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HMOX1、miR122对巨细胞病毒感染小鼠肝癌进程的影响研究 研究HO-1基因表达水平对小鼠肝癌细胞生长的影响，并探索miR122与HO-1的关系。 方法 建立小鼠肝癌模型，以小鼠巨细胞病毒CMV毒株感染离体肝癌组织，（1）测量正常肝组织、肝癌组织、病毒感染肝癌组织HO-1的表达水平、miR122的转录水平、肝细胞（肝癌细胞）活性；（2）加入选择性HO-1抑制剂锌原卟啉IX，测量肝癌组织、病毒感染肝癌组织HO-1的表达水平、肝细胞（肝癌细胞）活性；（3）加入miR122特异性沉默RNA，测量正常肝组织HO-1的表达水平。 结果 预期（1）肝癌组织与病毒感染肝癌组织miR122表达水平较正常肝组织为低，细胞活性为高，HO-1表达水平为高，且病毒感染后HO-1表达水平较未感染病毒的肝癌组织为高，上述指标均具有显著性差异（p<0.01)；（2）加入选择性ho-1抑制剂后，肝癌组织、病毒感染肝癌组织ho-1表达水平无显著性差异，肝癌细胞活性无显著性差异（p>0.05)，但两指标均较正常组织为高（p<0.01)；（3）转染mir122过表达载体，三组样本mir122表达均上调，ho-1蛋白含量下降，肝细胞活性下降，且肝癌与肝癌伴mcv感染组肝细胞活性无显著性差异（p>0.05)。 结论 肝癌细胞中miR122表达下调，其可能作为HO-1转录的抑制因子而使肝癌细胞HO-1表达上调。上调的HO-1可能与细胞内调控生长的信号之间发生关联，促进细胞增殖分裂，使用HO-1抑制剂可以使肿瘤细胞生长减缓，或可成为肿瘤治疗新靶点。关键词 HCMV；MCV；HO-1；miR122；小鼠；肝癌模型引 言人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）属于疱疹病毒亚科，是巨细胞包涵体病的病原体，人群感染十分普遍，但通常为潜伏感染，临床上常无症状。病毒潜伏在唾液腺、乳腺、肾、外周血单个核细胞及其他腺体细胞内1，可以通过人体体液分泌排出，在人群中传播。HCMV是引起先天性感染最常见的病毒之一，感染的新生儿有5%10%出现临床症状，表现为肝脾大、黄疸、血小板减少性紫癜、溶血性贫血及神经系统损伤、小头畸形、智力低下,称之为巨细胞包涵体病（cytomegalic inclusion disease,CID)1，大多数病例经抗病毒及对症治疗后痊愈,但是少数严重者可发展为肝硬化、腹水等。在免疫力低下患者，如器官移植、艾滋病、白血病和淋巴瘤等病人中，HCMV常可导致严重感染2，可见HCMV对机体的作用受到机体内在免疫力的影响。机体免疫系统具有免疫监视功能，可识别、杀伤并及时清除体内突变细胞，防止肿瘤发生。当免疫水平下降时，肿瘤发生的风险将大大增加。以往文献研究认为HCMV可能存在潜在致癌性，但是缺乏相关证据1。但是，近年来对HCMV的研究发现，HCMV与肿瘤之间存在密切联系。在多种人类肿瘤如宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌等组织中检出HCMV DNA。对恶性胶质瘤患者的临床研究发现，HCMV感染的肿瘤细胞数量与肿瘤的恶性程度有关3。针对HCMV基因编码蛋白对肿瘤的细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、血管生成、免疫逃避作用已有相关研究4，使我们对HCMV与肿瘤之间的关系更为了解。根据目前的研究进展，HCMV主要起到了肿瘤调节作用，例如在协同人乳头瘤病毒（HPV）使人正常鳞状上皮恶变过程中起到了协同作用5，病毒编码的即刻早期基因（IE基因）可上调细胞转录因子NFkB，能与p53和RB（一种肿瘤抑制基因编码的蛋白）结合，细胞周期不能终止，从而使细胞增殖、恶化。因此，基于人群中广泛而潜在感染的HCMV，且HCMV在机体免疫低下时对肿瘤可能起到的促进作用，以HCMV为对象，针对HCMV所涉及的某一细胞活动通路为靶点进行干预，可能对肿瘤生长有抑制作用，为临床上癌症的治疗提供新的手段。原发性肝癌，特别是肝细胞癌（HCC），是临床常见的恶性肿瘤之一。在我国，肝癌的发病率和死亡率甚高。据WHO globe cancer statistics统计6，2008年肝癌的全球发病率已超过74.8万，是排名第6位的恶性肿瘤；死亡人数接近69.5万，位居肿瘤相关死亡的第3位。肝癌在我国高发，发病人数占全球的54%，其在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。并且，无论是在全球范围内还是在我国，肝癌发病人群中死亡人口高达93%。因此，肝癌严重威胁人类健康和生命。张新华等7（1998）在对消化系统恶性肿瘤患者HCMV感染情况的研究中发现肝癌、胃癌、结肠癌患者HCMV感染率高于正常对照。2001年杜冀晖等8在乙型肝炎患者HCMV感染再活化研究中发现乙肝患者HCMV感染再活化率明显增高并与胆汁淤积、黄疸加重及肝功能损害加重有关。在抗原检测方面，乙肝相关性肝癌患者外周血HCMV-pp65抗原检出率显著高于正常对照9。上述证据均说明，当患严重肝病时，机体免疫力降低，可使体内潜伏的HCMV被激活，造成活动性感染，同时也提示HCMV活动性感染与肝癌发展可能存在关联性。最新的研究结果显示，HCMV在PHH和HepG2细胞系中培养，可通过激活IL-6-JAK-STAT3信号通路促进细胞增殖和生长，可能与肿瘤形成有关10。现已应用于临床的HCC治疗手段包括手术(肝切除与肝移植)、系统化疗、放射治疗、介入治疗、局部消融(主要包括射频消融、经皮酒精或醋酸瘤内注射、微波消融和高强度聚焦超声治疗)、生物治疗、分子靶向治疗、中医药以及综合治疗等。当前，除早期手术治疗外，尚缺乏可显著改善HCC患者预后的治疗策略11。生物靶向治疗主要聚焦于对索拉菲尼、雌激素和生长抑素类药物等的研究。临床RCT研究表明，除肝移植术外，索拉菲尼可能是晚期HCC患者的最佳药物选择。它能同时抑制多种存在于细胞内和细胞表面的激酶,包括RAF激酶、血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)、血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3)、血小板衍生生长因子受体-P (PDGFR-p)和人FMS样酪氨酸激酶3 (FLT-3)等，具有双重抗肿瘤效应。但是，早期肝癌目前临床上均为手术治疗，对于部分病人而言费用昂贵，且异体肝移植过程中免疫抑制可能导致的HCMV活动性感染会加重肝病且可能危及生命。因此，针对HCMV在肝癌早期发展过程中的作用以及HCMV参与调节的肝癌细胞信号通路，寻找某一靶点进行干预，可望在早期控制肝癌的生长，同时配合相关治疗手段，促进肝癌预后。现已查明，处于潜伏状态的HCMV，尽管呈组织泛嗜性，但不会感染外周血白细胞。相反，一旦再活化，即可在外周血白细胞检测出12。通过NCBI-GEO-Profiles数据库中以“HCMV AND monocyte”为检索词进行检索，发现GPL8300表达谱中，在HCMV感染的单核细胞中使用NF-kB和PI3K抑制剂前后，血红素加氧酶1（HMOX1/HO-1）基因的表达水平发生显著变化(p<0.01)，提示HCMV感染与HMOX1转录水平之间存在某种关联。血红素加氧酶是体内血红素代谢的限速酶，从血红素-亚甲基桥处开环以生成胆绿素，胆绿素再在胆绿素还原酶作用下转变为胆红素13。体内血红素加氧酶有三种同工酶，分别为HO-1，HO-2，HO-3。HO-2，HO-3呈结构性表达，在体内含量稳定，主要参与血红素的代谢14。HO-1（HSP-32）则属于热休克蛋白家族，其对于血红素的分解活性较低，但抗氧化应激作用显著高于HO-2和HO-3，在缺血、缺氧、炎症、内毒素等多种应激因素作用下其基因表达水平可明显上升。诸多研究表明HO-1表达上调与其抗炎、抗凋亡、抗氧化应激、免疫调节、神经调节有关14。胆绿素及胆红素均具有抗氧化功能，代谢副产物CO则能激活鸟苷酸环化酶，使cGMP生成增加发挥组织细胞保护效应15，更重要的是，HO-1在转录水平上的改变涉及到细胞内信号通路的影响，如NF-kB16，MAPK通路17，这些通路与细胞的增殖和分化有关。 查阅有关文献，Taher C等在一组乳腺癌患者中发现HCMV DNA在癌细胞中的检出率高于90%18，且患者外周血单核细胞HMOX1表达高于正常对照组。基因敲除异粘蛋白（metadherin，一种参与恶性肿瘤转移的膜蛋白），乳腺癌肿瘤细胞中HMOX1表达下降。另外，在非小细胞肺癌治疗时，抑制 MAPK/HO-1信号通路，可以改善肺癌的生长状况19。上述证据均提示了HCMV在参与肿瘤细胞生长过程中通过HMOX1这一基因位点可发挥作用。同时，在KEGG（Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes）中查找HMOX1基因参与的细胞代谢通路，发现在肝细胞肝癌的进展过程中有HMOX1基因的表达异常，此种异常可能有miR122参与（图1）。多项研究结果表明miR-122是肝脏特异的miRNA,调节脂肪酸、胆固醇的代谢和肝脏的分化，上调嗜肝病毒HCV的复制20。miR-122表达的下调可能导致肝细胞肝癌恶化，并且预后不良。新近研究表明人巨细胞病毒可通过激活 IL-6-JAK-STAT3 信号通路促进细胞增殖和生长，起到与HBV的协同作用10，同时，关于前列腺癌、肺氧化损伤的研究中21,22，STAT3可与HO-1相互影响，对细胞的生长起关键作用（图1）。图1. miR122与HO-1在肝癌进展过程可能存在关联综合上述线索，本实验拟以动物模型研究HO-1基因对肿瘤细胞的影响以及miR122水平与HO-1转录之间的关系，可以为临床治疗肝癌提供新思路，局部应用HO-1抑制剂或可成为肝癌分子靶向治疗的新靶点（图2）。图2. HO-1作为肝癌治疗的潜在靶点Sorafenib：索拉非尼（目前临床上治疗晚期肝癌的首选分子靶向药物，可阻断RAF/MEK/ERK通路使肝癌细胞凋亡；1包括RAF/MEK/ERK在内的生长代谢通路与HO-1之间的分子机制尚不明了；2HCMV感染的肝癌细胞miR122表达水平更低，有文献表明miR122会影响HO-1的表达。我们提出假设低表达的miR122可能失去了对HO-1的抑制作用，使HO-1高表达，使肝癌细胞避免凋亡。实验设计1 实验对象：小鼠C57BL/6J 雄性小鼠2 实验分组：将实验对象随机分为3个组23-26；       组1：正常组                      30只       组2：肝癌组                        30只       组3：感染组    ;                            30只3 实验方法：3.1小鼠肝癌模型制作。3.2 实验分组，编号处理。3.3 实验：（1）取组1，2，3肝组织各10份，每份3g，各制备成细胞悬液后平均分成3份分别测量HO-1蛋白含量、miR122的转录水平、肝细胞/肝癌细胞的活性；（2） 取组1，2，3肝组织各10份，每份3g，各制备成细胞悬液后平均分为3份加入选择性HO-1抑制剂锌原卟啉IX分别测量HO-1蛋白含量、miR122的转录水平、肝细胞/肝癌细胞的活性；（3） （3）组1，3小鼠10只，分别取肝组织1g，构建miR122过表达载体，转染；测量HO-1蛋白含量、miR122的转录水平、肝细胞/肝癌细胞的活性；4 观察指标：4.1小鼠肝癌模型：HE染色镜下观察患癌小鼠肝组织28-294.2 HO-1蛋白水平27（ Western blot法）：吸光度304.3 肝细胞活度（MTT法）：吸光度OD值314.4 miR122表达水平（Nortern-Blot）325. 统计分析：    实验数据以均值标准差（xs）表示,应用方差分析进行样本间的两两比较，P<0.05有统计学意义。实验方法（一） 实验过程和数据测量仪器设备：光学显微镜、分光光度仪、地高辛/生物素DNA标记试剂盒I（Cat.No.DDLK-010/020,BDLK-010/020）、地高辛/生物素杂交检测试剂盒II（化学发光法）(Cat. No. DDLK-010、020,BDLK-010/020)实验对象：160只C57BL/6J 雄性小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，符合国标GB14922-94 SPF级质量标准。鼠龄为68 周，体质量为2030 g。药品试剂：10%甲醇、石蜡、DEN（二乙基亚硝胺，购自 Sigma），CCl4 购自天津化学试剂研究所、乙醇和橄榄油购自北京化学试剂公司、MCMV 毒株由湖北省预防医学科学院病毒研究所提供、PBS现配、异戊醇、无水乙醇、MTT（噻唑蓝，湖北康宝泰精细化工有限公司武汉分公司）、DMSO（二甲基亚砜，广州市芯苑化工有限公司）、TRI试剂（Sigma、市售）、LNA（从购买）、锌原卟啉IX（购自上海宝曼生物科技有限公司）、4倍上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司购得）、HOl兔抗鼠抗体购自美国Santa Cruz公司，羊抗兔二抗购自美国Chemicon公司；miR122过表达载体1. 小鼠肝癌模型制作：1.1. 分笼饲养，标准化光照和自由进食及饮水，适应环境7 d。1.2. 全部小鼠按照随机数字表法分为诱癌组120只及对照组40 只。1.3. 诱癌组小鼠以二乙基亚硝胺（DEN）大剂量一次腹腔注射100 mg/kg，3d后开始灌胃CCl4和橄榄油（配制体积比为20：80）混合液0.005 mL/g，2次/周；第3周DEN再灌胃1次，50 mg/kg，同时开始给予含有9%乙醇的饮用水；第4周开始CCl4加大剂量0.008 mL/g，2次/周，同时喂以正常小鼠颗粒饲料。共给药20周，诱癌过程中实验人员穿隔离衣、戴防护手套和口罩。1.4. 对照组小鼠仅以正常小鼠颗粒饲料喂养，并自由饮用灭菌普通水。1.5. 观察小鼠的背毛变化、精神食欲改变、体重改变等。于诱癌开始后第 4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 周，从诱癌组随机抽取4只小鼠、对照组随机抽取1只小鼠，打开腹腔观察肝脏表面及色泽。1.6. 肝脏组织病理学观察：处死小鼠，迅速将0.5cm大小的肝组织块用体积分数为1O%的甲醛同定，石蜡包埋、切片，苏木素伊红(HE)染色，光镜下观察组织学变化。2. 实验分组及处理 2.1. 从对照组随机取30只小鼠，归为正常组，记为组1；2.2. 诱癌组成功诱癌的小鼠编号并随机抽取60只再随机均分为2组，记为组2，组3；2.3. 组3用MCMV毒株感染，一段时间后利用病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测，剔除没有被MCMV感染的小鼠，再随机抽取诱癌成功小鼠MCMV感染，直至组3也为30个。       组1：正常组   &nbsp;                  30只       组2：肝癌组                        30只       组3：感染组                         &nbsp;  30只2.4. 实验数据测量：（1）取组1，2，3肝组织各10份，每份3g，各制备成细胞悬液后平均分成3份，分别测量HO-1蛋白含量、miR122的转录水平、肝细胞/肝癌细胞的活性；（2）取组1，2，3肝组织各10份，每份3g，各制备成细胞悬液后平均分为3份，加入选择性HO-1抑制剂锌原卟啉IX，分别测量HO-1蛋白含量、miR122的转录水平、肝细胞/肝癌细胞的活性；（3）组1，2，3小鼠10只，分别取肝组织1g，构建miR122过表达载体，转染；分别测量HO-1蛋白含量、miR122的转录水平、肝细胞/肝癌细胞的活性；2.5. 观察指标：2.5.1 小鼠肝癌模型建立指标：HE染色镜下观察患癌小鼠肝组织2.5.2 HO-1蛋白水平（ Western blot法）：X光曝光显影，计算机图像分析；2.5.3 肝细胞活度（MTT法）：吸光度OD值2.5.4 miR122表达水平（RT-PCR）2.6 统计分析：    实验数据以均值标准差（xs）表示,应用方差分析进行样本间的两两比较，P <0.05有统计学意义。（二）实验技术3. HO-l蛋白表达水平检测3.1 取肝脏组织约 50mg，加1ml预冷组织裂解液，在玻璃匀浆器中制成组织匀浆，冰上培育15min，4 、l5000 rmin离心 10min，取上清 ，得胞质蛋白。3.2 二辛町宁酸 (BCA)法测定蛋白浓度后确定上样浓度 ，加入4倍上样缓冲液 ，100C沸水使蛋白变性 35min，质量分数为8%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDSPAGE)，每个泳道加蛋白 45 ug。3.3 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，兔抗鼠 HO一1多抗 (1：1000) 4孵育过夜。3.4 辣根过氧化物酶标记二抗 (羊抗兔 ，1：2000) 4下孵育2h。3.5 采用免疫印迹化学发光法 (ECI)，在KODAK ImageStation2000R成像系统中曝光显影。4. MTT比色法测肝（肝癌）细胞活性4.1. MTT溶液的配制4.1.1. 预先在50ml离心管加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。PBS配方：NaCl 8g  KCl 0.2g  Na2HPO4 1.44g  KH2PO4 0.24g  调pH 7.4，定容1L。4.1.2. 将MTT完全混匀后，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可每管分装1ml。4.2. MTT甲瓒溶解液   二甲基亚砜DMSO4.3. 用胰酶消化各组织，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10104 /ml。4.4. 每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，设置5个复孔（边缘孔用无菌PBS填充）。 4.5. 5%CO2，37孵育，2h，倒置显微镜下观察。4.6. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 4.7. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 4.8. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 4.9. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）5. microRNA122的检测用市售的TRI试剂（Sigma）提取miRNA，从GenBank上获取miRNA122的序列，采用Northern blotting，所需LNA可从购买5.1. 制备探针： 10pmol的放射性同位素（- 32P - dATP）标记的LNA修饰的寡核苷酸和1L的10T4多核苷酸激酶缓冲液，加水混合至8.5L。5.2. 加入1l的T4多核苷酸激酶，1微升 - 32 P ATP（0.4活度），在37环境中孵育60分钟。加入1TE以补足体积至50l。5.3. 检查并纯化被由放射性标记的核苷酸所掺入的探针，用离心柱（如快速离心柱，罗氏公司）去除未掺入的游离核苷酸，按照制造商的指示和测量1微升纯化探针的放射性。将制成的探针作为一抗待用。5.4. RNA样品获得：组织细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4，13,000g离心15min。取上清液作为样品。5.5. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。5.6. 转膜5.7. RNA固定：5.7.1. UV交联：将膜用UV照射交联。总照射剂量依膜的不同生产商而异，按操作手册进行。5.7.2. 真空烘烤固定：将膜夹在两张滤纸之间，80真空烘烤2小时。5.8.     杂交5.8.1. 将膜置于杂交袋中5.8.2. 将标记好的探针于100煮沸1015分钟，立即放冰浴冷却10分钟，用杂交液稀释成所需浓度。5.8.3. 将杂交袋中预杂交液倒出，加入10ml新鲜的Hyb杂交液（65预热，已加入变性的探针），排除气泡，放65水浴振荡杂交过夜。5.8.4. 取出杂交膜，SDS中洗涤5.9      检测杂交信号（化学发光法）5.9.1. 封闭：20ml封闭液中封闭30分钟，弃去封闭液。5.9.2. 离心：13000rpm下离心，离心后用封闭液稀释，1lAnti-Dig-AP加入20ml封闭液，混匀，与膜一起孵育30分钟。5.9.3. 去除抗体溶液，洗涤缓冲液洗膜215分钟5.9.4. 去除洗膜缓冲液，在检测缓冲液中平衡膜2次，每次两分钟。5.9.5. 用检测缓冲液稀释CDP-Star底物（1:100），室温下放置5分钟。5.9.6. 排去多余的底物溶液，保鲜膜包裹，置暗盒中对X光片曝光，曝光时间约为1-60分钟。5.10     本次实验由于网上可以买到试剂盒，为了节省时间，可以按照试剂盒说明书操作检测。预期结果（1） 肝癌组织与病毒感染肝癌组织miR122表达水平较正常肝组织为低，细胞活性为高，HO-1表达水平为高，且病毒感染后HO-1表达水平较未感染病毒的肝癌组织为高，上述指标均具有显著性差异（p<0.01)； p="">0.05)，但两指标均较正常组织为高（p<0.01)； p="">0.05)。存在问题（1） HCMV与MCMV之间的差异对实验结果可能会有影响；（2） 实验设计中使用了HO-1抑制剂以及转染miR122过表达载体，细胞活性下降。而低活力细胞有可能本身会低表达HO-1蛋白或miR122，对于实验结果的影响需要进一步依靠实验设计来排除干扰。若miR122过表达使细胞活性下降同时观测到HO-1含量下降，可考虑再加入HO-1诱导剂观察肝癌细胞活性是否发生变化。（3）关于HO-1对肿瘤细胞生长影响的研究有不同的结论。例如2013年有台湾学者报道通过诱导HO-1表达可使热休克蛋白90（HSP 90）表达下降且通过HO-1氧化血红素所得副产物CO抑制乳腺癌细胞的生长28，此类实验结果与本课题所阅文献以及实验思路有所冲突，因此关于HO-1的表达对肿瘤可以有抑制作用还是促进作用通过本课题可以进一步探究。（4）本项目建立的小鼠肝癌模型属于早期肝癌，进行HO-1干预的实验结果与临床上中晚期使用索拉非尼进行化疗的效果之间可比程度如何尚需进行进一步实验，深入挖掘miR122与HO-1之间的通路。预期结论肝癌细胞中miR122表达下调，其可能作为HO-1转录的抑制因子而使肝癌细胞HO-1表达上调。上调的HO-1可能与细胞内调控生长的信号之间发生关联，促进细胞增殖分裂，使用HO-1抑制剂可以使肿瘤细胞生长减缓，或可成为肿瘤治疗新靶点。参考文献1. 严杰.医学微生物学.2版，北京：高等教育出版社，2011.p2642. 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