微滴式数字PCR定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用_谢志勤.pdf

2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医微滴式数字微滴式数字PCRPCR定量检测滑液囊支原体定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用方法的建立及应用谢志勤，谢芝勋*，张艳芳，范晴，谢丽基，万丽军，罗思思，李孟，张民秀，曾婷婷，黄娇玲，王盛，李丹，韦悠，李小凤，任红玉，阮志华（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，农业农村部中国-东盟（广西）跨境动物疫病防控重点实验室，广西南宁530001）摘要：为绝对定量滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS），试验根据已发表的MS VlhA基因序列，针对其保守区域分别设计了1对特异引物和1条探针，建立了ddPCR定量检测MS的方法，并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：建立的方法最佳引物浓度为20mol/L，最佳探针浓度为10 mol/L，最佳退火温度为54；该方法仅检测出MS毒株，不能检测出其他禽源病原，MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/L，3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%；45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示，该方法的MS阳性检出率（11.1%）高于荧光定量PCR（8.9%）。结果表明，建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好，为绝对定量MS提供了适合的技术手段。关键词：微滴式数字PCR；定量检测；鸡滑液囊支原体中图分类号：S852.62文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-39-07收稿日期：2022-05-11；修回日期：2022-07-15基金项目：广西重点研发计划（桂科AB16380003）；国家“万人计划”领军人才专项（W02060083）；“广西八桂学者”专项（2019A50）作者简介：谢志勤（1965-），男，本科，研究员，主要从事畜禽疫病研究，E-mail：*通讯作者：谢芝勋（1963-），男，本科，研究员，主要从事禽病研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.007Establishment and Application of Droplet Digital PCR forQuantitative Detection of Mycoplasma synoviaeXIE Zhiqin,XIE Zhixun*,ZHANG Yanfang,FAN Qing,XIE Liji,WAN Lijun,LUO Sisi,LI Meng,ZHANG Minxiu,ZENG Tingting,HUANG Jiaoling,WANG Sheng,LI Dan,WEI You,LI Xiaofeng,REN Hongyu,RUAN Zhihua（Key Laboratory of China(Guangxi)-ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Guangxi Veterinary Research Institute,Nannning,Guangxi 530001）Abstract：To absolutely quantify of Mycoplasma synoviae(MS),a set of specific oligonucleotide primers and probe were designed and synthesized to recognize the distinct genomic sequences of VlhA gene based on published sequences of MS.As established to detect MS with this primers and probe,and specificity,sensitivity and repeatability of the established method were detected.The results showed that the optimizing reaction conditions of the established method were 20 mol/L of primers,10 mol/Lof probe,54 for annealing temperature.All MS strains were amplified and did not cross-react with other avian pathogens bythis method.The minimum limit for quantitative detection of MS recombinant plasmid DNA was 3.5 copies/L.The coefficientsof variation were all less than 5%for three consecutive dilution MS recombinant plasmids.Forty-five samples of throat swabs,-392023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）可感染不同品种和日龄的鸡，引发鸡滑液囊支原体病。雏鸡感染MS可引起鸡关节囊、腱鞘膜发炎，故又称鸡传染性滑膜炎病，可导致鸡单侧或双侧脚胫跗跖跗关节肿大，进一步引发鸡内脏实质器官发生肿大，生长发育迟缓，淘汰率高1。种鸡和蛋鸡感染 MS 可引发呼吸道症状，生产性能下降2-3。MS感染呈世界性流行4-6，鸡可常年感染，冬春季节发病较多。鸡群感染MS后很难清除7，导致机体抵抗力下降，容易继发其他病原感染，且一旦发生混合感染，会加重病情，导致死亡率大大增加，并造成极大的经济损失。目前防控MS感染采用的是疫苗免疫和药物防治两种途径8-9，但由于各种因素的影响，MS感染依然在鸡群中时有发生。及时准确诊断是防控MS感染的关键措施之一，实验室诊断方法如分离鉴定10、PCR11-12、荧光定量PCR13-14、LAMP15等在MS的临床诊断中存在一定不足，如分离鉴定方法繁琐，诊断周期长；普通PCR检测敏感性虽达1 pg/L DNA，但需要进行电泳，费时且易增加污染风险；荧光定量PCR检测的敏感性达20拷贝/L，但需要通过内参来建立标准曲线及扩增的Ct值来计算拷贝数，常受内参的稳定性及Ct值的影响，且只能实现相对定量检测；LAMP检测敏感性达100拷贝/L，但操作中易受污染，假阳性较多。微滴式数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）是近几年发展起来的技术，其方法是通过油包水（反应液）将反应液分为数万个独立的纳米级微滴，在每个微滴完成PCR反应，完成后通过微滴读取仪对逐个微滴进行检测记录，软件自动读取统计带荧光（阳性，蓝色）与未带荧光（阴性，黑色）微滴个数与比例，并自动计算出拷贝数，从而实现对核酸的绝对定量。目前该技术在很多领域包括动物疫病病原检测诊断方面已有成功的应用，如原霖等16建立的ddPCR方法能检测到0.8拷贝/L的非洲猪瘟病毒，谭建锡等17采用微滴数字PCR方法成功检测到4.7拷贝/L的H1亚型猪流感病毒。在MS含量低的感染早期确诊是防控MS感染的关键措施之一，但需要建立一种敏感度高的绝对定量检测方法，以便及时确诊。为解决这一问题，本研究建立了ddPCR检测MS方法，为早期诊断MS感染提供检测工具。1材料与方法1.1试验毒株滑液囊支原体（MS）毒株（K1415、28、FMT、PMS122）、鸡毒支原体（MG）毒株（S6、K2221、A5969）、禽衣阿华支原体（MI）K-1805株由美国康涅狄格大学Mazhar I.Khan教授惠赠。禽偏肺病毒（APV）MN-10株由美国宾夕法尼亚州立大学Huagang Lu教授惠赠；禽传染性支气管炎病毒（IBV）Mass 41株、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）BJ株、新城疫病毒（NDV）La Sota株、禽呼肠孤病毒（ARV）S1133 株、H9N2 亚型禽流感病毒（H9N2AIV）066C株由本实验室保存18；鸡白痢沙门氏菌（SP）C79-13株和大肠杆菌（E.coli）O2株购自中国国家兽医微生物菌株保藏管理中心。1.2主要试剂Supermix for Probe ddPCR（No dUTP）、dropletgeneration oil for Probes ddPCR、Droplet Reader Oil、DG8 Cartridges、DG8 gaskets、Pierceable Foil HeatSeal购自美国Bio-Rad公司；EasyPure Virual DNA/RNA Kit、Gel Extration Kit购自北京全式金生物技术有限公司；TIANamp Bacteria DNA kit购自天根生化科技（北京）有限公司；RT-PCR扩增试剂盒、Premix Ex Taq 试 剂 盒、100 bp DNA Ladder、pMD18-T、大肠杆菌DH5、T4连接试剂盒、凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。1.3主要仪器微滴生成仪（QX200 Droplet generator）、热封仪（PX1）、微滴数字读取仪（QX200 Droplet Reader）、梯度PCR扩增仪（T-100）购自美国Bio-Rad公司；荧光 PCR 仪（quantStudio 5）、分光光度计（Nanodrop 2000）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。1.4引物设计与合成根据已发表的MS VlhA基因（GenBank登录号：MT241266.1）序列，利用在线软件（https：/bioinfo.lungs and joint capsules collected from sick chickens were tested,the the positive detection rate of the established ddPCR(11.1%)was higher than that of fluorescent quantitative PCR(8.9%).Its indicated that the ddPCR method had strong specificity,high sensitivity and good repeatability for MS detection,which supplied a suitable method for absolute quantitation of MS.Key words：droplet digital PCR(ddPCR);quantitative detection;Mycoplasma synoviae-402023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023ut.ee/primer3-0.4.0/）设计ddPCR特异性引物和探针，并在线进行BLAST分析，在探针序列的5端添加FAM荧光基团，3端添加BHQ1淬灭基团。引物及探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并经HPLC纯化，引物和探针序列见表1。1.5核酸的提取按 EasyPure Virual DNA/RNA 试剂盒说明书提取 APV、IBV、ILTV、NDV、ARV、H9N2 AIV 的DNA/RNA，按TIANamp Bacteria DNA kit说明书提取MS、MG、MI、SP及E.coli的DNA，提取的DNA/RNA直接用于扩增或于-80 保存备用。1.6标准品模板的制备用MS F/MS R引物扩增MS K1415 VlhA基因，扩增产物经电泳后，将含大小约195 bp的目的片段回收、纯化，与pMD18-T载体连接并转染到大肠杆菌DH5。转染后的质粒DNA经PCR鉴定并送宝生物工程（大连）有限公司测序，测序正确的质粒DNA用分光光度仪测定OD260nm/OD280nm值，计算拷贝数，所得的重组质粒DNA即为标准品，小管分装并保存于-80 备用。1.7ddPCR反应的建立及条件优化ddPCR反应体系为20 L：2Supermix 10 L，540 mol/L 的 MS F/MS R 引物各 1 L，2.540 mol/L的MS Pro 1 L，标准品模板2 L，加灭菌ddH2O补足至20 L。在微滴发生卡的第二排孔分别加入上述反应液20 L，第三排孔每孔加入微滴生成油70 L，盖上衬垫，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排孔。吸取生成的微滴至96孔板内，加铝膜置PX1热封仪上，程序设置为180 10 s进行封膜。封膜的96孔板放入PCR扩增仪上进行扩增，反应程序：95 10 min；94 30 s，退火温度设置5160 1 min（2/s），共进行40个循环；98 10 min；4 结束。反应结束后将96孔板置QX200 Droplet Reader上读取信号并进行数据分析。分别设置MS F/MS R引物浓度 MS Pro浓度为5 2.5、10 5、15 10、20 10、25 15、30 20、40 40、40 0，退火温度为 51、53、54、55、56、57、58、60 共8个不同梯度进行ddPCR反应条件优化。1.8ddPCR特异性测定将 H9N2 AIV、IBV、NDV、APV、ARV 的 RNA反转录为 cDNA，然后与 MS K1415、MS 28、MSFMT、MS PMS122、MG S6、MG K2221、MG A5969、MI、ILTV、SP、E.coli的DNA一起分别加入优化的ddPCR反应体系中进行特异性检测。1.9ddPCR敏感性及重复性测定MS重组质粒标准品测定浓度后以10倍梯度稀释，稀释范围在10-310-10，每个稀释度取2 L加入已优化好的ddPCR反应中，以检测ddPCR反应的敏感性。同时采用相同的引物探针以及同一模板浓度进行荧光定量PCR检测，反应体系25 L：Premix Ex Taq 12.5 L，20 mol/L MS F/MS R各1 L，10 mol/L MS Pro 1 L，标准品模板2 L，10 mol/L ROX 1 L，灭菌ddH2O 6.5 L。扩增程序为：95 10 min；95 15 s，54 1 min（2/s），40个循环；98 10 min；4 结束，比较两种方法的敏感性。取10-510-7三个连续稀释的质粒标准品为模板进行3次重复试验，以检测ddPCR的重复性。扩增荧光强度在4 500以下（黑色和灰色）的微滴数判定为阴性，荧光强度在4 500以上（蓝色）的微滴数判定为阳性。1.10临床样品检测2021年5月至2022年2月，广西5个不同鸡场的20日龄左右良凤花鸡雏鸡出现精神不振，伴随有轻微的呼吸道症状，个别雏鸡单侧或双侧脚关节外侧出现肿大，走路困难，食欲减少，少部分感染雏鸡出现死亡现象。采集上述病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品共计45份。分别取5 g肺脏及关节囊约按1 8加入无血清的MDEM培养基进行研磨，喉拭子加入 2 mL 无血清的 MDEM 培养基，-70 反复冻融3次，4 000 r/min离心5 min，取上清，14 000 r/min离心10 min，去上清，按TIANampBacteria DNA kit 说明书步骤提取沉淀中的总DNA。用建立的ddPCR方法进行检测，同时采用相同的VlhA基因为靶表基因，参考Huang等13建立的荧光定量PCR进行检测，荧光定量PCR引物及探针序列如下：MS-F1：5-ATAGCAATTTCATGTGGTGATCAA-3，MS-R1：5-TGGATTTGGGTTTTGAGGATTA-3，MS-p1：5-ROX-CAGCACCTGA表1所用的引物和探针序列引物和探针MS FMS RMS Pro序列（53）GCCATTGCTCCTGCTGTTATAGCAGCCTCTACAGGGTCAAFAM-AACCCAAATCCAGGAAACC-BHQ1位置7292266246164184产物大小/bp195195195预防兽医预防兽医-412023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023ACCAACACCTGGAA-Eclipse-3，引物及探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并经HPLC纯化。反应体系 25 L：Premix Ex Taq 12.5 L，10 mol/L MS-F1/MS-R1 各 1L，10 mol/LMS-p1 1 L，标准品模板2 L，灭菌ddH2O 7.5 L。扩增的程序为：95 10 min；95 15 s，60 1 min（2/s），40个循环；98 10 min；4 结束。2结果与分析2.1ddPCR退火温度优化结果结果显示，当退火温度为54 时，扩增获得的阳性微滴信号荧光强度高，与阴性微滴信号之间的荧光幅度差异大，且区分清晰明显，综合考虑这些因素，最终确定最佳扩增的退火温度为54（见图1）。2.2ddPCR引物及探针浓度优化结果结果显示，当引物MS F/MS R浓度和探针MSPro浓度为20 10时，检测到的阳性微滴信号最高，且阳性微滴与阴性微滴之间的荧光幅度差异最大，区分明显（见图2），确定最佳引物和探针浓度为以上浓度。2.3ddPCR反应体系及程序优化结果根据优化结果，ddPCR反应体系为20 L，包含：2Supermix 10 L，20 mol/L MS F/MS R引物各1 L，10 mol/L MS Pro 1 L，DNA/RNA模板2 L，用ddH2O补足至20 L。反应程序：95 10min；9430s，设置退火温度541min（2/s），40个循环；98 10 min；4 结束。2.4ddPCR特异性检测结果结果显示，各孔扩增总微滴生成量均达1万以上，且每孔较均衡，经自动计算扩增结果为阳性微滴孔的样品有 MS K1415、MS 28、MS FMT 和MS PMS122，其他样品没有出现阳性微滴（见图3），表明特异性强。2.5ddPCR敏感性检测结果结果显示，ddPCR 最低微滴数检出限为3.5拷贝/L（10-8稀释），而荧光定量PCR只检测出10-7稀释的质粒标准品（33.6拷贝/L），10-8稀释的质粒标准品没有检出。ddPCR和荧光定量敏感性结果见图4。用5个连续稀释的MS重组质粒标准品及检测阳性拷贝数的对数值绘制ddPCR绝对定量曲线，结果为线性，线性方程为y=-0.87x+14 00012 00010 0008 0006 0004 0002 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000 120 000微滴数12345678注：1.5 2.5；2.10 5；3.15 10；4.20 10；5.25 15；6.30 20；7.40 40；8.40 0。图2MS ddPCR引物及探针浓度优化结果30 00025 00020 00015 00010 0005 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000 120 000微滴数12345678注：1.60；2.58；3.57；4.56；5.55；6.54；7.53；8.51。图1ddPCR退火温度优化结果注：1.MS K1415；2.MS 28；3.MS FMT；4.MS PMS122；5.MG S6；6.MGK2221；7.MG A5969；8.MI；9.H9N2 AIV；10.IBV；11.ARV；12.NDV；13.APV；14.ILTV；15.SP；16.E.coli。图3MS ddPCR特异性检测结果20 00015 00010 0005 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000120 000微滴数910111213141516B.其他禽源病原检测结果20 00015 00010 0005 0000荧光强度040 00080 000120 000微滴数12345678A.MS、MG、MI检测结果预防兽医预防兽医-422023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.20237.32，斜率为-0.87，R2值为0.993 3，结果见图5。2.6ddPCR重复性检测结果结果显示，三组重复检测的变异系数在1.75%3.4%，均小于5%，表明重复性好（见表2）。2.7临床样品的检测结果结果见图69和表3。ddPCR检测结果MS阳性有5份样品，分别为关节囊样品2份、喉拭子样品2份及肺样品1份，检出的样品中MS拷贝数在23330拷贝/L之间，阳性检出率为11.1%（5/45）。荧光定量PCR检测MS阳性有4份，分别为关节囊样品2份、喉拭子样品2份，阳性检出率为8.9%（4/45）。16 00014 00012 00010 0008 0006 0004 0002 0000荧光强度020 00040 00060 000 80 000 100 000 120 000 140 000微滴数12345678注：17.10-310-9依次10倍稀释的pMD18-MS VlhA重组质粒DNA；8.pMD18-T空载体阴性对照。A.MS ddPCR敏感性检测结果图4MS ddPCR和荧光定量PCR敏感性检测结果8.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0荧光强度2468 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40循环数12345678注：17.10-310-9依次10倍稀释的pMD18-MS VlhA重组质粒DNA；8.pMD18-T空载体阴性对照。B.荧光定量PCR敏感性检测结果4.54.03.53.02.52.01.51.00.500246810样品稀释度的对数值拷贝数的对数值y=-0.87x+7.32R2=0.993 3图5ddPCR检测MS重组质粒标准品的绝对定量曲线表2ddPCR重复试验结果质粒标准品稀释10-510-610-73次检测拷贝数3 453.60342.6034.603 473.70351.1035.103 568.20358.5035.90标准差61.197.961.21变异系数/%1.752.273.4025 00020 00015 00010 0005 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000120 000微滴数910111213141516注：116.喉拭子样品。B.第916份喉拭子样品检测结果图7鸡喉拭子样品ddPCR检测结果25 00020 00015 00010 0005 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000120 000微滴数12345678A.第18份喉拭子样品检测结果25 00020 00015 00010 0005 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000120 000微滴数12345678A.第18份关节囊样品检测结果20 00015 00010 0005 0000荧光强度040 00080 000120 000微滴数910111213141516注：1.pMD18-MS VlhA重组质粒；2.pMD18-T空载体阴性对照；316.关节囊样品。B.第916份关节囊样品检测结果图6鸡关节囊样品ddPCR检测结果预防兽医预防兽医-432023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.20233讨论鸡一旦感染了MS，很难从鸡群中彻底根除，且容易诱发其他病原体感染而形成混合感染13，进一步加大MS防控难度。及早准确诊断是防控MS的重要前提，传统的病原分离鉴定是标准的经典检测方法，但存在诊断周期长、技术要求繁杂等不足，不能满足快速检测的需求。普通PCR方法较传统方法具有较好的特异性和敏感性，但也存在检测不够敏感，可能存在漏检现象，不能及时准确发现病原体，给防控带来一定风险。荧光定量PCR方法是目前检测应用较多的检测方法之一，其特异性和敏感性比普通PCR高，也是唯一能对模板实现相对定量的检测方法。本研究建立的MS ddPCR检测方法，不仅与荧光定量PCR检测方法一样，具有很好的特异性，而且能实现绝对定量检测，结果直接给出阳性检测样品的拷贝数，不需要通过标准曲线及扩增的Ct值来计算阳性样品的拷贝数，检测结果准确、直观。敏感性是建立检测方法的一个重要标志，会直接影响对病原的检出率。本研究建立的方法可检测到3.5拷贝/L的MS重组质粒标准品模板，比荧光定量PCR方法敏感10倍，这对MS感染早期病原含量较低时的快速检测具有积极意义。而且从临床样品的检测结果中，ddPCR方法检出MS阳性的样品数量多于荧光定量PCR方法检出的样品数量，再次验证了ddPCR方法在检测低拷贝数的 MS 时，其敏感性要优于荧光定量 PCR 方法。因此，本方法的建立应用对于早诊断、早发现、早预防，降低MS感染引起的发病率和死亡率均有重要意义。本研究建立的ddPCR方法具有特异、敏感、准确和绝对定量的特点，由于本次对临床样品检测验证的数量有限，后续将会加大对MS临床样品数量的检测验证，特别是加大对含低拷贝数MS的临床样品如MS感染早期的检测，为该方法的推广应用提供数据支撑。ddPCR方法在各领域已得到广泛应用与发展，特别是在禽病检测方面发挥了重要的作用19-20。该方法目前存在的主要问题是仪器设备及试剂较昂贵，不利于推广应用。随着ddPCR技术应用的普及，ddPCR仪器及试剂的国产化，检测成本有望大幅度降低，操作也进一步简单化。14 00012 00010 0008 0006 0004 0002 0000荧光强度040 00080 000120 000微滴数89101112131415注：115.肺脏样品。B.第815份肺脏样品检测结果图8鸡肺脏组织样品ddPCR检测结果C.鸡肺脏样品ddPCR检测结果注：1.pMD18-MS VlhA重组质粒；2.pMD18-T空载体阴性对照；318.关节囊样品；1932.喉拭子样品；3347.肺脏样品。5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0荧光强度2468 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40循环数142452223、6181921、23、25323347图9鸡临床样品荧光定量PCR检测结果14 00012 00010 0008 0006 0004 0002 0000荧光强度020 00040 00060 00080 000100 000微滴数1234567A.第17份肺脏样品检测结果表345份临床样品ddPCR和荧光定量PCR检测结果样品序号123456789101112131415ddPCR-+-qPCR-+-样品序号161718192021222324252627282930ddPCR-+-+-qPCR-+-+-样品序号313233343536373839404142434445ddPCR-+-qPCR-注：114.关节囊样品，1630.喉拭子样品，3145.肺脏样品；“+”表示MS检测阳性，“-”表示MS检测阴性。预防兽医预防兽医-442023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.20234结论本研究建立的MS ddPCR检测方法，具有特异性好、敏感性强、准确性和稳定性高的特点，能实现MS的绝对定量检测，为低拷贝数MS的检测提供了技术方法，也为 MS 感染的早诊断、早发现、早预防提供技术支撑。参考文献：1 SUN S K，LIN X，CHEN F，et al.Epidemiological investigationof Mycoplasma synoviae in native chicken breeds in China J.BMC veterinary research，2017，13（1）：115-124.2 KURSA O，PAKULA A，TOMCZYK G，et al.Eggshell apex abnormalities caused by two different Mycoplasma synoviae genotypes and evaluation of eggshell anomalies by full-field opticalcoherence tomography J.BMC veterinary research，2019，15（1）：1-8.3 JEON E O，KIM J N，LEE H R，et al.Eggshell apex abnormalities associated with Mycoplasma synoviae infection in layersJ.Journal of veterinary science，2014，15（4）：579-582.4 XU B，CHEN X，LU F Y，et al.Comparative genomics of Mycoplasma synoviae and new targets for molecular diagnostics J.Frontiers in veterinary science，2021，8：1-13.5 AMER M M，MEKKY M H，FEDAWY S H.Molecular identification of Mycoplasma synoviae from breeder chicken flockshowing arthritis in Egypt J.Veterinary world，2019，12（8）：535-541.6 ABOLNIK C，GOUWS J.Extended survival times of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae on kanekalon synthetic hair fibres J.Poultry science，2014，93：8-11.7 招丽婵，覃健萍，王占新，等.鸡滑液囊支原体的流行调查及不同地区分离株药物敏感性分析 J.中国兽医杂志，2019，55（6）：9-13.8 FEBERWEE A，MORROW C J，GHORASHI S A，et al.Effectof alive Mycoplasma synoviae vaccine on the production of egg-shell apex abnormalities induced by a M.synoviae infectionpreceded by an infection with infectious bronchitis virus D1466J.Avian pathology：journal of the W.V.P.A，2009，38（5）：333-340.9 丁美娟，周勇岐，张小飞，等.鸡滑液囊支原体病药物治疗与疫苗免疫及两种方法联合比较试验 J.中国家禽，2019，41（14）：73-75.10宋春，王柏林，李梅，等.鸡滑液囊支原体贵州株的分离鉴定及VlhA基因序列分析 J.中国畜牧兽医，2022，49（4）：1516-1523.11谢志勤，谢芝勋，庞耀珊，等.应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体 J.畜牧与兽医，2000，32（5）：4-6.12丁美娟，卢凤英，尹秀凤，等.应用PCR快速检测鸡滑液囊支原体的研究 J.中国家禽，2015，37（19）：68-70.13 HUANG L，XIE Z X，XIE L J，et al.A duplex real-time PCRassay for the detection and quantification of avian reovirus andMycoplasma synoviae J.Virology 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