新德里金属β-内酰胺酶-1的表达、纯化与活性测试_王伊雪.pdf

宝鸡文理学院学报（自然科学版），第 卷，第期，第 ，页，年 月 （），：新德里金属内酰胺酶的表达、纯化与活性测试王伊雪，蒋越，施洋，翟乐（宝鸡文理学院 化学化工学院，陕西 宝鸡 ）摘要：目的通过.（）系统对重组质粒 进行表达，纯化得到新德里金属内酰胺酶（，），为新型 抑制剂的生物活性评价提供物质条件。方法将 重组质粒转化后，在.（）中进行诱导、表达；通过快速蛋白液相色谱系统，利用含氯化钠缓冲溶液对目标蛋白进行洗脱并以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（，）检测纯度；利用稳态动力学研究方法，通过测定 催化头孢唑啉钠水解反应的初速率以及乙二胺四乙酸（，）对该反应的半数抑制浓度（，），验证并评价所制备 的生物活性。结果 及 表征结果显示，所制备 分子量正确，纯度大于；稳态酶动力学活性鉴定结果表明，所得 催化活性良好，水解头孢类内酰胺抗生素头孢唑啉钠能力强，速率快，对该 催化底物水解反应的 。结论表达、纯化所得金属内酰胺酶 具有优良的催化活性，可用以评价新型 抑制剂的抑制效果。关键词：细菌耐药性；新德里金属内酰胺酶；内酰胺抗生素；稳态动力学中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：.（）（）.（）（）收稿日期：，修回日期：基金项目：陕西省创新能力支撑计划科技创新团队项目（）；陕西省教育厅重点科学研究计划（重点实验室）项目（）作者简介：王伊雪（），女，陕西渭南人，在读硕士研究生，研究方向：金属内酰胺酶抑制剂的合成及活性评价 ：通讯作者：翟乐（），男，陕西宝鸡人，讲师，博士，硕士生导师，研究方向：细菌耐药性遏制、创新药物研发 ：（），：；年英国微生物学家 意外发现一种 可 以 抑 制 细 菌 生 长 的 化 学 物 质，随 后 等将其界定为内酰胺类化合物，并将活性成分青霉素成功分离、纯化。目前研究人员已经开发出若干类具有临床医疗价值的抗生素。它们通常经由抑制细菌细胞壁的合成、改变细菌细胞膜的通透性、抑制关键蛋白质的表达、阻碍 的转录和复制或改变细菌细胞的正常代谢等机制实现对细菌的杀灭作用。根据化学结构的不同可以分为内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类以及氯霉素类等，其中以内酰胺类抗生素应用最为广泛。所有内酰胺类抗生素均含有个内酰胺四元环，通过界定该环的外围化学结构，内酰胺类抗生素可进一步划分为青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类以及单环内酰胺类（典型结构如图所示）。图典型内酰胺类抗生素的结构 内酰胺类抗生素以其价格适宜且有效而被广泛用于应对革兰氏阴性和阳性细菌引发的感染。然而，该类抗生素在临床、农业和畜牧业方面的过度使用导致大量产内酰胺酶（，）的耐药细菌产生。这些耐药细菌通过破坏内酰胺四元环结构来抵抗几乎所有的内酰胺类抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类、以及被誉为“最后一道防线”的碳青霉烯类抗生素。内酰胺酶包括丝氨酸内酰胺酶（，）和金属内酰胺酶（，）。对产 的耐药细菌感染，目前临床上已有如克拉维酸（批准的第一个 抑制剂）、舒巴坦等 抑制剂与抗生素联用来治疗。然而，携带 的耐药细菌（也称超级细菌）水解几乎所有内酰胺类抗生素，迄今 却 尚 无 任 何 酶 抑 制 剂药 物 可 用 以 应对。通过活性位点的丝氨酸残基水解内酰胺抗生素的四元环。则通过其活性中心的（）来催化内酰胺抗生素水解。内酰胺酶数据库数据显示，目前已有 种 被报道，依据其活性中心（）个数的不同，被进一步划分为，和 个亚组，其中 亚组酶活性中心含有个（），例如新德里金属内酰胺酶（，）、及 等；亚组酶活性中心仅含有个（），例如 、及 等；亚组酶活性中心含有个（），例如 等。相较于 和，酶的水解底物谱较窄，通常只能水解碳青霉烯类抗生素，而 和 酶可以水解除单环内酰胺类以外的所有内酰胺类抗生素。年英国卡迪夫大学 团队首次报道 亚组超级细菌关键酶 。由于 基因在全球范围内传播迅猛且传染性极高，该基因所表达的 几乎能水解所有内酰胺类抗生素，此后围绕以 为代表的 抑制研究引起广泛重视 。近年来，临床上分离到产 的耐药菌种类明显增加，如肺炎克雷伯菌、超广谱内酰胺酶（）大肠杆菌以及携带 的超级细菌等，其耐药性越来越强。此外，新冠疫情期间，消宝鸡文理学院学报（自然科学版）年毒灭菌药品的大量使用，多重耐药细菌对 患者感染的增加，进一步加剧了耐药细菌的产生及传播，进而严重威胁人类健康，。应对 介 导 超 级 细 菌 的 有 效 策 略 是 开 发 抑制剂以恢复内酰胺的杀菌活性。而 纯蛋白的取得是该策略的重要一环，本文主要通过对.（）所含重组质粒 的表达，联合多种纯化手段，获取金属内酰胺酶，并对其纯度、催化活性展开评价，以期为新型 抑制剂的生物活性评价提供物质条件。实验部分含有 基因的 重组质粒受赠于西北大学杨科武教授。.（）购买于陕西省微生物研究所。硫酸卡那霉素（，）、三羟甲基氨基甲烷（，）、异 丙基硫代半乳糖苷（，）、十二烷基硫酸钠（，）、二硫苏糖醇（，）等 购 买 于 科 昊 生 物 工 程 有 限 公 司。高速冷冻离心机购买于美国 公司。分光光度计购买于美国 公司。购买于美国 公司。生物安全柜及超低温冰箱（）购买于美国 公司。恒温细菌培养箱购买于德国 公司。金属内酰胺酶 的表达与纯化本实验使用重组质粒 来表达 。所涉及细菌的转移操作（单克隆体或者菌液）均在 生物安全柜中完成。将重组质粒 电击导入感受态.（）。取该细菌菌液涂布于含有 的 琼脂培养平皿上，恒温培养（）进行单克隆和杂菌筛除。次日在该 琼脂培养平皿上挑取阳性单克隆体于 含有 的 液体培养基中，振荡培养过夜。第三日，取该菌液均匀涂布于含有 的 琼脂培养平皿上，置入 恒温细菌培养箱中 培养过夜。第四日，选取一个生长良好的单克隆体接种于 含有 的 培养液中，在恒温摇床上 以 培养过夜。第五日，将过夜培养的菌液分别接种于含有 的 培养基中扩大培养，设置摇床振荡速度 ，当细菌在 下恒温振摇培养到 时，分别向个菌瓶中加入 的 溶液诱导蛋白表达，相同条件下继续恒温振摇培养。将菌液转移至离心菌瓶中，以 的转速在下离心 收获菌体。去除上清液，用 缓冲溶液将菌体重悬，利用细胞超声破碎 仪 于 超声 波破碎 菌体。所得 溶 液 以 的转速在下离心 除去细胞碎片。将含有目标蛋白的上清液转移至透析袋中，浸泡在装有磁子的 缓冲溶液中透析。第六日，将透析完成后的体系于 条件下以 的转速离心 除去不溶物，收集上清液备用。在安装有 阴离子交换树脂纯化柱的蛋白快速液相色谱系统（，）中，使用 缓冲溶液以 的流速进行预平衡。实时监测 值至数值稳定，以 的流速缓慢注入前述蛋白清液，以使蛋白与填料紧密结合。待 值不变后，以 的流速使用含氯化钠缓冲溶液进行 的线性梯度洗脱。设置含氯化钠缓冲溶液在 内梯度由逐渐增大到 ，实时监测 处的 值，同时设置 对洗脱溶液进行收集。对照洗脱过程中的 变化，收集其中含有 的组分。对需要进一步纯化的酶溶液，可浓缩至约，通过 滤膜后进一步经由 排阻色谱柱进行纯化。金属内酰胺酶 的表征及生物活性评价 的 表征从含有 的试管中各取 溶液，分别加入至含 凝胶上样缓冲液的 管中，涡旋均匀后，置入沸水中保温 后取出。各取 按所设计顺序加入泳道中。打开电泳仪，待电泳条带到达底部时，结束电泳。小心取出胶片，用蒸馏水冲洗干净后放入染色剂中振荡染色。染色完成后将胶片取出并冲洗干净，放入脱色剂中，振荡脱色 后可直接观察胶片。第期王伊雪 等新德里金属内酰胺酶的表达、纯化与活性测试 的 表征向 石英比色皿中加入 缓冲溶液，在 分光光度计标准界面下，扣除空白。洗涤并干燥比色皿，取纯化所得 溶液加入其中，测定 处的 吸收。若在 处出现明确吸收，结合电泳结果可证明 的存在并可根据朗伯比尔定律计算所得 的准确浓度。稳态动力学表征及活性测试配制浓度为 的头孢唑啉钠溶液 。在 分光光度计稳态动力学界面下，向石英比色皿中依次加入 缓冲溶液和底物溶液，扣除空白。设定监测波长为 ，监测频率为每次，监测时长为。移取 溶 液，搅 拌 下 加 入 体 系，随 即 对 催化头孢唑啉钠水解反应的初速率进行监测。取前 的线性数据作为计算依据，每组平行测定次，以保证重现性。保持室温恒定（），以传统金属螯合剂乙二胺四乙酸（，）作为 抑制剂，以头孢唑啉钠作为底物，利用 分光光度计开展稳态酶抑制动力学实验。通过测定 对 催化头孢唑啉钠水解反应的半数抑制浓度（，）来综合评价所得 的生物活性。在 分光光度计标准界面下，使用 缓冲溶液调整 溶液及头孢唑啉钠溶液浓度。向石英比色皿中依次加入 缓冲溶液和底物溶液，扣除空白。设定监测波长为 ，监测频率为每次，监测时长为。准确移取 溶液，搅拌下加入体系，随即对 催化头孢唑啉钠水解反应的初速率进行监测。取前 的线性数据作为计算依据，每组实验平行测定次，将平行实验所获取反应速率均值记为 。向石英比色皿中加入对应体积的 缓冲溶液和底物溶液，扣除空白后，准确移取 与 的孵育溶液，搅拌下加入体系，随即对 催化头孢唑啉钠水解反应的初速率进行监测。取前 的线性数据作为计算依据，将次平行实验所获取反应速率均值记为 。结果与讨论 细菌培养条件对 表达的影响在.（）培养过程中，接种量、培养基 值、摇床的振荡速度、培养温度、诱导时间等对 的产量均会产生影响。在实验开始之前，应保证接种环境绝对无菌：使用生物安全柜前须开启紫外灯消毒；实验过程中使用的菌管、培养平皿、枪头、管等均须高温蒸汽灭菌；操作者所配戴的一次性丁腈手套亦须使用 酒 精 消 毒。在 接 种.（）之前，应严格按照实验部分所描述的步骤进行操作，任何遗漏或者跳跃，均会导致.（）中不含有重组质粒 或工程菌被杂菌污染，从而致使无 生产或产率降低。在 恒温细菌培养箱中培养.（）时，需将培养平皿倒置，防止水分蒸发形成的水滴滴落在培养基上污染菌落，导致后续 产率降低。加 入 诱导 表达的时机应把握 在 之间，因该区间为.（）的对数生长期，在此期间繁殖数量最多。若错过其最佳生长期会导致后续 产率降低。纯化前后的 监测与 表征在本研究中，本文采用离子交换色谱联合分子排阻色谱法对 进行纯化。目标蛋白 的等电点 ，故选取 阴离子 交 换 树 脂 作 为 色 谱 柱 填 料。为 了 监 测 表达、纯化各个过程中的含量信息，本文对不同阶段的表达体系进行采样并开展了 跟踪工作，其结果如图所示。图 表达过程中的 跟踪 图中的泳道分别是：预染分子量 （泳道），接种前菌液（泳道），诱导前菌液（泳宝鸡文理学院学报（自然科学版）年道），诱导后菌液（泳道），诱导后菌液（泳道），细菌超声破碎后（泳道），透析前上清液（泳道），透析后上清液（泳道）。从图中可以看到，未接种以及未诱导的菌液之中不含有 。当 加入发酵体系后，可观察到 间出现微弱斑点（泳道），揭示.（）开始启动重组质粒 的表达并分泌 至细菌培养液中。但由于体系较大，加之诱导时间不足，故含量较低，及至后，可观察到对应含量有所提升（泳道）。当离心收集.（）并破碎后，细菌细胞内的大量蛋白被释放，故泳道可观察 到 密 集 的 蛋 白 斑 点 出 现，且 经 过 富 集，含量明显提升。对比泳道，泳道中杂蛋白急剧降低，是因为体系经过了低温、高速、长时间离心处理并洗涤，细胞碎片被除去，得到了初步纯化，但在 之间依然可以观察到杂质。因此，对该体系进行了半透膜透析处理，从泳道可以看出 得到了进一步纯化，但纯度依然不能满足要求。故后续对该体系 进 行 了 柱 纯 化，该 步 骤 经 由 完成，当使用含氯化钠缓冲溶液对富集在阴离子交换树脂上的 进行 的线性梯度洗脱过程中，所反馈出的 监测数据如图所示（）。图 纯化过程中的 监测图 由图可知，第 时（氯化钠含量由 开始提升），吸附在 填料中的蛋白开始被洗脱，直至 时 吸收回归基线。图同时定性地指出，第 管，第 管，第 管（图中的横坐标轴上的数字），分别对应不同种类的蛋白质。因此，本文对其进行了 表征、鉴定工作，实验结果如图，其中数字所指代的泳道对应图中的管数。图 在不同纯化阶段的 跟踪 表征结果显示，目标蛋白 位于 处，与文献 相符。经过 填料吸附后，当氯化钠含量约为 时，被 洗 脱，对 应 第 管 含 有 高 浓 度 且纯度依次提升，而第管不含有目标蛋白。据此，本文将所收集含 的溶液进行合并处理并进行高压浓缩，再经 凝胶过滤纯化后，得到纯度大于 的目标蛋白（图，泳道，），同时对该纯蛋白进行了 表征，结果如图所示。的 表征图谱进一步验证了其纯度：在 及 均观察到了 的固有吸收峰，且体系无其他杂质峰。根据该吸收强度，本文通过计算得出所制备 的浓度约为（总体积约）。的催化活性测试 可以高效催化头孢唑啉钠的内酰胺四元环开环水解，致其特征紫外吸收改变（监测波长 ），而该变化与头孢唑啉钠的含量正相关。因此，可通过监测酶催化其底物水解过程中的特征吸收强度的改变速率来评价所得 的催化活性。本研究选择对该催化水解反应的初速率进行监测。借助 分第期王伊雪 等新德里金属内酰胺酶的表达、纯化与活性测试光光度计动力学模块，按照表所列数值，在监测波长为 ，监测频率为每次，监测时长为 等条件下，取 稀释后的 溶液，对不同浓度头孢唑啉钠水解反应的初速率进行监测。图纯净 的 表征 表稳态动力学实验中各溶液的体积数（）（）编号 缓冲溶液 头孢唑啉钠 稳态动力学实验结果显示，当石英比色皿中 终浓度为 ，头孢唑啉钠终浓度为 时，催化头孢唑啉钠水解反应前 的初速率为（）。可见，所得 对其底物头孢唑啉钠的水解具有良好的催化活性。传统金属螯合剂 可通过对 活性中心（）的摘除实现其抑制效果（）。因此，本文对新制备的 开展了 抑制研究，以确保后续新型 抑制剂评价实验的准确性。该设想通过测定 对 催化头孢唑啉钠水解反应的 值来实现。在 分光光度计稳态动力学界面下，按照表第组所列数值，向石英比色皿中依次加入 缓冲溶液和底物溶液，扣除空白。参考催化活性测试所取得的实验参数，移取 溶液，对其催化头孢唑啉钠水解反应的初速率进行监测，得到 数据。相同条件下，按照表第组对应数据向石英比色皿中依次加入 缓冲溶液和底物溶液，扣除空白后，移取相应体积的 与 的孵育溶液（孵育时长为 ），搅拌下加入体系，随即对 催化头孢唑啉钠水解反应的初速率进行监测，得到 数据。被 抑制后，的残余活性可通过以下公式计算：表稳态酶抑制动力学实验中各溶液的体积数 组别 稳态动力学实验结果指出，所制备的 可以高效催化头孢唑啉钠水解；当 作为抑制剂与 孵育 后，该 的催化能力伴随抑制剂的浓度提升而明确下降。由稳态酶抑制动力学数据拟合所得 对 催化头孢唑啉钠水解反应的 ，拟合曲线如图所示。图 抑制 催化头孢唑啉钠水解反应的 曲线 可见，对所得 具有明确的抑制活性（）。该结果证明，通过前述方法表达、纯化 所 得 可 以 用 来 准 确 评 价 新 型 抑制剂的抑制活性。结论（）本研究通过.（）系统成宝鸡文理学院学报（自然科学版）年功完成重组质粒 的表达，经菌体富集、破碎、透析及 联合 柱纯化后，获得浓度为 的 溶液 ，其 纯 度 大 于 ，且 得 到 、表征确认。（）表达、纯化所得 具有优良的催化活性，能够快速水解头孢类内酰胺抗生素头孢唑啉钠：当 终浓度为 ，头孢唑啉钠终浓度为 时，该酶催化其底物水解反应前 的初速率为（）；对该酶催化底物水解反应的 ，证明所得 可准 确评价 新型 抑制剂的抑制效果。参考文献：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：史祥睿，代宇婕，张弢，等基于分子对接的 与 分子动力学模拟研究化学通报，（）：王玺，李彬春，张晟，等 氨曲南竞争性抑制 对内酰胺类抗生素的水解 山西大学学报（自然科学版），（）：，（）：（下转第 页）第期王伊雪 等新德里金属内酰胺酶的表达、纯化与活性测试 ，（）：李奕霏，杜忠泽，朱晓雅，等镁合金板材轧制润滑技术的研究进展 热加工工艺，（）：，：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，：韩云燕，范晓丽，凡明锦，等多库酯类离子液体作为镁合金润滑剂的摩擦学性能及机理研究 摩擦学学报，（）：，（，），（）：，（）：，（）：（编校：顾洪溪）（上接第 页），（）：，（）：，（）：，（），：（编校：顾洪溪）宝鸡文理学院学报（自然科学版）年