响应面法优化超声辅助提取北柴胡黄酮工艺及抗氧化活性_任倩倩.pdf

北方园艺 （）：贮藏加工检测第一作者简介：任倩倩（），女，硕士研究生，研究方向为中药材综合开发利用。：责任作者：赵敏（），女，硕士，教授，现主要从事中药材综 合 开 发 利 用 等 研 究 工 作。：基金项目：河北省重点研发计划资助项目（，）；河 北 省 创 新 能 力 提 升 计 划 资 助 项 目（）；邯郸市科学技术研究与发展计划资助项目（）。收稿日期：响应面法优化超声辅助提取北柴胡黄酮工艺及抗氧化活性任 倩 倩，高朋，马 致 静，赵敏（河北工程大学 园林与生态工程学院，河北 邯郸 ）摘要：以北柴胡为试材，采用超声辅助法提取总黄酮，通过单因素试验和响应面试验优化提取工艺，研究了总黄酮对 自由基和 自由基的清除能力，以及不同部位柴胡总黄酮的含量，以期为开发利用柴胡提供参考依据。结果表明：试验模型极显著（），且模型预测值与真实值间拟合度较好（）。响应面优化超声辅助提取柴胡总黄酮最佳提取条件为超声温度，超声功率 、料液比 、乙醇浓度，柴胡总黄酮得率 ，与预测值（）吻合较好。柴胡不同部位总黄酮含量顺序为叶茎根，且不同部位总黄酮对 自由基和 自由基均具较强的清除作用。关键词：柴胡；黄酮；响应面法优化；超声辅助提取；抗氧化中图分类号：文献标识码：文章编号：（）北柴胡为伞形科柴胡属植物，具有抗炎解热、保肝利胆、抗病毒、提高免疫等功能。除皂苷类物质外，黄酮也是柴胡的主要活性成分。黄酮在自然界中广泛分布，具有抗抑郁、抗菌、抗肿瘤、降血脂、抗氧化且延缓衰老等药理活性，被广泛应用于医药、保健和化妆品等领域，有较高开发价值。等认为（欧洲）柴胡黄酮不仅抗氧化，且具保肝效果和抗疲劳作用，有效清除自由基，抑制自由基的产生。自 年我国饲料全面禁止添加抗生素以来，对中药材非药用部分开发利用的研究越来越多。研究表明北柴胡、狭叶柴胡及小黑柴胡全草均含有大量的黄酮类物质，其中茎、叶积累高于根部，且黄酮具有较高的抗氧化活性，对小鼠急性肝损伤具显著保护作用。关于柴胡黄酮类物质提取工艺的研究，多采用正交实验进行优化 ，而运用响应面法对北柴胡总黄酮提取工艺进行优化的研究尚鲜见报道。该研究以“冀柴号”全草为试材，采用超声辅助溶剂浸提法对北柴胡总黄酮进行提取，通过单因素筛选各因素最佳水平，利用响应面法优化总黄酮超声提取条件，并对“冀柴号”不同部位抗氧化活性进行评价（清除 自由基、自由基），以期为开发柴胡黄酮类制剂产品和综合开发利用提供参考依据。材料与方法 试验材料供试材料：北柴胡采自河北省涉县，经贺献林研究员鉴定为北柴胡（）“冀柴号”。于 年 月 日采收，阴干粉碎，过 目筛备用。供试试剂：芦丁（对照品），质量分数，购自美国 公司，、无水乙醇、甲醇、水溶性维生素等试剂均为分析纯。供试仪器：可见分光光度计（双光束紫外，北京普析通用仪器有限责任公司），高速粉碎机（，浙江屹立工贸有限公司），目筛，电子天平（，梅特勒托利多仪器有限公司），离心机（系列和赛默飞 ），舒美 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。图芦丁标准曲线 试验方法 标准曲线制作以芦丁标准品绘制标准曲线。取芦丁标准品 ，用 乙醇（水浴微热）配制终浓度为 标 准 芦 丁 对 照 液，稀 释 为 浓 度 、梯度溶液，取各梯度溶液 于 离心管，分别加入 乙醇，溶液 （混匀）室温反应（）；再加入 溶液（摇匀），室温反应 ；再加入 溶液（摇匀），室温显色 反应 ；于 波 长测定 吸光度 。以 吸 光 度 值 为 纵 坐 标、芦 丁 液 浓 度（）为横坐标，绘制标准曲线（图），得到质量浓度（）与吸光度（）的线性回归方程 ，线性关系良好。单因素试验利用超声辅助提取。精密称取“冀柴号”全草粉末 ，加入乙醇，超声提取 ，离心 ，上清液移至另一离心管，沉淀复提一次，将次上清液合并。分别以乙醇浓度、料液比、超声温度和功率等进行单因素（水平）筛选，以总黄酮含量（浸提液）为评价指标，四因素水 平：料 液 比（、）、功 率（、）、乙醇浓度（、）、温度（、）。单因素试验，分 别 以 料 液 比 、功 率 、乙醇浓度、温度 为固定值，各因素各水平重复检测次，按标准曲线的方法对样品浸提液显色反应，通过回归方程计算总黄酮含量。依次考察并确定个因素对黄酮提取率的影响。响应面试验优化设计使用 软件，结合 中心组合原理设计试验，以、代表自变量乙醇浓度（）、温度（）、料液比（）和功率（）的不同水平，黄酮提取率算作响应值，设计四因素三水平的响应面优化试验（表）。表响应面因素与水平 水平 因素 乙醇浓度温度料液比（）功率 项目测定 自由基清除率测定以最佳组合条件下提取的总黄酮溶液为母液，稀释成不同浓度 个梯度的样品液：、，吸取各样品液 ，加入浓度为 的 反应液 ，摇匀黑暗反应 ，于 处测定吸光值，以同样反应条件下甲醇反应液的吸光值作为空白对照，重复次。清除率（）（）（）。北方园艺月月（上上）式中：为样品的吸光值，为空白对照的吸光值。自由基清除能力测定参照张媛 阳离子脱色法稍有改进，检测柴胡提取液总抗氧化能力。储备液：取浓度为 的 二铵盐溶液 与同体积 水溶液（）混匀，黑暗反应（避光室温）。反应液：用无水乙醇将上述备液稀释成反应液，稀释浓度以样品液吸光值为 （）。溶液配制：用无水乙醇配制水溶性维生素（）标品溶液，浓度范围在 ，得 到 质量 浓 度（）与 清 除 率（）的 线 性 回 归 方 程 ，。取各浓度梯度标准品溶液 分别加入 反 应 液，静 置 （），测定吸光值，按式（）计算 清除率。空白对照以去离子水代替标准品溶液。清除率（）（）（）。式中：为样品的吸光值，为空白对照的吸光值。数据分析利用 软件进行数据统计分析，所有试验数据重复次取平均值，使用 软件绘制相应图表。结果与分析 单因素试验结果 乙醇浓度对超声提取的影响由图可知，乙醇浓度在 范围内，“冀柴号”全草总黄酮提取率随着乙醇浓度的增 加 呈 现 上 升 趋 势，浓 度 时 达 最 大 ，之后开始下降。说明乙醇浓度 时对黄酮类物质提取效果最佳。在一定乙醇浓度范围内随着浓度的升高，促进水溶性和醇溶性黄酮溶出，但当乙醇浓度过高时，极性强于黄酮的脂溶性物质（如有机色素）也会从细胞壁中渗出，与黄酮注：不同小写字母代表差异显著（）。下同。：图乙醇浓度对柴胡黄酮提取率的影响 发生拮抗反应，从而降低黄酮提取量。因此，选择 的乙醇浓度作为该因素最佳提取水平。温度对超声提取的影响由图可知，在 范围内，黄酮得率呈现先升高后下降的趋势，其中温度为 总黄酮达最大值 ，之后开始下降。可能是随着温度升高，分子热运动逐渐加大，使黄酮更加容易浸出。但是温度过高，导致总黄酮的某些热敏成分分解，造成黄酮含量下降。可见，柴胡全草的黄酮最佳提取温度为。图超声温度对柴胡黄酮提取率的影响 料液比对超声提取的影响由图可知，不同料液比对柴胡全草总黄酮提取量有一定影响，且料液比在一定范围内总黄酮得率随着料液比的增大逐渐升高，料液比 时总黄酮提取率最高为 ，之后开始下降。说明料液比较低时，提取第第期期 北方园艺液中总黄酮过饱和，不利于黄酮物质渗出，样品中仍有未浸出的黄酮物质；可见，料液比增加时，黄酮得率也会增加；但料液比过大，提取液极性改变，黄酮物质的溶解性降低。因此，料液比为 时提取总黄酮效果最好。图料液比对柴胡黄酮提取率的影响 功率对超声提取的影响由图可知，在 之间黄酮得率逐渐升高，功率为 时达最大值 。其原因可能是随着超声波功率不断增加，导致细胞膜（壁）结构破坏程度增大，且物质运动更加剧烈，黄酮类物质的溶出随之增加。但之后随功率升高，可能导致黄酮物质结构的改变，总黄酮得率呈下降趋势。说明超声功率在 时，柴胡全草黄酮类物质基本被溶出。图超声功率对柴胡黄酮提取率的影响 响应面优化试验结果 试验设计及结果在单因素试验基础上，确定响应面因素水平表（表），通过 软件分析，结合 中心组合原理，设计四因素三水平的中心组合试验方案（表）。试验共 组，表响应面设计方案与结果 序号 乙醇浓度 温度 料液比 （）功率 黄酮提取率 个中心点，每组次重复试验。回归模型的建立及分析通过 软件对试验结果拟合，回 归 方 程：。由表可知，值为 ，表示模型极显著；失拟项不显著（）；，模型预测情况接近于实际情况，拟合度较好。其中，、模型均为极显著，、之间的交互作用也为极显著；表现为显北方园艺月月（上上）表回归模型方差分析 来源 平方和 自由度 均方 显著性 模型 残差 失拟项 纯误差 总差 注：表示差异极显著（），表示差异显著（）。：（），（）著；其它模型系数均大于 ，对试验结果无显著影响。响应面分析响应面图中，坡面越陡，说明该图所对应的个因素的交互作用影响越大；越接近椭圆形的等高线图，交互作用越显著。从图可以看出，响应面图均是开口向下、呈凸面，且图 比图 坡面陡，图 比图 坡面陡；等高线图中椭圆程度排序为图 图 图，均与方差分析显示的 、交互作用的显著性一致。随着功率、乙醇浓度、温度和料液比的增加，黄酮提取率均呈现出先增加、达到最高点后下降的趋势。其中图 的响应面坡度较陡，说明功率和乙醇浓度的交互作用对黄酮提取率有较大的影响。明显可以看出乙醇浓度侧面的响应面曲线是比功率侧、温度侧和料液比侧更加陡峭的，也反映了乙醇浓度对黄酮提取率的影响是大于其它因素的，温度侧的曲线是最平缓的，也对应了温度对黄酮提取率的影响最小，与方差分析一致。最优提取条件及验证试验通过 软件分析，超声辅助 提 取 柴 胡 黄 酮 的 最 优 工 艺 是 乙 醇 浓 度 、温度 、功率 、料液比 ，软件预测该条件下的黄酮提取率为 。进行验证试验，结合实际，调整试验条件为乙醇浓度、温度 、功率 、料液比 ，实 际 测 黄 酮 提 取 率 为 ，与预测值非常接近，说明试验结果可靠。柴胡不同部位总黄酮积累量比较由图可知，柴胡根、茎、叶总黄酮含量有显著差异，含量顺序依次为：叶片茎杆根，叶片总黄酮积累量显著高于茎杆和根部，叶片总黄酮含量分别是根、茎的 、倍。可见，柴胡植株除了根部入药外，其地上部也具有较高的药用价值。柴胡总黄酮提取液抗氧化活性试验由图可知，柴胡不同部位总黄酮提取液均具有体外抗氧化活性，且总黄酮提取物对 的清除作用随其浓度的升高逐渐增强，说明总黄酮质量浓度与 清除率之间存在量效关系。通过方差分析可知，柴胡根、茎、叶提取液对 清除率也存在一定差异，相同质量浓度条第第期期 北方园艺图交互作用对柴胡黄酮提取率的影响 件下，叶的 清除能力最大，根的清除率最低，不同部位清除率顺序为叶茎根，与上述不同部位总黄酮含量变化趋势一致，说明黄酮含量多的部位对 的清除效果更加明显。且叶片提取液浓度在 时，叶片总黄酮提取液对 的清除率随着浓度的增加急剧上升，说明总黄酮对 自由基有较好的清除作用。提取液浓度达到 时，清 除 率 升 幅 缓 慢，均 大 于，至 时，趋于稳定。北方园艺月月（上上）图柴胡不同部位黄酮总含量 图黄酮提取液对 的清除效果 图黄酮提取液对 的清除效果 柴胡不同部位总黄酮提取液清除 自由基的效果样品提取液中黄酮含量与对 的清除能力正相关。由图可知，柴胡根、茎、叶总黄酮提取液对 自由基的清除能力有显著差异，茎、叶清除 自由基能力根系，且叶片总抗氧化 能 力 显 著 高 于 其 它 部 位，依 次 为：叶茎根。讨论与结论该试验采用超声辅助法提取北柴胡黄酮化合物，取代传统水浴浸提。该方法利用超声波的强烈冲击对细胞壁和细胞膜造成损伤，使黄酮类物质被更充分的浸提，且具效率高能耗低优点。通过单因素筛选试验，确定了影响黄酮提取率的个 主要 因 素 及 最 佳 水 平，在 此 基 础 上，建立了 响 应 面 四 因 素 三 水 平 回 归 模 型，分 析四因素间 的 交 互 作 用。优 化 后 提 取 工 艺 参 数为：乙醇浓度、温度、功率 、料液比 ，该条件下的黄酮提取率验证值 ，预测值为（）。通过对“冀柴号”根、茎、叶总黄酮提取率方差分析表明，各部位总黄酮含量达显著差异，地上部总黄酮含量显著高于根系，叶茎根，该结论与前人研究结果一致。柴胡以根入药，采收时茎叶多弃之不用，造成生物质资源浪费，因此，柴胡植株枯萎前期，重视对地上部分（茎和叶）采收，并进行精、深加工，提取黄酮类化合物，延伸柴胡产业链，实现资源综合开发利用。参考文献陈亚双，孙世伟柴胡化学成分及药理作用研究进展黑龙江医药，（）：马文兵，曹端林，王建龙，等北柴胡茎叶总黄酮提取工艺研究中药材，（）：宋林晓，邵娟娟黄酮类化合物提取方法研究进展粮食与油脂，（）：李萌茹，周玉枝，杜冠华，等中药黄酮类化合物抗衰老作用及其机制研究进展药学学报，（）：，（）：唐俊锋柴胡茎叶性味功效探讨光明中医，（）：丛登立，孟宪兰，李鹏飞柴胡茎叶总黄酮生物活性研究人参研究，（）：谭玲玲，蔡霞，胡正海 北柴胡各器官中总黄酮动态变化研究中草药，（）：谭玲玲，蔡霞，胡正海 狭叶柴胡中黄酮类化合物含量及其动态变化研究 南方农业学报，（）：詹雪晶，蔡霈，蔡光明，等小叶黑柴胡茎叶总黄酮对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用中南药学，（）：第第期期 北方园艺 刘秀芳，李婷婷，蔡光明，等 小叶黑柴胡茎叶总黄酮体外抗氧化活性的研究中南药学，（）：唐志国，王斌，张腾霄 柴胡中黄酮类化合物提取条件的研究黑龙江畜牧兽医，（）：段英姿，客绍英不同引种柴胡不同生长期地上部总黄酮含量比较研究中国药学杂志，（）：魏永生，王永宁，石玉平，等分光光度法测定总黄酮含量的实验条件研究 青海大学学报（自然科学版），（）：张子东，张圆圆，孟永斌，等 沙枣果总黄酮类化合物的富集研究植物研究，（）：张媛 和 转录因子对丹参醋酸类成分积累的影响 西安：陕西师范大学，赵定华山核桃内果皮黄酮提取、抗氧化及抑菌活性研究 杭州：浙江农林大学，成旭东树莓叶黄酮提取的工艺优化对比研究兰州：甘肃农业大学，高宁老山芹黄酮的提取、活性分析及调理馅料的研制哈尔滨：东北农业大学，黄丽华，陈刚赪桐叶的总黄酮提取工艺优化肇庆学院学报，（）：刘杨，赵婧，梁莉，等响应面优化蒲公英多酚超声波辅助乙醇提取 工 艺 及 其 抗 氧 化 性 食 品 工 业 科 技，（）：张桂芳，郭希娟，王瑞琦响应面法优化超声波辅助萃取蒲公英多酚的研究 中国医院药学杂志，（）：，（）：程玉鹏，李弘琨，马爱萍，等柴胡黄酮类抗氧化作用机制最新研究进展 化学工程师，（）：，（，）：，（），（），（）：；北方园艺月月（上上）