西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌O...进化、分子特征和抗原性分析_李义兴.pdf

第 7 卷第 1 期高原农业Vol.7 No.12023 年 2 月Journal of PlateauAgricultureFeb.2023收稿日期：2022-08-27作者简介：李义兴（2001-），男，汉族，云南楚雄人。研究方向：高原动物传染病。通讯作者：徐业芬（1975-），女，汉族，湖北随州人，教授，博士。研究方向：主要从事高原动物生理学的研究与教学工作。基金项目：西藏自治区科技厅重点项目（XZ202001ZY0044N）；西藏农牧学院 2021 年创新创业示范高校建设大学生创新创业训练示范计划项目（533321002）；国家肉牛牦牛产业体系项目（CARS-37）。西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析李义兴1孟朝轶1,2符汉宇1,2王运路1,2刘博华1,2徐业芬1,2*包玉花3牛家强1,2索朗斯珠1,2（1.西藏农牧学院 动物科学学院；2.西藏农牧学院西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室，西藏林芝 860000；3.西藏自治区兽医生物药品制造厂，西藏拉萨 850000）摘要 本研究旨在分析一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性。从一株西藏牦牛源 B 型多杀性巴氏杆菌的全基因组测序中获得 OmpH 基因序列，对其核苷酸序列进行遗传进化分析，通过生物信息学软件在线对 OmpH 基因编码的氨基酸序列进行理论分子质量、理论等电点、亲水性和疏水性、跨膜结构、结构域、二、三级结构及抗原性分析。结果表明 OmpH 基因全长1 002 bp，编码 333 个氨基酸；遗传进化分析发现，西藏牦牛源 Pm 的 OmpH 基因与新疆牦牛源的同源性最近。OmpH蛋白的分子特性分析发现该蛋白为亲水性蛋白，较为稳定，具有信号肽结构，所有序列均在膜外，无跨膜结构，属于分泌型蛋白，在 PFAM 数据库中存在 Porin_1 结构域及低复杂性区域；该蛋白的二、三级蛋白结构分析发现分子同源三聚体构成，其中无规则卷曲占比 45.35%，结构较为稳定。抗原性分析 OmpH蛋白的保护性抗原的总体预测为0.6945，高出正常阈值0.2945。OmpH 具有抗原性的可能性较大，可作为免疫原性蛋白和多杀性巴氏杆菌疫苗的较佳候选抗原。关键词 牦牛；多杀性巴氏杆菌；OmpH 基因；遗传进化；分子特征；抗原性中图分类号：S812-05文献标识码：A文章编号：2096-4781（2023）01-0040-10DOI:10.19707/ki.jpa.2023.01.006Genetic Evolution,Molecular Characterization andAntigenicityAnalysis of the OmpH Gene of Pasteurella multocida from Tibetan YakLI Yixing1,MENG Zhaoyi1,2,FU Hanyu1,2,WANG Yunlu1,2,LIU Bohua1,2,XU Yefen1,2*,BAO Yuhua3,NIU Jiaqiang1,2,Suolang sizhu1,2(1.College of Animal Science,Tibet Agricultural&Animal Husbandry University;2.ProvincialKey Laboratory of Tibet Plateau Animal Epidemic Disease Research,Tibet Agricultural andAnimal Husbandry,University,Nyingchi Tibet,860000;3.Veterinary BiopharmaceuticalManufacturing Factory of Tibet Autonomous Region,Lhasa Tibet,850000,China)Abstract:The purpose of this study was to analyze the genetic evolution,molecularcharacteristics and antigenicity of OmpH gene of Pasteurella multocida from Tibet yak.OmpHgene sequence was obtained from the whole genome sequencing of a Pasteurella multocida(Pm)B strain from Tibet yak,and its nucleotide sequence was analyzed for genetic evolution.Thetheoretical molecular weight,theoretical isoelectric point,hydrophilicity and hydrophobicity,transmembrane structure,domain,secondary and tertiary structure,and antigenicity of the amino第 1 期李义兴等：“西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析”41acid sequence encoded by OmpH gene were analyzed by bioinformatics software online.Theresults showed that the total length of OmpH gene was 1 002 bp,encoding 333 amino acids.Genetic evolution analysis found that the OmpH gene of Pm from Tibet yak source had theclosest homology with Xinjiang yak source.Molecular analysis of OmpH protein showed that itwas a hydrophilic protein,relatively stable,with signal peptide structure.All sequences wereoutside the membrane,without transmembrane structure,showing that it was a secretory protein.Porin existed in the structural domain and low complexity area in PFAM databasePorin_1.Thesecondary and tertiary protein structure analysis of the protein revealed that the molecularhomotrimer was composed of homologous trimers,of which the irregular curl accounted for45.35%and the structure was relatively stable.The overall prediction of the protective antigen ofOmpH protein was 0.6945,which was 0.2945 higher than the normal threshold.OmpH waslikely to have antigenicity and could be a better candidate antigen for immunogenic protein andPasteurella multocida vaccine.Key words:yak,Pasteurella multocida,OmpH gene,genetic evolution,molecular characteristics,antigenicity多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的球杆菌，基于荚膜特异性主要分为五个血清型（A、B、D、E 和 F），并根据脂多糖抗原分为 16 个体细胞血清型1,2。该菌对动物和人均有致病性，在正常情况下寄生于动物的呼吸道和消化黏膜，当动物机体的免疫力下降时病原菌即可在体内大量繁殖，引起呼吸道菌群失调；当病原菌经淋巴液而进入血液扩散至其他器官时，可引发全身性感染3。在家畜中以牛、猪发病较多，能引起多种畜禽以急性、热性和内脏器官广泛性出血为特征的败血性传染病，例如：禽霍乱、牛出血性败血症和猪萎缩性鼻炎等重要呼吸道疾病4-6。巴氏杆菌病呈世界性分布，受影响的宿主物种范围广泛，流行快，感染途径广，病程短，死亡率高。在西藏地区牦牛巴氏杆菌病的发病率可达发病率为 2%左右，但致死率高达 90%左右，给西藏牦牛产业造成了严重的损失7。Pm 菌体内的多种物质共同决定其致病性，例如荚膜、脂多糖、黏附因子、毒素、外膜蛋白等8-10。多杀性巴氏杆菌侵入机体并定殖、繁殖和扩散的能力与细菌的毒力有关，高毒力菌株能够在机体内繁殖菌体裂解后产生内毒素，引起一系列的毒性作用。致病过程多依赖各种毒力因子的共同作用，其中细菌外膜蛋白是革兰氏阴性细菌外膜中的通道形成跨膜蛋白，它们起着分子筛的作用，允许小亲水性溶质通过外膜扩散，也作为细菌素的受体11。外膜蛋白具有高度的免疫原性，暴露在细菌表面的表位，由于它们在一级氨基酸序列和二级结构上具有高度同源性，并且具有抗原相关性，使外膜蛋白成为诱导针对革兰氏阴性细菌感染的同源和异源免疫的候选疫苗蛋白12。外膜孔蛋白 H（Outer MembraneProtein H，OmpH）是多杀性巴氏杆菌质膜的外膜上的通道蛋白，参与细菌的黏附、侵袭和毒素分泌等致病性过程。OmpH 由 353 个氨基酸组成，具有高度免疫原性，其抗体提供 70%的保护同源菌株11。近来研究表明，OmpH 不仅可以黏附宿主细胞，而且还能黏附胞外基质成分或者通过结合宿主血浆纤维蛋白溶解酶原，促进细菌对宿主细胞和组织的黏附以增强定殖能力，该过程是 Pm 侵袭动物机体使其发病的重要一步13。因此，为探究多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的功能，本研究从西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌分离株 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析，为 OmpH 蛋白在 Pm 诊断抗原筛选和疫苗开发研究中的应用奠定基础。42高原农业2023 年第 1 期1 材料与方法1.1 菌株的来源及测序1.1.1 菌株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 B 型分离株，由西藏农牧学院西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室分离鉴定并保存。1.1.2 OmpH 基因序列西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌分离株的全基因组测序由北京百迈客生物科技有限公司完成，OmpH 基因序列由全基因组测序中获得。1.2 OmpH 基因核苷酸序列分析利用DNAMAN软件将OmpH基因翻译为编码的氨基酸序列；从 GenBank 基因库中检索该分离株的 OmpH 基因序列，利用 NCBI BLAST 从 100 株不同来源的基因序列中选取相似度较高的 10 株与该基因序列进行比对，利用 MEGA-X 软件构建系统发育树，再通过 MegAlign 软件分析不同菌株OmpH 基因的相似性。1.3 OmpH 分子特征和抗原性分析通过 ProtParam 在线软件计算 OmpH 蛋白质的理论分子质量、理论等电点。利用 Protscale 分析蛋白质的亲水性与疏水性；通过 SignalP-4.1 进行OmpH 的信号肽预测。通过 TMHMM 软件分析蛋白质的跨膜结构；利用 SMART 在线程序分析预测OmpH 蛋白的结构域。应用 SOPMA 和 GOR4 在线软 件 预 测 OmpH 蛋 白 的 二 级 结 构。利 用SWISS-MODEL 预测该蛋白的三级结构。应用VaxiJen2.0 在线软件分析 OmpH 蛋白的抗原性。上述在线软件的网址信息见表 1。表 1 OmpH 分子特征和抗原性分析在线软件及网址信息Tab.1 Online software and website information of OmpH molecular characteristics and antigenicity analysis名称网址ProtParamhttp:/web.expasy.org/protparam/Protscalehttp:/web.expasy.org/protscale/SignalP-4.1https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1TMHMMhttps:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0SMARThttp:/smart.embl-heidelberg.de/SOPMAhttps:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.htmlGOR4https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.htmlSWISS-MODELhttp:/www.swissmodel.expasy.org/VaxiJen2.0http:/www.ddg- 结果2.1 OmpH 核苷酸及编码核苷酸分析测序结果显示 OmpH 基因总长1 002 bp，共编码 333 个氨基酸（图 1）。2.2 OmpH 基因的遗传进化及多序列比对分析分离株OmpH基因与NCBI BLAST中GenBank库不同来源的参考序利用 MEGA-X 软件构建系统发育树（图 2），继而使用 MegAlign 软件进行同源性分析（图 3）。结果显示，目的菌株、新疆牦牛源、中国猪源和俄罗斯牛源同属一个组群（Group1）,西藏林芝牦牛源 B 型 Pm 的 OmpH 基因序列与新疆牦牛源 Pm（HM582885.1）的 OmpH 基因相似性100%，同源性最接近，可信度较高，与中国猪源（MK028760.1）、俄罗斯牛源（KP212395.1）Pm的 OmpH 基因序列同源性较为相近，相似性分别为91.0%、90.0%，与其他源的 OmpH 基因序列同源性相差较远，尤其与埃及牛源（KY436382.1）、埃及第 1 期李义兴等：“西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析”43羊源（KY403516.1）及印度水牛源（CP092967.1）差异性最大，相似性分别为 41.7%、41.7%、40.0%。图 1 OmpH 基因编码的氨基酸序列Fig.1 OmpH gene encoded amino acid sequence图 2 不同源 OmpH 基因的系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of OmpH gene from different sources注：标尺表示遗传距离，标尺上的 0.20 指每个位点有 0.20 个氨基酸替换44高原农业2023 年第 1 期图 3 MegAlign 软件同源性分析Fig.3 Homology analysis with MegAlign software2.3 OmpH 分子特征分析2.3.1 OmpH 蛋白理化特性分析利用 ProtParam 在线软件对多杀性巴氏杆菌OmpH 蛋白进行分析，结果显示原子总数是5 038，分子式是 C1593H2518N440O484S3，分子量为35 674.35，理论 pI 值为 9.26。氨基酸总数为 333，其中带负电荷的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的残基总数为 36，带正电荷的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）的残基总数为 44。消光系数以在280 nm 处在水中测量，测量结果为33 350(molcm)-1，绝对值 0.1%（=1 g/l）0.935。序列的 N 端为甲硫氨酸（Met），估计 OmpH 蛋白在哺乳动物的网织红细胞（体外）的半衰期为30 h，酵母（体内）的半衰期大于20 h，在大肠杆菌（体内）的半衰期大于10 h。经计算OmpH 蛋白不稳定性指数（II）为 14.39，这将蛋白质归类为稳定蛋白。脂肪族指数为 83.15。2.3.2 OmpH 蛋白亲水性和疏水性分析OmpH 蛋白亲水性总平均值（GRAVY）为-0.229，GRAVY 为负值，表明具有亲水性，通过 Protscale在线软件分析多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白质的亲水性与疏水性，结果显示氨基酸序列在第 46 个位点处有最小值-3.400，在第 9 个位点处有最大值 3.122；整体分析 OmpH 蛋白属于亲水性蛋白（图 4）。2.3.3 信号肽、跨膜区域及结构域分析第 1 期李义兴等：“西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析”45图 4 OmpH 蛋白亲水性和疏水性分析Fig.4 Hydrophilic and hydrophobic analysis of OmpHprotein图 5 OmpH 蛋白的信号肽预测Fig.5 Signal peptide prediction of OmpH protein图 6 OmpH 蛋白跨膜结构分析Fig.6 Analysis of the transmembrane structure of OmpH proteinSignalp-4.1 分析发现，该蛋白在其 120 位点间存在信号肽；剪切位点存在于 21 位点，是剪切位点后的第一个氨基酸（即成熟蛋白的第一个氨基酸残基）（上图 5）。TMHMM 分析预测出的跨膜螺旋数量为 0，跨膜螺旋氨基酸残基数量的期望值约为 7，低于 18 个，含有跨膜螺旋的概率小，蛋白前60 个氨基酸中跨膜螺旋的氨基酸量的期望值约为6.9，N 端在膜的细胞质一侧的总概率为0.33176，共计 333 个氨基酸，所有序列均在膜外，即该序列编码的是分泌蛋白（上图 6）。利用 SMART 在线分析 OmpH 蛋白保守结构域，OmpH 蛋白在 PFAM数据库中存在 Porin_1、Porin_4 两个结构域，并在316-328 位点间有低复杂性区域，低复杂区域共 13个位点；Porin_1 在 26186 位点间，共 161 个位点，E 值为 9.2e-8，Porin_4 在 7315 位点间，E 值为1.6e-38（图 7）。46高原农业2023 年第 1 期图 7 OmpH 蛋白结构域分析Fig.7 OmpH protein domain analysis2.3.4 OmpH 蛋白二、三级结构分析图 8 SOPMA 预测 OmpH 蛋白的二级结构Fig.8 The secondary structure of OmpH protein predicted by SOPMA注：h,a-螺旋；t,-转角；c,无规则卷曲；e,延伸链；线条按照从长到短依次代表 a-螺旋、延伸链、-转角和无规则卷曲SOPMA（图 8）和 GOR4（图 9）预测 OmpH蛋白的二级结构，SOPMA 结果显示-螺旋有 66 个位点，占比 19.82%、-转角有 14 个位点，占比 4.20%、延伸链有 102 个位点，占比 30.63%、无规卷曲有151 个位点，占比 45.35%。GOR4 结果显示-螺旋有 112 个位点，占比 33.63%、延伸链有 73 个位点，占比21.92%、无规卷曲有148个位点，占比44.44%。SWISS-MODEL预测结果显示OmpH蛋白由同源三第 1 期李义兴等：“西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析”47聚体结构组成，其单体结构包含-螺旋、-转角和无规卷曲等二级结构，且 GMQE 值为 0.58，表明建模质量较优（图 10）。图 9 GOR4 预测 OmpH 蛋白的二级结构Fig.9 The secondary structure of OmpH protein predicted by GOR4注：h,a-螺旋；c,无规则卷曲；e,延伸链；线条按照从长到短依次代表 a-螺旋、延伸链、无规则卷曲AB图 10 OmpH 蛋白的三级结构预测Fig.10 Prediction of tertiary structure of OmpH protein注：A：OmpH 的结构 B：单体的结构48高原农业2023 年第 1 期2.3.5 OmpH 蛋白抗原性预测分析应用 VaxiJen2.0 在线软件分析 OmpH 蛋白的抗原性。结果显示 OmpH 保护性抗原的总体预测为0.694 5，高出正常阈值0.2945，具有抗原性。3 讨论牛出血性败血病由多杀性巴氏杆菌引起的急性传染病，感染发病后迅速扩散传播，会对养殖业造成一定的经济损失。Pm 是牛呼吸道疾病重要的条件性病原体之一，其侵入机体的过程中有一系列毒力因子参与，其中外膜蛋白对宿主的感染与致病过程中发挥重要的作用14。在临床应用中巴氏杆菌疫苗接种后存在免疫失败的现象，其原因主要取决于病原分离株和特定种群内循环细菌之间的遗传亲和力15。目前，研究人员仍在寻找其他有效的巴氏杆菌疫苗。细菌孔蛋白是革兰氏阴性细菌外膜中的通道形成跨膜蛋白，它们起着分子筛的作用，允许小的亲水性溶质通过外膜扩散16。孔蛋白具有高度的免疫原性，暴露在细菌表面的表位，由于它们在一级氨基酸序列和二级结构上具有高度同源性，并且具有抗原相关性，因此它们通常在细菌物种甚至细菌家族中保持保守17,18。这些特性使孔蛋白成为诱导针对革兰氏阴性细菌感染的同源和异源免疫的有吸引力的候选疫苗。OmpH 是一种高度保守的外膜蛋白，作为黏合宿主细胞的重要因子，参与多杀性巴氏杆菌定殖动物机体的重要过程，在疾病的发病机制中起着重要作用18。因此，探究 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析具有重要意义。在天然构象中，OmpH 蛋白是一种同源三聚体，在环境中较为稳定，高温变性后分解为单体，变性单体的分子量在 34到42 kDa之间，这取决于 Pm 血清型19。本研究以分离的牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因作为研究对象，测序数据表明该基因全长约为1 002 bp，编码333 个氨基酸，经生物信息学方法分析发现，OmpH蛋白属于亲水性蛋白，蛋白质二级结构以无规卷曲为主，占 40%以上。上述结果与新疆牦牛源 Pm20的 OmpH 基因二级结构预测结果基本一致，OmpH蛋白的三级结构为同源三聚体三维立体结构，稳定性较高，OmpH 蛋白较为稳定，不易降解。Alexey V.Nefedchenko21的研究与本研究中多杀性巴氏杆菌OmpH 基因的氨基酸序列存在差异，其原因主要是A 型和 B 型的巴氏杆菌的血清型存在差异。OmpH的上述几个特征表明其作用是扩散孔蛋白，形成亲水性小分子的通道进入细胞。同源性分析进一步发现，西藏牦牛 Pm 菌株的 OmpH 基因的同源性与新疆牦牛源 Pm（HM582885.1）菌株 OmpH 基因相似性 100%，与中国猪源和俄罗斯牛源的同源性也较为相近，与埃及牛源、埃及羊源、印度水牛源亲缘关系较远。OmpH 的保护性抗原的总体预测值为0.6945，高出正常阈值0.2945，证明 OmpH 蛋白可作为牦牛多杀性巴氏杆菌疫苗的候选抗原。总之，本研究利用生物信息学在线软件对OmpH基因的遗传进化、分子特性和抗原性进行预测和分析，为进一步探讨OmpH的功能以及巴氏杆菌疫苗的研发奠定理论依据。4 结论本研究对西藏牦牛 Pm 分离株与新疆牦牛源菌株 OmpH 基因相似性最高；OmpH 蛋白存在信号肽，无跨膜结构，分子中存在两个结构域，二级结构中无规卷曲占比最多，是一种结构较为稳定的亲水性分泌蛋白；其保护性抗原预测值表明 OmpH 适合作为 Pm 疫苗的候选抗原，为后续深入研究 OmpH 相关疫苗提供理论基础。第 1 期李义兴等：“西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析”49参考文献：1SIDDARAMAPPA S.Comparative genomics ofthePasteurella multocida toxin J.Genome,2021,64(7):679-92.2GUANL,ZHANGL,XUEY,etal.Molecularpathogenesis of the hyaluronic acid capsule of Pasteurellamultocida J.Microb Pathog,2020,149:104380.3WU C,QIN X,LI P,et al.Transcriptomic Analysis onResponses of Murine Lungs to Pasteurella multocidaInfection J.Front Cell Infect Microbiol,2017,7:251.4XIAO J,LI Y,HU Z,et al.Characterization of Pasteurellamultocida isolated from ducks in China from 2017 to 2019J.Microb Pathog,2021,160:105196.5PARDONB,CALLENSJ,MARISJ,etal.Pathogen-specific risk factors in acute outbreaks ofrespiratory disease in calves J.J Dairy Sci,2020,103(3):2556-66.6BESSONE F A,PREZ M L S,ZIELINSKI G,et al.Characterization and comparison of strains of Pasteurellamultocida associated with cases of progressive atrophicrhinitis and porcine pneumonia inArgentina J.Vet World,2019,12(3):434-9.7李家奎,索朗斯珠,贡嘎等.牦牛重要传染病和寄生虫的防治与展望J.中国奶牛,2012,(01):30-3.8GUAN L,XUE Y,DING W,et al.Biosynthesis andregulationmechanismsofthePasteurellamultocidacapsule J.Res Vet Sci,2019,127:82-90.9GHARIB MOMBENI E,GHARIBI D,GHORBANPOORM,etal.Toxigenicandnon-toxigenicPasteurellamultocidagenotypes,basedoncapsular,LPS,andvirulenceprofiletyping,associatedwithpneumonicpasteurellosis in Iran J.Vet Microbiol,2021,257:109077.10 ZHAN L,ZHANG J,ZHAO B,et al.Genomic andTranscriptomic Analysis of Bovine Pasteurella multocidaSerogroup A Strain Reveals Insights Into VirulenceAttenuation J.Front Vet Sci,2021,8:765495.11 GAO Q,LU S,WANG M,et al.Putative Riemerellaanatipestifer Outer Membrane Protein H Affects VirulenceJ.Front Microbiol,2021,12:708225.12 HATFALUDI T,AL-HASANI K,BOYCE J D,et al.Outer membrane proteins of Pasteurella multocida J.VetMicrobiol,2010,144(1-2):1-17.13 VARINRAK T,MUENTHAISONG A,APINDA N,et al.Construction and characterization of an OmpH-deficientmutant of Pasteurella multocida strain X-73 J.AvianPathol,2019,48(1):4-11.14 DABO S M,TAYLOR J D,CONFER A W.Pasteurellamultocida and bovine respiratory disease J.Anim HealthRes Rev,2007,8(2):129-50.15 MOSTAAN S,GHASEMZADEH A,SARDARI S,et al.Pasteurella multocida Vaccine Candidates:A SystematicReview J.Avicenna J Med Biotechnol,2020,12(3):140-7.16 HORNE J E,BROCKWELL D J,RADFORD S E.Roleof the lipid bilayer in outer membrane protein folding inGram-negative bacteria J.J Biol Chem,2020,295(30):10340-67.17 KONOVALOVA A,KAHNE D E,SILHAVY T J.OuterMembrane Biogenesis J.Annu Rev Microbiol,2017,71:539-56.18 FURIAN T Q,BORGES K A,PILATTI R M,et al.Use ofMolecular Pathogenicity Indices to Identify PathogenicStrains of Pasteurella multocida J.Avian Dis,2016,60(4):792-8.19 TAN H Y,NAGOOR N H,SEKARAN S D.Cloning,expression and protective capacity of 37 kDa outermembrane protein gene(ompH)of Pasteurella multocidaserotype B:2 J.Trop Biomed,2010,27(3):430-41.20 赵文娟,田亮,薄新文等.牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH 的扩增与生物信息学分析J.生物技术通报,2012,(01):139-44.21 ABBAS A M,ABD EL-MOATY D A M,ZAKI E S A,etal.Use of molecular biology tools for rapid identificationand characterization of Pasteurella spp J.Vet World,2018,11(7):1006-14.