温补脾肾经验方治疗视神经脊...病作用机制的网络药理学分析_宫玉霜.pdf

第 49 卷 第 2 期2023年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.2Mar.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230201温补脾肾经验方治疗视神经脊髓炎谱系疾病作用机制的网络药理学分析宫玉霜1,付业繁2,许会静2,郭健2,相琳1,胡睿1,樊睿1,王捷3,李淼1,孙美艳2（1.吉林大学中日联谊医院神经外科，吉林 长春 130033；2.吉林医药学院检验学院实验中心，吉林 吉林 132013；3.吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春 130033）摘要 目的目的：通过网络药理学分析和动物实验探讨温补脾肾经验方（TSKEP）治疗视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的潜在作用靶点和信号通路，为治疗 NMOSD 提供理论依据。方法方法：采用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）筛选 TSKEP 的化合物和靶点，通过 GendCard 等数据库确定 NMOSD 的相关靶点基因；构建化合物-靶点网络确定核心化合物；利用 STRING 数据库和Cytoscape 3.6.0软件中的 Network Analyzer插件获得蛋白-蛋白互作（PPI）网络的拓扑参数并识别核心靶点；利用 OmicShare 平台对核心靶点进行基因本体论（GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析并构建靶点-通路网络，以识别关键的生物过程和信号通路；基于AutoDock软件对核心化合物和核心靶点进行分子对接。18只小鼠分为对照组、NMOSD 组和 TSKEP组，每组 6只，HE染色观察 3组小鼠大脑组织病理形态表现，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠血清中相关细胞因子水平。结果结果：动物实验，TSKEP 组小鼠神经功能缺损评分与 NMOSD 组比较明显降低（P0.01），同时 TSKEP 组小鼠 中 枢 神 经 系 统 炎 性 细 胞 浸 润 程 度 较 轻。共筛选出304 个活性化合物和 655 个药物靶点，其中与 TSKEP 治疗 NMOSD 相关的靶点有 43 个。槲皮素、木犀草素和豆甾醇等可能是核心化合物，白细胞介素 6（IL-6）、白细胞介素 1（IL-1）和肿瘤坏死因子 （TNF-）等可能是潜在的核心靶点。KEGG 通路富集分析及靶点-通路网络提示 TSKEP 主要通过 14 条信号通路发挥治疗 NMOSD 作用。分子对接验证结果表明核心化合物与核心靶点之间结合良好。与 NMOSD 组和对照组比较，TSKEP组小鼠血清中相关炎性细胞因子水平降低（P0.05或 P0.01）。结论结论：基于网络药理学和动物实验验证，TSKEP可通过多靶点和多条信号通路调控血清中炎性细胞因子的表达并促进神经功能的修复再生，减轻中枢神经系统的炎症反应，从而发挥治疗作用。关键词 视神经脊髓炎谱系疾病；温补脾肾经验方；网络药理学；分子对接中图分类号 R744.52文献标志码 ANetwork pharmacology analysis on mechanism of Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription in treatment of neuromyelitis optica spectrum disordersGONG Yushuang1,FU Yefan2,XU Huijing2,GUO Jian2,XIANG Lin1,HU Rui1,FAN Rui1,文章编号 1671587X(2023)02026111收稿日期 20220512基金项目 国家自然科学基金项目（81771304）；吉林省科技厅科技发展计划项目（20200201623JC）；吉林省卫健委卫生科研人才专项项目（2019SCZ037）；吉林省教育厅科学技术研究项目（JJKH20210500KJ）作者简介 宫玉霜（1995），女，山东省威海市人，在读硕士研究生，主要从事视神经脊髓炎谱系疾病的发病机制和治疗等方面的研究。通信作者 孙美艳，教授，硕士研究生导师（E-mail：）；李 淼，教授，博士研究生导师（E-mail：）261第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）WANG Jie3,LI Miao1,SUN Meiyan2（1.Department of Neurosurgery，China-Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China；2.Experiment Center，College of Laboratory Medicine，Jilin Medical University，Jilin 132013，China；3.Department of Neurology，China-Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China）ABSTRACT Objective：To discuss the potential targets and signaling pathways of Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription（TSKEP）in the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorders（NMOSD）through network pharmacology analysis and animal experiment，and to provide the theoretical basis for the treatment of NMOSD.Method：Traditional Chinese Medicine System Analysis Platform（TCMSP）Database was used to screen the chemical compounds and targets of TSKEP；the related target genes in NMOSD were comfirmed through GendCard and other Databases；the core compounds were obtained by building the compound-target network；the STRING Database and the Network Analyzer plugin in Cytoscape 3.6.0 software were used to obtain the topology parameters of protein-protein interaction（PPI）network and to identify the core targets；Omicshare platform was used to perform the Geno Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analysis and the target-pathway network was conducted to identify core key biological processes and signaling pathways；the molecular docking of core compounds and core targets was performed based on AutoDock software.Eighteen mice were divided into control group，NMOSD group，and TSKEP group，and there were 6 mice in each group.The morphology of brain tissue of the mice in various groups were observed by HE staining，and the levels of related cytokines in serum of the mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method.Results：The animal experiment results showed that compared with NMOSD group，the score of neural function defect of the mice in TSKEP group was decreased（P0.01），and the degree of inflammatory cell infiltration in central nervous system of the mice in TSKEP group was allevited.A total of 304 active compounds and 655 drug targets were screened，and 43 potential targets were related to the treatment of NMOSD with TSKEP.Quercetin，luteolin，and stigmasterol may be the core compounds，and interleukin-6（IL-6），interlleukin-1（IL-1），tumor necrosis factor-（TNF-）could be the poetential core targets.The KEGG pathway enrichment analysis and network analysis results showed that TSKEP may play an important role in the treatment of NMOSD through 14 signaling pathways.The molecular docking verification results showed that core compounds combined well with the core targets.Compared with NMOSD group and control group，the levels of serum inflammatory cytokines of the mice in TSKEP group were decreased（P0.05 or P0.01）.Conclusion：Based on the verification of network pharmacology and animal experiment，TSKEP can exert the therapeutic effect through regulating the expressions of serum inflammatory cytokines，promoting the repairment and regeneration of nerve function，and reducing the inflammatory response of the central nervous system by multiple targets and signaling pathways.KEYWORDS Neuromyelitis optica spectrum disorders；Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription；Network pharmacology；Molecular docking视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是一种罕见的中枢神经系统自身免疫性炎性脱髓鞘疾病，呈复发-缓解 病 程，可 导 致 失 明 及 长 节 段 脊 髓 损 伤1-2。NMOSD 好发于 32.645.7岁女性人群3，其发病机制尚未完全明确。目前主要通过糖皮质激素和血浆置换等方法缓解急性期症状，缓解期多以免疫抑制剂和单克隆抗体进行治疗，但以上治疗费用高昂且效果不佳，甚至存在严重不良反应。因此，如何为 NMOSD 患者提供安全有效的治疗方法仍是临床262宫玉霜，等.温补脾肾经验方治疗视神经脊髓炎谱系疾病作用机制的网络药理学分析面临的一大难题。NMOSD 在中医学领域中属于“痿病”“暴盲”范畴4。研究5显示：NMOSD以“脾肾阳虚”“痰淤湿热”等为病机。灵枢海论 云：“髓海不足，目无所见，懈怠安卧”。中医学认为：肾藏精，为先天之本，主骨生髓，肾阳虚衰，髓海空虚，不能充髓生骨，则会腰膝酸软，肢冷麻木无力，发为痿病，髓海空虚亦不能充养睛目，目失所养而视物模糊，发为青盲病。黄帝内经灵枢本神 记载：“脾虚则四肢不用。若脾虚弱，则气血乏源，运化布散精气失司，则视物昏花、肌肉筋骨痿弱麻木无力”，因此导致视力障碍和运动障碍，治疗上则以“补脾益肾、填精补髓”为治疗要点。由吉林大学中日联谊医院中医科教授亲自拟定的由 15 味中药组成的温补脾肾经验 方（Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription，TSKEP），主要被用于近 5 年来明确诊断为 NMOSD 且于门诊复诊的约 30 例患者。其中熟地黄滋阴填精益血、补益肝肾；黄连及三颗针清热燥湿、泻火解毒；黄芪可大补元气、健脾益气；茯苓及白术渗湿健脾以杜生痰之源；当归养血活血。诸药合用，可改善 NMOSD 患者临床症状，减轻神经功能缺损，降低复发频率，临床疗效显著。鉴于中药方剂多组分和多靶点的作用特点，TSKEP 治疗 NMOSD 的效果及发病机制尚未完全明确。本研究应用网络药理学及分子对接的方法构建多维靶点网络，探索 TSKEP 治疗 NMOSD 的效果及其作用机制，为其临床应用提供科学依据。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、药物药物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器SPF 级C57BL/6 雌性小鼠，体质量（255）g，购自吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（吉）2021-0001。实验由吉林大学中日联谊医院伦理委员会审查批准，编号：2017-104。小鼠分为对照组、NMOSD组和TSKEP组，每组6只。2019 年10月2021年 10月收集 10例 NMOSD 患者和 10名健康志愿者的血清标本，10 例患者均在吉林大学中日联谊医院就诊并参照 2015 年 NMOSD 的诊断标 准 明 确 诊 断 为 抗 水 通 道 蛋 白 4 抗 体（anti-aquaporin 4-immunoglobulin，AQP4-IgG）阳 性 的NMOSD。本研究使用的人血清标本获得吉林大学中 日 联 谊 医 院 伦 理 委 员 会 批 准，编 号：2017022238。TSKEP 由吉林医药学院药学系制备，中药复方由 15味中药组成：熟地 15 g，千金藤 30 g，山栀10 g，枸杞 15 g，牡丹皮10 g，当归15 g，黄连10 g，十大功劳叶 30 g，三 颗 针 30 g，黄 芪 30 g，党 参30 g，生地15 g，茯苓10 g，白术 15 g，黄柏 10 g。所有中药药材均购自北京同仁堂股份有限公司并经吉林大学中日联谊医院中医科主任医师、副教授冯桂梅鉴定，均符合 中国药典 要求。中药原材料混合，加洁净的冷水浸泡 3060 min 后，每剂药煎23次，首次煎煮加水至超过药物表面35 cm；第2 和 3 次煎煮加水 至 超 过 药 物 表 面 12 cm，煎煮时沸前用强火，沸后用文火。每次煎煮滤出药汁150200 mL，煎后将 3 次药汁混合。采用旋转蒸发仪将提取液进行浓缩并在烘箱中 60 烘干至粉末状，置于 4 冰箱中备用。每 1 g 干提取物含有3.56 g生药材，临用前用水配置成相应浓度药液。Melon Gel IgG 纯化试剂盒（赛默飞世尔科技公司，商品号 45206），增强型 BCA 蛋白检测试剂盒（碧云天科技公司，商品号 P0010），髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 MOG35-55（由上海顶肽生物技术公 司 合 成），酶 联 免 疫 吸 附 试 验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海酶联生物技术有限公司），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，商品号 C0105S）。Amicon Ultra 离心过滤器（美国密理博科技公司，商品号 ES-A01-4243），SpectraMax M5/M5e 多 功 能 酶 标 仪（美 国Molecular Devices 公司），伯乐 Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳套装（美国伯乐公司），5418R型Eppendorf 高速冷冻离心机（德国艾本德公司），ChemiDocTM MP 型 全 能 成 像 系 统（美 国 伯 乐 公司），爱华 QPJ-1C石蜡切片机（天津爱华医疗器械有限公司），HH-MMB-2型移动式微屏障鼠笼（苏州猴皇动物实验设备科技有限公司）。1.2NMOSD 动物模型制备及给药方式动物模型制备及给药方式用 PBS缓冲液稀释 MOG35-55至终浓度为 0.5 g L1，并与含有 12.5 g L1 热灭活结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂（complete freund s adjuvant，CFA）11 混合，充分乳化，诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmue encephalomyelitis，EAE）模型6。分别于小鼠背部中线两侧皮下注射 100 L乳化液，免疫当天（第 0 天）和 48 h（第 2 天）腹腔内注射百日咳毒素（PTX，每只 300 ng）。对照组小鼠以生理盐水代替。免疫第 57 天，实验组263第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）小鼠腹腔注射 NMO-IgG7（4 g L1 PBS 缓冲液）和 10 L 人补体，对照组以 IgG（4 g L1 PBS 缓冲液）代替。NMO-IgG 和 IgG 分别来自于 NMOSD患者和健康志愿者血清，利用 Melon Gel IgG 纯化试剂盒和 Amicon Ultra 离心过滤器纯化浓缩8。根据人与小鼠的体表面积折算等效剂量确定给药浓度和剂量9，即 TSKEP 组小鼠在免疫第 5 天开始以灌胃方式连续给予 TSKEP（15.6 g kg1体质量）26 d。对照组和 NMOSD 组每天灌胃等量生理盐水，在免疫第 30天处死所有小鼠。1.3动物行为学观察动物行为学观察免疫当天开始每日观察小鼠 发 病 情 况，同 时 采 用 5 分 法 记 录 神 经 功 能 评分10。评分标准：0分为无明显异常；0.5分为尾巴略微无力或步态略有异常；1.0 分为尾巴无力或尾巴略微无力且轻度后肢麻痹；1.5 分为尾巴无力且后肢轻度麻痹；2.0 分为尾巴无力伴中度后肢麻痹；2.5 分 为 后 肢 麻 痹，但 有 部 分 腿 部 活 动；3.0 分为后肢麻痹且无活动；3.5 分为后肢麻痹且前肢轻度麻痹；4.0 分为四肢完全麻痹，但头部有一定活动；4.5分为垂死；5.0分为死亡。1.4HE 染色观察各组小鼠脑组织病理形态表现染色观察各组小鼠脑组织病理形态表现 免疫第 30 天处死小鼠，4%甲醛灌注。取出小鼠脑组织后石蜡包埋，常规处理，制备成厚度为5 m 切片进行 HE染色，显微镜下观察。根据病理评分评估脑组织病理学改变。病理评分标准：0分为无炎性细胞；1 分 为 散 在 的 炎 性 细 胞（轻度）；2 分为血管周围炎细胞浸润，有“袖套样”改变（中度）；3 分为致密的炎性细胞浸润和实质坏死（严重）。1.5TSKEP潜在活性化学成分及靶点筛选潜在活性化学成分及靶点筛选通过中药系统药理学数据库及分析平台11（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），http：/ 口 服 生 物 利 用 度（oral bioavailability，OB）30%和 药 物 相 似 性（drug-likeness，DL）0.18 等 毒 药 物 动 力 学ADME（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion）参数12作为筛选条件，依次检索熟地、黄芪和党参等 15 味中药的活性化学成分及其 对 应 靶 点，借 助 STRING v11.0b 数 据 库13（https：/cn.string-db.org/）将得到的靶点转换成对应的基因名，汇总去重后得到全方的活性化学成分和靶点。1.6NMOSD 相关靶点相关靶点以视神经脊髓炎、视神经脊髓炎谱系疾病、NMO 和 NMOSD 为关键词，利用 DisGeNET v7.014（https：/www.disgenet.org）、GeneCard v5.3 15（https：/www.genecards.org）、The Online Mendelian Inheritance in Man16（OMIM，https：/mirror.omim.org）和 Drugbank v5.1.817（https：/www.drugbank）数据库进行检索，汇总去重后得到 NMOSD相关靶点。1.7TSKEP 治疗治疗 NMOSD 潜在靶点的获取潜在靶点的获取利用在线网站 Venny 2.1.018（https：/b.csic.es/tools/venny/index.html）绘制 TSKEP治疗 NMOSD相关靶点的韦恩图，得到交集靶点。1.8化合物化合物-靶点网络构建靶点网络构建利用 Cytoscape 3.6.0软件构建化合物-靶点网络，并进行拓扑结构分析，挑选度值（degree）较高的化合物，从而寻找发挥重要作用的核心活性成分。1.9 蛋 白蛋 白-蛋 白 互 作蛋 白 互 作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建网络的构建将 TSKEP 治疗 NMOSD 的潜在作 用 靶 点 映 射 到 STRING 数 据 库，限 定 物 种 为“Homo sapiens”，设定最低的置信区间为 0.7（置信度高），得到的数据以 TSV 格式导出。将得到的数据导入 Cytoscape 3.6.0软件生成 PPI网络并使用Network Analyzer 插件进行网络拓扑结构分析。拓扑 特 征 包 括 3 个 参 数：degree 值、介 数 中 心 性（betweenness centrality，BC）和 接 近 中 心 性（closeness centrality，CC），上述 3个参数是新药发现和靶点预测的关键指标19，其中节点的大小代表 degree值，节点越大，表示 degree值越大。通过拓扑结构分析来确定 PPI网络中的核心靶点。1.10潜在核心靶点基因本体论潜在核心靶点基因本体论（Gene Ontology，GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析通路富集分析将潜在核心靶点导入到STRING 数据库中进行 GO 和 KEGG 通路富集分析，GO 包括分子功能（molecular function，MF）、生 物 过 程（biological process，BP）和 细 胞 组 成（cellular component，CC）20。利 用 OmicShare 云平台（https：/ Omicshare平台输出的 KEGG 通路富集结果进行分析，选择最相关的通路信息整理成表格，输入到 Cytoscape 3.6.0 软件中得到靶点-通路网络。264宫玉霜，等.温补脾肾经验方治疗视神经脊髓炎谱系疾病作用机制的网络药理学分析1.12分子对接分子对接筛选 PPI 网络及靶点-通路网络中 degree 值较高的核心靶点与化合物-靶点网络中degree值较高的核心化合物进行分子对接验证。在PDB 数 据 库21（https：/www.rcsb.org/）中 找到核心靶点的 PDB 文件，在 Pubchem 数据库22（https：/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到核心化合物的 sdf文件，基于 AutoDock Tools 软件进行分子对接。以结合能评价化合物与靶点结合能力的高低，结合能0 表明可以自由结合，结合能越低，结合活性越强，受体与配体之间的亲和力越大，二者之间发生相互作用的可能性越大，结合能小于5 kcal mol1表明结合良好。1.13ELISA 法检测各组小鼠血清中细胞因子水法检测各组小鼠血清中细胞因子水平平分别在免疫第 5、15 和 30 天收集小鼠尾静脉血，室温下静置 20 min，使血液凝固。4、1 000 g离心 10 min（离心半径=10 cm），去除血清中的凝块。采用肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor-，TNF-）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素 10（interleukin-10，IL-10）和白细胞介素 17（interleukin-17，IL-17）ELISA 试剂盒检测小鼠血清中相应细胞因子水平。1.14统计学分析统计学分析采用 SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠神经功能评分、病理学评分及血清中炎性细胞因子水平等数据符合正态分布，以 xs 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。以 P0.05差异有统计学意义。2 结 果 2.1各组小鼠神经功能评分各组小鼠神经功能评分对照组小鼠在免疫后 30 d 内无神经功能障碍。NMOSD组和TSKEP组小鼠在造模后第 6天开始陆续发病，疾病程度逐渐加重，表现为尾巴无力、四肢不同程度麻痹、精神萎靡和活动减少等神经系统症状。NMOSD 组小鼠最高神经功能评分为 3.5 分。TSKEP 组小鼠平均神经功能评分第 1130 天均低于 NMOSD 组，从第 17 天开始到实验结束与 NMOSD 组比较差异有统计学意义（P0.01）。见图 1。2.2各组小鼠脑组织病理形态表现各组小鼠脑组织病理形态表现光学显微镜下观察各组小鼠脑组织切片 HE 染色结果（图 2），对照组小鼠脑结构完整，神经胶质细胞均匀分布；NMOSD 组小鼠脑组织中有大量炎性细胞浸润，有部分细胞核固缩，病理学评分为（2.830.41）分；与 NMOSD 组比较，TSKEP 组小鼠脑组织中炎性细胞浸润程度明显减轻，病理学评分（1.330.52）分 明显降低（P0.05）。2.3TSKEP 中潜在活性成分及靶点中潜在活性成分及靶点根据 OB30%、DL0.18 的条件在 TCMSP 数据库中进行*P0.01 vs NMOSD group.图图 1各组小鼠神经功能评分各组小鼠神经功能评分Fig.1 Neurological function scores of mice in various groupsA：Control group；B：NMOSD group；C：TSKEP group.图图 2各组小鼠大脑组织病理形态表现各组小鼠大脑组织病理形态表现（HE，100）Fig.2Pathomorphology of brain tissue of mice in various groups(HE，100)265第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）检索，剔除重复项后 TSKEP 中共得到 304 个活性化合物和 655个有效活性成分对应的靶点。2.4 TSKEP 治 疗治 疗 NMOSD 的 潜 在 靶 点的 潜 在 靶 点 在DisGeNET、GeneCard、OMIM 和 Drugbank 数 据库中分别检索到 171、171、84和 3个 NMOSD相关的靶点，删除重复项后共得到 358个疾病靶点。将疾病靶点与药物靶点取交集，共获得 TSKEP 治疗NMOSD的潜在靶点 43个。见图 3。2.5 化 合 物化 合 物-靶 点 网 络 的 构 建靶 点 网 络 的 构 建 通 过 Cytoscape 3.6.0 软件对化合物-靶点网络进行拓扑分析，以degree 值和 CC 值作为拓扑分析的主要参考指标，结 合 degree 值 和 CC 值 筛 选，包 括 槲 皮 素（Quercetin）、山 柰 酸（Kaempferol）和 木 犀 草 素（Luteolin）等在内的 12 种化合物，均 具 有 较 高 的degree 值 和 CC 值，可能是 TSKEP 治疗 NMOSD的核心活性成分。见表 1。2.6GO 和和 KEGG 富集分析富集分析以 P 值作为筛选条件并按照 P 值大小进行排列，GO 功能富集分析分别选取 BP、CC 和 MF 的 前 20 条 通 路 进 行 展 示（图 4AC），TSKEP 治疗 NMOSD 主要作用于以下环节：对外界刺激的反应调控、对有机物质反应及对化学刺激的细胞应答反应等生物过程；细胞外间隙、细胞外区部分及细胞组分、胞浆内部分等细胞组成；细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性、受体调节活性、分子功能调控和信号受体结合等分子功能等。以 P0.05作为筛选条件并按照 P 值大小展示前 20 条 KEGG 通路（图 4D），共同靶点主要通过细胞因子受体相互作用、Toll 样 受 体（Toll-like receptor）信 号 通 路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Jak-STAT 信号通路和核因子 B（nuclear factor-kappa B，NF-B）信号通路等多条信号通路在 NMOSD 的治疗中发挥重要作用。见表 2。2.7靶点靶点-通路网络构建通路网络构建将 14 条显著富集的信号通路及对应的靶点导入到 Cytoscape 3.6.0 软件中，得到靶点-通路网络图（图 5）。根据 degree 值筛选核心成分，结果提示IL-6、IL-1、TNF、IL-4和 PIK3CA 等 degree值较高，可能在中药复方治疗NMOSD中发挥主要作用。2.8分子对接分子对接将 9个核心靶点（IL-6、TNF-和IL-1 等）与 10 个核心化合物（槲皮素、芹菜素、大豆黄酮和木犀草素等）进行分子对接来评估化合物与靶点的结合能力。结果提示：所有对接结合能均5 kcal mol1，说明核心靶点与核心化合物之间具有较好的亲和力。其中，IL-6 与槲皮素、ALB 与芹菜素、IL-10 与豆甾醇、IL-1 与木犀草素、C-X-C 基 序 趋 化 因 子 配 体 10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）与-谷甾醇之间具有 相对 较好 的结 合能 力，部 分分 子对 接模 式图见图 6。2.9各组小鼠血清中细胞因子水平各组小鼠血清中细胞因子水平造模后第 5、15 和 30 天，与正常组比较，模 型 组 小 鼠 血 清 中IL-6、TNF-和 IL-17 水平明显升高（P0.01），IL-10水平明显降低（P0.01）；与 NMOSD 组比较，TSKEP 组 小 鼠 血 清 中 IL-6、TNF-和IL-17水平明显降低（P0.05或 P0.01），IL-10水平明显升高（P0.01）。见图 7。图图 3655 个药物靶点个药物靶点（A）和和 358 个疾病靶点个疾病靶点（B）的共同靶的共同靶点基因点基因Fig.3Common target genes of 655 drug targets(A)and 358 disease targets(B)表表 1TSKEP核心化合物的相关参数核心化合物的相关参数TabTab.1 1Related parameters of core compounds of TSKEPRelated parameters of core compounds of TSKEPMOL IDMOL000098MOL000422MOL000449MOL000050MOL000008MOL000390MOL008583MOL000006MOL000069MOL000785MOL001454MOL008400CompoundQuercetinKaempferolStigmasterolGLYApigeninDaidzeinbeta-sitosterolLuteolinpalmitic acidpalmatineBerberineglyciteinDegree870171162110 75 64 63 55 52 48 45 42OB(/%)46.4341.8843.8348.7423.0619.4436.9136.1619.3064.636.8650.48DL0.280.240.760.000.210.190.750.250.100.650.780.24CC0.420.380.370.380.370.360.370.360.350.350.350.34266宫玉霜，等.温补脾肾经验方治疗视神经脊髓炎谱系疾病作用机制的网络药理学分析3 讨 论 本研究首先对 TSKEP 治疗 NMOSD 的效果进行了实验验证，结果显示：TSKEP 可以明显减缓NMOSD 模型小鼠的神经功能障碍，降低脑组织中炎性细胞的浸润程度，下调血清中炎性因子水平，表明 TSKEP 在治疗 NMOSD 方面具有一定的效A-C：GO enrichment analysis；D：KEGG enrichment analysis；A：Biological process analysis；B：Cellular component analysis；C：Molecular function analysis.图图 443个候选靶点的个候选靶点的 GO和和 KEGG富集分析富集分析Fig.4GO and KEGG enrichment analysis of 43 candidate targets表表 2核心靶点的核心靶点的 KEGG代谢通路相关参数代谢通路相关参数TabTab.2 2Related parameters of KEGG metabolic pathways of core targets Related parameters of KEGG metabolic pathways of core targets KEGG metabolic pathwayCytokine-cytokine receptor interactionToll-like receptor signaling pathwayIL-17 signaling pathwayTNF signaling pathwayJak-STAT signaling pathwayNF-kappa B signaling pathwayC-type lectin receptor signaling pathwayIntestinal immune network for IgA productionPI3K-Akt signaling pathwayHuma