪器检测到。鸡蛋在母鸡体内从形成到产出有一个比较复杂和漫长的过程，历时 23 周6。鸡蛋中药物的残留规律有一定特殊性，不同鸡种间也有较明显的差异7-9。畜、禽、水产动物养殖过程中，感染疾病时可以使用国家允许的药物来治疗，但必须注意休药期和弃蛋期，且必须保证终产品的药物残留符合国家规定。考虑到疗效、细菌耐药周期、成本等综合因素，目前氟苯尼考在动物养殖中的应用非常广泛。我国规定产蛋期不得使用氟苯尼考，上市的鸡蛋中不得检出氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺（检出限 0.5 g/kg）。根据本试验的结果，湘黄鸡产蛋期前 15 d 或更早时间应停用氟苯尼考。4参考文献1 廖晓君.湘黄鸡品种介绍与养殖J.湖南畜牧兽医，2013（6）：14-16.2 何华西，田伟政.林果地饲养湘黄鸡J.农村养殖技术，2002（4）：11.3 马玉勇，肖明旭，罗志嘉，等.衡阳市湘黄鸡产业现状及思考J.湖南畜牧兽医，2020（3）：5-8.4 陈芩，章剑，胡洁，等.高效液相色谱法检测蛋及蛋制品中氟苯尼考残留量J.现代农业科技，2018（3）：259-260.5 罗昭军，陈幸，单乃荣，等.高效液相色谱法检测鸡蛋中氯霉素类药物残留J.中国畜牧兽医文摘，2018，34（3）：72-74.6 王志恒，赵义良，田梅，等.鸡蛋中抗菌药物代谢周期研究概况J.中国畜禽种业，2021，17（12）：53-56.7 张静，周倩，高玉时，等.氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在鸡蛋中的残留消除规律J.浙江大学学报（农业与生命科学版），2021，47（1）：127-134.8 陈大伟，赵敏，刘茵茵，等.氟苯尼考在产蛋前期鸡蛋中的残留规律及膳食暴露评估J.食品安全质量检测学报，2020，11（24）：9487-9495.9 柏雪，陈宇，赵立军，等.氟苯尼考在鸡蛋和蛋鸡组织中的残留规律及预测模型建立J.食品科学，2021，42（13）：26-33.表 2鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺含量取样时间用药前 1 天用药第 2 天用药第 3 天用药第 4 天用药第 5 天停药第 1 天停药第 2 天停药第 3 天停药第 4 天停药第 5 天停药第 6 天停药第 7 天停药第 8 天停药第 9 天停药第 10 天停药第 11 天停药第 12 天停药第 13 天停药第 14 天停药第 15 天停药第 16 天停药第 17 天停药第 18 天停药第 19 天停药第 20 天停药第 21 天氟苯尼考079.316.1076.4114.5079.019.1863.5410.7362.372.2278.1811.2163.5816.8265.7711.1664.1716.3043.2526.6629.123.4221.869.3712.414.683.742.321.901.390.640.450.230.140.540.580.230.080.150.080.330.390.230.170.480.540.260.320.370.34氟苯尼考胺010.0411.0514.609.4629.9519.0862.3818.0173.9319.5366.0830.1899.3618.41134.5317.1676.4344.9277.6950.7253.8810.9329.369.6116.1111.164.270.092.312.680.640.590.630.200.210.240.190.230.210.030.320.160.140.090.310.040.290.100.200.20单位：（gkg-1）174