纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化_林艺华.pdf

2023，32（1）福建分析测试Fujian Analysis&Testing纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化林艺华1，肖海英2，林姿羽1，林美珍1*（1.漳州卫生职业学院，福建漳州363000；2.南安市仑苍镇卫生院，福建泉州362304）收稿日期：2022-8-16基本项目：漳州市自然科学基金项目（ZZ2020J07）；漳州卫生职业学院科技创新团队培育项目（Kjcx-3）作者简介：林艺华（1982），女，副教授，研究方向：天然药物化学成分提取分离与成析，Email：通讯作者：林美珍（1965），女，教授，研究方向为药用植物学。E-mail：摘要：目的：考察并优化纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺参数，建立生物酶提取金线莲多糖的方法。方法：采用酶提醇沉法提取、Savege法纯化金线莲多糖，并应用紫外-可见分光光度法检测金线莲多糖含量。通过试验考察酶添加量、酶解时间、PH缓冲液、酶解温度、料液比等对纤维素酶提取金线莲多糖效果的影响，选取各因素的最优试验范围，对纤维素酶提取金线莲多糖工艺进行优化。结果：金线莲多糖纤维素酶提取最佳条件为：酶添加量为5.0mL、酶解时间180min、PH6.6缓冲液、酶解温度65、料液比1：30。在最优提取工艺条件下，金线莲多糖提取率为20.93%。结论：本方法操作简单，快速，重复性好，可为生物酶提取金线莲多糖成分有效利用提供依据。关键词：南靖金线莲；纤维素酶；多糖；提取中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）01-0054-05Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.01.11Optimization of cellulase extraction technology of polysaccharides fromNanjing Anoectochilus roxburghiiLin Yi-hua1，Xiao Hai-ying2，Lin Zi-yu1，Lin Mei-zhen1*（1.Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou，Fujian 363000，China；2.Luncang Town Hospital，Nan an City，Quanzhou，Fujian 362304，China）Abstract:Objective：The technological parameters of cellulase extraction of Nanjing Anoectochilus roxburghii polysaccharide were optimized，and the method of enzymatic extraction was established.Methods：The polysaccharide of Nanjing Anoectochilus roxburghii was extracted by enzyme extraction and alcohol-precipitation method，purified by Savege method，and its content was detected by Uv-vis.The effects of enzyme dosage，enzymolysis time，PH buffer，enzymolysis temperature and solid-liquid ratio on the extraction of efficiency of Anoectochilus roxburghi polysaccharide by cellulase were investigated，and the optimum experimental range of each factor was selected to optimize the extraction process of Anoectochilus roxburghii polysaccharide by cellulase.Results：The optimum conditions for cellulase extraction of polysaccharides fromAnoectochilus roxburghii were as follows：5mL enzyme dosage，180min enzymolysis time，PH6.6 buffer，65 enzymolysistemperature，and solid-liquid ratio of 1：30.Under the optimum extraction conditions，the extraction rate of polysaccharidesfrom Anoectochilus roxburghii was 20.93%.Conclusion：The method is simple，rapid and reproducible，which can providea basis for the effective utilization of polysaccharide components extracted from Anoectochilus roxburghii by biological enzyme.Key words：Nanjing Anoectochilus roxburghii；cellulase；polysaccharide；extract542023，32（1）金线莲为兰科开唇兰属金线兰 Anoectochilusroxburghii（wall）Lind1.，别名：花叶开唇兰、虎头蕉、鸟人参、金石松、金不换等，主要分布在福建、广东、广西、江西、云南、台湾等地1。金线莲全草均可入药，性平、味甘、微苦，具有清热凉血、祛风利湿、平衡阴阳、扶正固本、生津养颜、润肺止咳、消肿解毒、止血降压、强心利尿等功效，享有“药王”、“金草”之美称2。金线莲为药食两用植物，在民间食用历史悠久，人们常用来煲汤或做成药膳食品等，尤其是在闽南、台湾等东南亚地区，当地居民把它当作神草。金线莲富含多糖、黄酮、甾体化合物、萜类化合物、氨基酸、有机酸、微量元素等多种成分，其中多糖是主要活性成分，具有调脂保肝、抗氧化、免疫调节、降血糖、抗炎、抗肿瘤等多种药效作用3。因此，金线莲多糖的保健功能受到越来越多学者关注。目前对金线莲多糖的提取包括溶剂提取法、稀酸提取法、碱液提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法等工艺4，其中酶提取法报道较少，酶提取法是利用生物酶破坏细胞结构，从而促使细胞内容物中化学成分释放出来的方法，具有高效、特异性强、操作流程简便、条件温和等优点5。因此本研究采用纤维素酶在实验优化条件下提取金线莲多糖，以期为后续生物酶提取金线莲多糖成分有效利用提供依据。1材料及仪器金线莲（福建省漳州市南靖草本养生生物科技有限公司），经鉴定，为兰科开唇兰属金线兰的干燥全草。葡萄糖标准品（北京索莱宝），纤维素酶（罗恩）、无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司出品；Lambda12紫外-可见分光光度计，BS110S电子天平，高速振荡器，数显恒温水浴锅，B600型低速自动平衡离心机等。2实验方法2.1金线莲粗多糖的提取6将预处理过的干燥金线莲粉碎，过100目筛，精密称取1.00g，加入不同体积的酶溶液，用不同PH缓冲液补至适量，分别在不同料液比、提取温度、酶解时间等条件下进行提取，提取后于100水浴中加热20min灭酶活性，冷却后，转移至离心管中4000r/min离心20min，取上清液，加4倍量无水乙醇，4静置过夜，得到粗多糖沉淀。2.2金线莲粗多糖的纯化将上述得到的粗多糖沉淀加适量蒸馏水溶解，采用Savege法7除蛋白，按照粗多糖溶液：Savege试剂（三氯甲烷：正丁醇=4：1）=5：1（v：v）的比例，混合后于振荡器强烈振荡20min，3000r/min离心10min，收集上清液，重复上述操作至少三次，直到没有明显的蛋白层出现，得到金线莲多糖样品溶液。2.3金线莲多糖的含量测定金线莲多糖的含量测定采用硫酸-苯酚法8、9，并稍作修改。2.3.1酶储备液的配制精密称取纤维素酶（1800U/mg）0.1416g，置于500ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成510U/mL酶储备液，放置冰箱备用，使用前摇匀。2.3.2对照品溶液的制备取经105干燥至恒重的无水葡萄糖14.20mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.142mg/mL的葡萄糖对照品溶液。2.3.3线性关系的考察分别精密量取葡萄糖对照品溶液 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml，置于10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液各1.00mL于具塞试管中，各精密加入5%的苯酚溶液2.00mL，混匀，再加浓硫酸5.00mL，摇匀，置40水浴下30min，于490nm处测定吸光度10，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，并得出回归方程。2.3.4样品的含量测定将“2.2”项下制备的金线莲多糖样品溶液准确稀释一定的倍数，吸取1.00mL溶液，按上述步骤操作，测吸光度值A，根据回归方程计算样品溶液中多糖浓度C，再根据以下公式计算金线莲多糖得率。金线莲多糖得率（%）=C V Dm 100其中，C为金线莲多糖样品溶液的浓度（mg/mL），V为定容体积（mL），D为稀释倍数，m为金线莲粉末质量（g）。2.3.5数据处理林艺华 等：纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化552023，32（1）福建分析测试技术交流实验数据采用SPSS22.0进行统计分析，XLS进行绘图。2.4金线莲多糖纤维素酶提取优化试验采用单因素实验，筛选出金线莲多糖最佳酶提取工艺，并进行验证。2.4.1不同酶添加量的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共5份，固定相同的料液比1：20、酶解温度55，酶解时间120min，考察酶添加量分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL时对多糖提取率的影响，按照“2.1”、“2.2”项下制备金线莲多糖样品溶液，根据“2.3.4”项含量测定方法进样分析。2.4.2不同酶解时间的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共7份，固定相同的酶添加量5.0mL、料液比1：20、酶解温度55，考察 酶 解 时 间 分 别 为 60、90、120、150、180、210、240min对多糖提取率的影响，按照上述方法进行提取分离与含量分析。2.4.3不同PH缓冲液的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共6份，固定相同的酶添加量5.0mL、料液比1：20、酶解温度55、酶解时间180min，考察添加PH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.6、7.0的缓冲液对多糖提取率的影响，按照上述方法进行提取分离与含量分析。2.4.4不同酶解温度的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共6份，固定相同的酶添加量 5.0mL、用 PH6.6缓冲溶液补充至料液比为1：20、酶解时间180min，考察酶解温度分别为40、50、55、60、65、70时对多糖提取率的影响，按照上述方法进行分析处理。2.4.5不同料液比的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共5份，固定酶解温度65、酶解时间180min，添加不同比例的酶溶液和PH6.6缓冲溶液，使其料液比为1：20、1：24、1：30、1：40、1：50，考察不同料液比对多糖提取率的影响，按照上述方法进行分析处理。2.5不同样品的含量测定精密称取预处理干燥后的不同批次金线莲粉末1.00g，共3份，根据实验条件优化后的提取方法制备样品溶液，按“2.3.4”项下方法在490nm处测定吸光度并计算含量，每份平行测定3次。三 批 金 线 莲 多 糖 的 含 量 分 别 为 20.00%、21.89%、20.90%，平均含量为20.93%。3结果与分析3.1葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线见图1。图1葡萄糖对照品溶液的标准曲线如 图 1 所 示，标 准 曲 线 的 回 归 方 程 为 A=6.9026C+0.0459，相关系数 R2=0.9995，在 0.0142mg/mL0.1420mg/mL 范围内线性关系良好，适用于多糖含量的测定。3.2不同酶添加量的影响不同酶添加量的结果见图2。图2不同酶添加量对多糖提取率的影响由图2可以看出，不同酶添加量对多糖的提取有一定的影响，在2.0mL3.0mL之间，提取率呈现明显增长趋势，在 3.0mL5.0mL 之间变化不大，但以5.0mL的提取率最高为4.48%。结果说明随着酶添加量升高，多糖提取率不断提高，达到一定量后变化小或基本不变，因为酶浓度增大到一定值时，多糖的纤维降解物、果胶降解物等大量存在，使多糖的溶解变得困难，同时酶添加量增大也会导致大量杂质进入提取液，使提取液的粘度变大，传质阻力变大，扩散速率变慢，多糖不易溶出。因此，确定最佳的酶添加量为5.0mL。3.3不同酶解时间的影响562023，32（1）不同酶解时间的结果见图3。图3不同酶解时间对多糖提取率的影响由图3可以看出，随着酶解时间逐渐增加，多糖的提取率呈增长趋势。酶解时间180min时，多糖的提取率达到最高值9.95%。随后多糖的提取率开始降低。因为当酶解达到一定时间时，酶底物得到充分反应，此时多糖的提取率为最大值。反应时间继续延长，反而影响到酶的活性。因此，确定多糖的酶解时间为180min。3.4不同PH缓冲液的影响不同PH缓冲液的结果见图4。图4不同PH缓冲液对多糖提取率的影响如图4所示，多糖提取率随PH升高呈现先平缓上升，当达到PH56.6之间，提取率速度上升，随后又迅速下降。这是因为纤维素酶由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、-葡萄糖苷酶三个组分构成11，PH过低会导致纤维素酶达不到催化底物作用，PH过高会引起酶活性及稳定性发生变化，降低了纤维素酶的活性，减弱了酶对植物细胞壁的破坏，使细胞内的多糖不能充分溶出。当PH6.6时，多糖提取率达到最大值12.11%。因此，确定酶解最适宜PH缓冲液为6.6。3.5不同酶解温度的影响不同酶解温度的结果见图5。由图5可以看出，随着酶解温度的逐渐升高，多图5不同酶解温度对多糖提取率的影响糖的提取率呈增长趋势。酶解温度达到65时，多糖的提取率最高7.89%，70时多糖的提取率开始降低。由于酶解温度过低时，纤维素酶活性受到抑制，不能完全发挥水解作用；温度过高时，酶产生不可逆失活，催化能力下降，不利于水解效果从而导致多糖提取率下降。因此酶解温度适宜控制在65。3.6不同料液比的影响不同料液比的结果见图6。图6不同料液比对多糖提取率的影响图6结果显示，随着料液比的逐渐增加，金线莲多糖的提取率呈增长趋势。料液比达到1：30后，金线莲多糖的提取率反而降低。料液比为1：30时，多糖的提取率为6.54%，达到最大值。因此酶解时的料液比适宜控制在1：30。4小结本实验采用生物酶解法提取南靖金线莲多糖的含量，通过纤维素酶分解-D-葡萄糖苷鍵，破坏植物细胞壁，使细胞中有效成分尽可能的释放，以提高提取率。在实验过程中考察不同酶添加量、不同酶解时间、不同PH缓冲液、不同酶解温度、不同料液比等因素对金线莲多糖酶提取的影响，优化金线莲多糖纤维素酶解法的提取条件为：最佳的酶添加量5.0mL、酶解时间为180min、最适宜PH缓冲液为6.6、林艺华 等：纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化572023，32（1）福建分析测试技术交流酶解温度65、酶解时的料液比适宜控制在1：30。参考文献1 刘英孟，张海燕，等.金线莲的研究进展J.中成药，2022，44（1）：186-192.2 关璟，王春兰，郭顺星.福建产金线莲中黄酮苷成分的研究J.中草药，2005，36（10）：1450-14533 赵丹洁，唐鹏，田冬梅，等.金线莲多糖提取及功能研究进展金线莲多糖纯化工艺及其抗氧化活性研究J.食品研究与开发，2021，42（20）：116-123.4 李仲达.金线莲多糖的提取及其性质研究D.仲恺农业工程学院硕士学位论文，2014.5 程贤，毕良武，赵振东，等.酶辅助提取技术在天然产物提取中的应用研究进展J.生物质化学工程，2016，50（3）：71-76.6 闫巧娟，韩鲁佳，汪正强，等.纤维素酶法提取黄芪多糖J.中草药，2005，36（12）：1804-1807.7 何美佳，刘晓，唐翠翠，等.多糖脱蛋白方法的研究进展J.中国海洋药物，2019，38（3）：82-86.8 曾碧玉，苏明华，陈清西，等.金线莲多糖的提取工艺优化J.热带作物学报，2016，37（3）：615-621.9 周晔，林泓，王健壮，等.响应面分析法优化金樱子多糖的酶提取工艺J.广东药学院学报，2014，30（6）：702-706.10 李菀，胡月，李光霞，等.纤维素酶和果胶酶提取对甘草渣多糖抗氧化和抗肿瘤性能的影响J.营养与保健，2020，41（9）：309-319.11 陈立弟.铁皮石斛多糖的提取、抗氧化活性及其多糖/介孔二氧化硅纳米粒的制备研究D.深圳大学硕士学位论文，2017.58