稀有OTU对海洋底栖纤毛虫群落异质性的影响研究_张越.pdf

20 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 稀有 OTU 对海洋底栖纤毛虫群落异质性的影响研究 张 越1,2,赵 峰2,3,4,孙梦岩2,3,李玉全1,徐奎栋2,3,4(1.青岛农业大学,山东 青岛 266109;2.中国科学院海洋研究所海洋生物分类与系统演化实验室,山东 青岛 266071;3.中国科学院大学,北京 100049;4.中国科学院海洋大科学研究中心,山东 青岛 266071)摘要:运用高通量测序技术分析微型生物多样性时,生物学重复间常表现出明显的异质性,这可能是高比例的稀有可操作分类单元(operated taxonomic unit,OTU)造成的“假象”。为明晰陆架海区站位间及同一站位重复间底栖纤毛虫群落的异质性水平,并探明稀有 OTU 与群落异质性的关系,给出去除稀有 OTU 阈值的科学建议。本研究在东海选取具有明显环境梯度的 4 个站位,每站位采集 3 个重复沉积物,采用高通量测序技术研究纤毛虫群落与分布。研究表明同一站位重复间群落不相似度在30%34%,重复间群落的高差异性会掩盖地理距离较近的站位间差异(33%)。各个站位重复间共有OTU 分别占该站位检获的总 OTU 数的 34.4%,31.9%,39.5%和 36.5%,而序列数基本占据 94%以上。相对丰度小于 0.1%的 OTU 占总 OTU 数的 80%。依次去除相对丰度低于 0.01%至 0.1%的 OTU,发现去除稀有 OTU 能够有效降低重复间差异,去除越稀有的 OTU,降低效果越强;对站位之间的差异影响较小,且站位差异越大影响越小。稀有 OTU 的分布随机性极强,基本与站位无关。相对丰度低于 0.015%的 OTU 是造成重复间群落异质性的主要原因,去除该部分 OTU 可更真实地展现底栖纤毛虫的群落异质性。关键词:海洋底栖纤毛虫;异质性;分子多样性;DNA 高通量测序;稀有 OTU 中图分类号:Q958 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2022)12-0020-11 DOI:10.11759/hykx20201124002 原生生物是海洋底栖生态系统的重要成员,是底栖微食物网中初级生产力向高营养级传递的重要媒介1。其中,底栖纤毛虫作为原生生物的一个主要类群,其形态多样,结构复杂,具有代表性。经典形态学的研究方法为认知底栖纤毛虫多样性奠定了基础,例如 Hausmann 等通过半定量培养的方法,在地中海东部海域沉积物中发现 35 种纤毛虫2;代仁海采用密度梯度离心-定量蛋白银染色法(Ludox-QPS)在春季长江口和东海检获了 278 种底栖纤毛虫3。然而,传统形态学方法的局限性仍限制着底栖纤毛虫的研究,如形态学鉴定需要极强的分类学基础;稀有类群个体少易被忽视,且难以培养,易造成多样性的低估等。随着分子生物学技术的发展,新一代测序技术为研究海洋底栖纤毛虫多样性提供了新的技术支撑。分子生物学手段克服了传统形态学方法的局限性,可以有效地检获底栖纤毛虫个体稀少及培养困难的物种,已有研究极大地扩展了对海洋底栖纤毛虫多样性的认识。如 Pawlowski 等在 4 g 沉积物中检获 630 余个纤毛虫 OTU(operated taxonomic unit,可操作分类单元)4。分子生物学工作发现,原生生物在百米到米级的空间范围内,甚至是生物学重复间,存在较高的异质性5-7。大型底栖生物群落也常表现出异质性的特点8-9,造成群落异质性的原因众说纷纭,一种是沉积物环境存在很高的异质性10,小尺度下的微生境孕育独特的底栖生物群落,进而呈现出明显的群落异质性。另一种可能则是分子手段的方法学的局限所引入的高异质性的“假象”,虽然分子手段在检获纤毛虫物种多样性,尤其是稀有类群,具有极大优势,但分子手段检获的 OTU 往 收稿日期:2020-11-24;修回日期:2021-02-08 基金项目:国家自然科学基金资助项目(41876171)Foundation:China Natural Science Foundation,No.41876171 作者简介:张越(1996),男,山东青岛人,硕士研究生,主要从事海洋真核微生物多样性研究,E-mail:;徐奎栋(1969),通信作者,研究员,主要从事海洋生物分类与进化及底栖生物生态学研究,E-mail:;李玉全(1978),通信作者,教授,主要从事养殖虾蟹类生态生理、群体改良方面的研究,E-mail: Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 21 往比形态学方法高出几个数量级11,而且绝大部分 OTU 都属于稀有类群。Zhao 等在潮间带、陆架到深海平原等生境,均检获了高比例的稀有 OTU,比例高达 80%12-13。通用的去噪和 OTU 聚类方法在去除 PCR 扩增和测序中产生错误的效能依然不足14,尤其是稀有 OTU 部分,因此这些 OTU 的真实性仍饱受怀疑15。高比例的稀有 OTU 与生物学重复之间的群落高异质性密切相关。然而目前仍未见稀有 OTU 与站位间和同一站位重复间群落异质性关系的研究。如何去除稀有 OTU 可真实展现群落异质性仍待解答。因此,本研究在东海选取 4 个具有明显环境梯度和距离梯度的站位,每个站设置 3 个重复,采用环境总DNA 提取和高通量测序技术,研究底栖纤毛虫群落结构及分布模式。并设置不同梯度,依次去除相对丰度低于 0.01%至 0.1%的 OTU,探明稀有 OTU 与群落异质性的关系,以期明晰陆架海区底栖纤毛虫群落站位间及同一站位重复间差异水平,并给出去除稀有 OTU 阈值的科学建议。1 材料与方法材料与方法 1.1 调查站位与样品采集调查站位与样品采集 本研究于 2019 年 5 月搭乘“向阳红 18 号”科学考察船在东海海域 A(295953N,1224153E),B(292819N,123520E),C(291012N,123394E)和 D(272711N,1221016E)四个站位进行样品采集(图 1)。利用 0.1 m2改进型的 Gray-Ohara 箱式采泥器,在每个站位采集 1 箱含有上覆水的未受扰动的沉积物,刮取 02 cm 表层沉积物约 20 g 放入封口袋中,每箱泥刮取 3 个重复样品。置于80 超低温冰箱中保存,以待后续 DNA 提取。1.2 DNA 提取及提取及 PCR 扩增扩增 采用 PowerSoil DNA isolation kit(Qiagen,Ger-many)试剂盒,提取沉积物 DNA。每个站位的 3 个重复样品,各取 0.3 g 沉积物,分别提取 DNA。获得的 12 份 DNA 样品(4 站位*3 重复),采用巢式 PCR 技术扩增纤毛虫的 18S rRNA 基因 V4 高变区16。使用的引物分别为纤毛虫特异性引物 Cil F、Cil R、Cil R、Cil R,以及真核微生物 18S V4 高变区通用引物 EukF、EukR。每个样品进行 3 次重复 PCR,混合后送测。图 1 采样站位图 Fig.1 Map of sampling sites PCR 反应体系及程序如下:第一步,采用纤毛虫特异性引物(Cil F、Cil R、Cil R、Cil R)进行扩增,反应体系如下:正反向引物各 0.5 L,模板1.5 L,Q5 高保真聚合酶 0.25 L,10 mmol/L dNTPs 0.5 L,Q5 Reaction Buffer 5 L,High GC Enhancer 5 L,最后使用双蒸水补齐至 25 L。反应流程如下:98 预变性 30 s;98 变性 45 s,58 退火 1 min,72 延伸 1 min,循环 35 次;最后 72 延伸 10 min,4 终止17。第二步,采用真核微生物 18S V4 高变区特异性引物(EukF、EukR),以第一步所得 PCR 产物为模板,反应体系如下:正反向引物各 1 L,模板 1.5 L,Q5高保真聚合酶 0.5 L,10 mmol/L dNTPs 1 L,Q5 Re-action Buffer 10 L,High GC Enhancer 10 L,最后使用双蒸水补齐至 50 L。反应流程如下:98 预变性30 s;98 变性 30 s,57 退火 45 s,72 延伸 1 min,循环 10 次;98 变性 30 s,49 退火 45 s,72 延伸1 min,循环25次;最后72 延伸5 min,4 终止18。1.3 测序以及序列数据分析测序以及序列数据分析 使用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物质量及片段长度,将同一个样品的 3 个 PCR 产物合并,最终 4 个站位,每站位 3 重复,共 12 个样品。22 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 样品送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司,采用 Illumina Hiseq 平台进行双端测序,使用 New England Biolabs 公司的 NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit(New England Biolabs,USA)试剂盒构建文库,文库经过 Qubit 定量和文库检测合格后,上机测序。测序完成后,下机数据根据 Barcode 序列和引物序列拆分出样品数据,截掉 Barcode 和引物序列。原始序列使用 FLASH(V1.2.7)拼接,得到原始标签(Raw Tags)19。使用 QIIME(V1.7.0)对上一步得到的 Raw Tags进行质量控制和过滤:1)质量控制:将 Raw Tags从连续的低质量值碱基数(默认长度为19)达到设定长度(默认长度值为 3)的第一个低质量碱基位点截断;2)过滤:经过质量控制的 Tags 数据集,将其中连续的高质量碱基长度低于Tags长度75%的Tags去掉20。之后使用 UCHIME 结合数据库进行比对以去除嵌合体序列,得到有效数据 Effective Tags21-22。对有效数据使用 UPARSE23进行处理。去冗余;去噪;以 97%的序列相似度进行 OTU 聚类。对获得的 OTU 代表序列与 Silva 数据库(v.123)采用基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)进行比对,对 OTU 的分类信息进行注释。相对丰度为每个类群的序列数占总序列数的比例;丰富度为每个类群的 OTU 数;相对丰富度为每个类群的 OTU 数占总 OTU 数的比例。1.4 数据统计分析数据统计分析 对于每个 OTU,计算其在各个站位内的相对丰度,由该 OTU 在各个站位内 3 个重复中所检获的序列数在 3 个重复内总序列中所占的比例表示。规定每个站位内 3 个重复中总相对丰度小于 0.1%的OTU 为稀有 OTU24。设置过滤梯度共计 15 个,包括不去除 OTU,去除相对丰度低于 0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%和 0.1%的 OTU。去掉各个站位内,相对丰度小于该梯度的 OTU,重新进行 Cluster 聚类分析,并通过 SIMPER 分析计算各个站位间和同一站位重复间的群落相似性和差异性,同时分析群落结构。使用 Past4.01 绘制稀释性曲线。使用 R 语言(R3.6.3)中的“fossil”和“vegan”包进行序列的标准化处理。使用 Venny2.1 绘制韦恩图。使用 Excel绘制条形图与折线图。使用 PRIMER v6 软件中的CLUSTER 功能分析样品间相似度与不相似度,原始数据进行 log(x+1)转化,其分析基于 Bray-Curtis 矩阵;SIMPROF 和 ANOSIM 功能分析群落结构差异是否显著。2 结果结果 2.1 基本测序数据基本测序数据 12个测序样本共获得586 016条序列,但是样品中检获了大量的属于舞毛亚纲和寡毛亚纲的浮游纤毛虫序列。为研究底栖纤毛虫的多样性与群落,去除了浮游纤毛虫的 OTU,剩余 208 220 条序列,平均每个样品 17 352 条,最高为 A1 号样品 25 646,最低为D3 号样品的 9 237。为保证样品间可比性,以 n=9 237 对数据进行标准化,之后分析均基于标准化后的数据。经标准化后,12 个样品共检获 1 295 个 OTU,其中 B1 最少为 344 个,C2 最多为 516 个。稀释性曲线显示,样品基本趋于饱和(图 2)。图 2 样本稀释性曲线 Fig.2 Rarefaction curve of all the samples Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 23 2.2 样品中纤毛虫的多样性构成和群落结构样品中纤毛虫的多样性构成和群落结构 标准化后数据所检获的纤毛虫隶属于 11 个纲,除篮口纲(Nassophorea)外,其他各纲均在所有样品中都有检获。把同一站位的重复样品合并,四个站位群落组成差异明显,A 站位裂口纲相对丰度最高,占 33.29%,其次为核残迹纲和前口纲,分别占 22.18%和 15.08%。B 站位最丰富的类群则是核残迹纲,序列相对丰度达 41.14%,其次为裂口纲和前口纲,占 19.39%和10.67%。C 站位裂口纲相对丰度最高,为 31.32%,和A 站位相似,但相对丰度第二高的类群则变成了旋唇纲,为 21.28%,寡膜纲和前口纲则又次之,但两者相对丰度较为接近,分别为 15.28%和 13.71%。D站位最丰富的类群也为裂口纲,相对丰度为 23.84%,寡膜纲为相对丰度第二高的类群,占 14.25%,旋唇纲和前口纲次之,分别为 12.93%和 12.29%。由于目前国际通用的 Silva 数据库序列信息仍不完善,D 站位中未能鉴定到纲一级水平的占比为 21.70%(图 3a)。图 3 各样品纤毛虫序列百分比、OTU 数和 OTU 百分比 Fig.3 Proportions of sequences and OTUs,and the number of OTUs of ciliate communities in each of the 12 sediment samples 24 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 将同一站位的重复样品分开,12 个样品各类群相对丰富度比较接近,仅有 D1 和 D3 样品叶咽纲丰富度明显增高(图 3b),同时这两个样品叶咽纲的相对丰度也较 D2 样品明显增高(图 3a)。各站位 3 个重复共有 OTU 占各站位所检获的总OTU 数的百分比最高为 39.5%最低为 31.9%(图 4),但共有 OTU 在该站位重复中所占序列数则最高为94.79%,最低为 85.34%,其中 A、B 和 C 站位共有OTU 序列数比例均为 94%以上,只有 D 站位较低。每个站位的特有 OTU 几乎全部在该站位属于稀有OTU,仅有叶咽纲的 2 个,肾形纲的 1 个 OTU 在 D站位中属丰富 OTU,均在 D2 号样品中未检出。图 4 各站位共有和特有 OTU 数 Fig.4 Proportion of unique and shared OTUs in three replicates of each site 2.3 站位间与同一站位重复间群落相似性站位间与同一站位重复间群落相似性 当重复合并时,进行 Cluster 分析显示,在 4 个站位中,A 和 B 两站位之间差异不显著(SIMPROF:P0.05)。而当将每个站位的 3 个重复分开,12 个样品共同进行 Cluster 分析时,结果显示 C 站位和 D 站位的 3 个重复能够各自成组,且组内差异不显著(SIMPROF:P0.05)(图 5a)。但组内相似性仍不高,C、D 两站位内平均相似性分别为 70.23%和 66.82%。A、B 两站位的重复之间分组混乱,如将 A、B 两站位的各自重复设为一组,根据 ANOSIM 检验,A、B 两组组间差异不显著(ANOSIM:R=0.333,P=0.1)。SIMPER分析显示 A、B 两组组内差异分别为 31%和 33%,而A、B 两组组间差异仅为 33%。2.4 按梯度去除稀有按梯度去除稀有OTU对群落异质性的影响对群落异质性的影响 总计检获的 1 297 个 OTU 中,有 255 个在全部12 个样品中仅检获一条序列。稀有 OTU 分布极不均匀,相对丰度小于 0.01%的 OTU 占总 OTU 数的 40%左右,占稀有 OTU 的 50%左右。但是其序列数仅占总序列数的不足 2%(图 6)。相对丰度小于 0.01%OTU聚类分析显示其各样品相似度均低于 20%且除 D 站位外均不成明显分组(图 5b)。Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 25 图 5 12个测序样本全序列和相对丰度小于 0.01%的 OTU聚类分析 Fig.5 Clustering and SIMPROF analyses based on total OTUs and the extremely rare OTUs with relative abundance lower than 0.01%.The groups with no significant difference are marked by red bars(P 0.05)注:红色显示差异不显著(P0.05)按 15 个梯度去掉各个站位内稀有 OTU,重新进行 Cluster 聚类分析,并通过 SIMPER 分析计算各个站位组间相似性和组间差异性,同时分析群落结构。以 0.01%和 0.1%两梯度为例说明去除稀有 OTU对群落异质性的影响。去除相对丰度低于 0.01%的序列:经标准化后每个站位 3 个重复总序列数为 27 711,故过滤强度为 0.01%时,仅去除了在 3 个重复中总序列数为 1 和 2 的 OTU。平均每个站位被过滤掉103 个 OTU,减少 23.5%。其中最多为 A2 样品,OTU数由 473 下降到 329,减少 144 个,最低为 D2 和 D3号样品,分别由 421 和 475 下降到 339 和 393,减少82个。序列数则平均仅减少 125,最高为 A2样品,减少 176,最低为 D2 样品,减少 98。Cluster 聚类分析显示,4 个站位的各自 3 个重复各成一组,分组变得 图 6 不同相对丰度 OTU 占总 OTU 百分比 Fig.6 Proportion of OTUs with various relative abundance 明确,组内相似度上升,A 组相似度由 69.21%上升到 77.29%,B 组相似度由 67.62%上升到 76.33%,C组相似度由 70.23%上升到 76.34%,D 组相似度由66.82%上升到 71.43%。组间差异受到的影响并不一致,其中 AB 两站位间组间差异由 33%下降到28.22%,下降明显,而其他组间差异下降幅度微小,甚至 B、D 两组的组间差异由 59.57%变为 59.75%,有微小上升。去除相对丰度低于 0.1%的序列:稀有 OTU 被全部过滤。所有 4 个站位重复间相似性增加到 80%以上,A、B 两个本身相似度较高的站位组间差异由33%下降到 21%,下降明显,而 AC、BC 站位间差异则有极小幅下降,AD、BD 和 CD 间差异反而有小幅上涨。通过记录每一次过滤后站位间和重复间异质性,以及样品 OTU 数及序列数的变化,绘制变化趋势图。重复间相似性随过滤变化趋势可以看出,组内相似性在过滤的一开始快速上升,随后上升速度趋于平缓。此后随着过滤强度的增加,降低异质性的效果逐渐降低(图 7a)。26 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 图 7 站位内相似性及站位间差异性随过滤的变化 Fig.7 Variations in community similarity between pairwise stations and dissimilarity among replicates of each site after re-moving the rare OTUs 站位间差异随过滤变化趋势可以看出,A、B 两站位的差异性在过滤的一开始明显下降,但随后趋于平缓,AC 和 AD 之间的差异性有小幅下降,但也随后趋于平缓,BC、BD 和 CD 间差异性基本处于维持不变的状态,甚至在中间几个梯度上出现了不明显的上升。但最终,随着过滤强度的增加,组间差异也最终趋于稳定,而其变化趋势与其本身差异大小有关(图 7b)。OTU 数则随着过滤在一开始大幅下降,随后下降趋势也逐渐减缓。序列数则一直保持相似的下降幅度,没有明显拐点。相对丰度 0.015%以下的 OTU数普遍占该样品检获的 OTU 数的 36.55%(最高为43.97%,最低为 30.52%)。整体上,去除相对丰度低于 0.015%的 OTU,显著提高了重复间群落相似度水平,又保证了站位间差异的稳定性,同时保留了大部分序列与 OTU。2.5 以黄海某样品数据为例验证过滤处理有效性以黄海某样品数据为例验证过滤处理有效性 选取 Huang 等25于 2015 年 8 月采集于北黄海冷水团及渤海的 4 个站位的底栖纤毛虫群落结构数据,该数据集的每个站位均具有两个生物学重复。以这 4 个站位的表层沉积物数据进行相似处理,由图可见重复间相似性和站位间差异性的变化趋势 Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 27 和东海样品具有一定的相似性,组内相似性都是较快上升,然后趋于平缓(图 8a);组间差异性则也是差异较大的基本不受影响,差异较低的随过滤会有一个明显的下降,然后趋于平缓(图 8b)。去除相对丰度低于 0.015%的 OTU,显著提高了重复间群落相似度水平,并可保证站位间差异的稳定性。去除后,各样品的 OTU 数平均下降 32.74%(10.17%48.72%),但仍高于形态学所检获物种数。图 8 黄海站位组内相似性及组间差异性随过滤的变化 Fig.8 Variations in community similarity between pairwise sites and dissimilarity among replicates of each site after removing the rare OTUs in the Yellow Sea 3 讨论讨论 3.1 底栖纤毛虫的群落异质性底栖纤毛虫的群落异质性 本研究检获了沉积物中纤毛虫群落的高异质性特点,同一站位 3 个重复共有 OTU仅占总 OTU数的不足 40%。前人研究沉积物中有孔虫多样性时,也检获了极高的群落异质性,仅有 12.25%到 30%的 OTU能够在同时 3 个重复样本中发现7。单一重复样本仅能检获总 OTU 多样性的 57.9%,该值介于 14.2%至88.9%之间7。而在本研究中,单个重复样品所能检获的 OTU 数平均为 64.3%(54.6%71.3%)。沉积物环境相比于水体,更容易形成微生境10,且由于底栖类群在沉积物环境中运动受限,也容易形成斑块化的分布模式。28 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 但是分子手段的方法学局限也可能引入高异质性的“假象”。分子手段检获的 OTU 往往比形态学方法高出几个数量级11,而且绝大部分 OTU 都属于稀有类群。高比例的稀有 OTU 与重复之间的高异质性密切相关。PCR 和测序过程中产生的错误序列,容易表现为仅在单个重复中极少量检出。并且有研究表明包含错误的序列可能是唯一的,而且会形成一个新的OTU26,这也可能是极低丰度特有OTU产生的原因之一。这也与本研究中稀有 OTU 分布的结果相符,最稀有的相对丰度低于 0.01%的 OTU 占总OTU 数的 40%,而序列数仅占 2%以下。绝大部分稀有 OTU 仅在一个重复检获,从而导致重复间高群落异质性。但是,目前仍有许多研究证明过去人们对沉积物中原生生物的多样性大大低估,如 Forster 等使用2.5 g 表层沉积物提取 RNA 进行扩增测序,根据丰富度预测,在测序工作中未检测到的 OTU 的比例为66.3%27。高通量测序后对序列的不同处理策略会使获得的 OTU 总数出现很大差异,但是其中的丰富类群则在各种方法中具有可重复性15。而测序产生的容易出错的序列常以低丰度出现27-28,随着序列数的增多,OTU 的真实性也在增加。增加测序深度能够明显降低技术重复间差异性29。3.2 过滤稀有过滤稀有 OTU 对重复间差异的影响对重复间差异的影响 过滤相对丰度较低的 OTU,能够有效降低重复间异质性,同时不影响或极小地影响站位间差异。随着从低相对丰度到高相对丰度逐渐过滤稀有 OTU,重复之间的相似性逐渐增高,说明去除稀有 OTU 确实有效降低了重复间异质性,但是随着过滤强度的增加,曲线逐渐平缓,其降低异质性的效果明显降低,拐点大致位于 0.015%处。丰富和稀有 OTU 对站位间差异的贡献有所不同,相互之间差异越大的站位,高丰度的 OTU 对其差异贡献越多,而随着其差异逐渐降低,稀有 OTU 对其差异的贡献则越多。本身相似性较高的 A、B 两站位,其差异性快速下降,随后趋于平缓,这是因为被过滤掉的稀有 OTU 对其差异性贡献较大,而相似性次之的AC和AD之间,差异性则随着过滤有小幅下降,随后仍趋于平缓。相似性最低的 CB、BD 和 CD 之间,其差异性未受过滤的影响,基本处于不变。而拐点则仍位于 0.015%左右。OTU 数随着过滤梯度变化的拐点仍大致位于0.015%。在相对丰度小于 0.015%的区间内,聚集了大量的 OTU,其数量远高于其他区间。在本研究中,由于标准化后每个样品的序列数为 9 237,故在站位内相对丰度小于 0.015%的 OTU 序列数最高仅为 4,这些 OTU 绝大多数都是无法在该站位所有 3 个重复中同时检出的特有 OTU。因此该区间内的 OTU 由测序和 PCR 扩增产生的错误序列可能性较高,导致了重复间虚高的差异性。合理去除低丰度 OTU,可更清晰地体现底栖纤毛虫群落分布的特点,获得底栖纤毛虫更加真实的分布模式。但是,过滤势必会降低高通量技术检获多样性的能力。而且稀有类群毫无疑问也是整个群落中的重要组成部分,并且可能具有和丰富类群截然不同的生态功能24,简单地去除低丰度的 OTU 必然会损失稀有OTU 所包含的生态信息。同时,来自不同生境,面向不同类群,以及不同的预处理可能都会影响过滤的阈值。因此通过设置多个过滤梯度,在过滤的过程中观察站位间及重复间异质性的变化,确定合适的阈值,可为采样量较少或者站位仅有单一样品研究提供科学指导。此外,也有许多研究致力于从更精细的层面借助算法改进在 OTU 聚类前后的去噪过程30-31,以求更严谨地去除稀有类群中不真实的部分。4 结论结论 对沉积物样品进行分子多样性分析时,DNA 测序中产生的重复间异质性在测序深度饱和的情况下主要是由极稀有 OTU 造成的。这些 OTU 在总 OTU数中所占比例较高,分布随机。对极稀有 OTU 进行过滤可以显著降低沉积物样品的异质性,同时对站位之间的差异影响较小。而最终丰富 OTU 所展现的差异则能反应样品间真实的差异。但是过滤方法仍需根据采样生境、研究目标类群和测序深度等条件进一步细化,确定适用于不同研究类型的阈值,争取既保证减小异质性又能良好的保留稀有 OTU 所包含的群落信息等。致谢:中国科学院海洋研究所李宇航、赵荣杰协助样品采集,谨致谢忱。参考文献:1 徐奎栋.海洋微型底栖生物的多样性与地理分布J.生物多样性,2011,19(6):661-675.XU Kuidong.Biodiversity and biogeography of marine microbenthos:progress and prospectJ.Biodiversity Science,2011,19(6):661-675.2 HAUSMANN K,HULSMANN N,POLIANSKI I,et al.Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 29 Composition of benthic protozoan communities along a depth transect in the eastern mediterranean seaJ.Deep-Sea Research Part I:Oceanographic Research Papers,2002,49(11):1959-1970.3 代仁海.黄东海底栖纤毛虫多样性及微型底栖生物群落结构特点D.青岛:中国科学院海洋研究所,2012.DAI Renhai.Community structure and ecological cha-racteristics of microbenthos with special reference to benthic ciliate diversity in the Yellow Sea and East China SeaD.Qingdao:Institute of Oceanology,Chi-nese Academy of Sciences,2012.4 PAWLOWSKI J,CHRISTEN R,LECROQ B,et al.Eu-karyotic richness in the abyss:Insights from pyrotag sequencingJ.PLoS One,2011,6(4):e18169.5 MCCLAIN C R,NEKOLA J C,KUHNZ L,et al.Lo-cal-scale faunal turnover on the deep pacific seafloorJ.Marine Ecology Progress Series,2011,422:193-200.6 GAEVER S V,VANREUSEL A,HUGHES J A,et al.The macro-and micro-scale patchiness of meiobenthos associated with the darwin mounds(north-east atlan-tic)J.Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom,2004,84(3):547-556.7 LEJZEROWICZ F,ESLING P,PAWLOWSKI J.Pat-chiness of deep-sea 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