外源表没食子儿茶素没食子酸...对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响_方明雅.pdf

浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):138 145http:/www zjnyxb cn方明雅，余宏伟，武雅娴，等 外源表没食子儿茶素没食子酸酯对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响 J 浙江农业学报，2023，35(1):138 145DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.15收稿日期:2021-08-20基金项目:浙江省自然科学基金(Y19C160031);国家重点研发计划(2017YFE0107500)作者简介:方明雅(1994)，女，河北张家口人，硕士研究生，主要从事园艺作物栽培生理研究。E-mail:857671169 qq com*通信作者，李鑫，E-mail:lixin tricaas com;刘海河，E-mail:yylhh hebau edu cn外源表没食子儿茶素没食子酸酯对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响方明雅1，余宏伟2，武雅娴1，韩文炎3，李鑫3，*，刘海河1，*(1 河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071700;2 建德市农业农村局，浙江 建德 311600;3 中国农业科学院 茶叶研究所，浙江 杭州310008)摘要:白粉病是甜瓜生产中常见的真菌病害，严重影响果实的产量和品质。以甜瓜品种甜宝为试验材料，通过外源表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理，探讨 EGCG 对甜瓜白粉病抗性的影响。通过二氨基联苯胺(DAB)染色和丙二醛(MDA)的测定结果表明，外源喷施 EGCG 能够减少白粉病侵染所引起的活性氧积累，MDA 含量显著下降，甜瓜叶片细胞膜脂过氧化程度降低。甜瓜叶片抗氧化酶活性分析表明，外源 EGCG预处理，过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)4 种主要抗氧化酶活性都显著升高。抗氧化酶活性也受到白粉病入侵的诱导，但外源 EGCG 预处理进一步促进了抗氧化酶的提高。利用实时定量 PCR 技术进一步分析了相关基因的表达情况，结果显示，抗氧化酶相关基因CmCAT、CmAPX、CmSOD、CmPOD 也均受到外源 EGCG 的诱导表达。上述研究结果表明，外源喷施 EGCG 可以通过调控甜瓜叶片的抗氧化酶系统，降低白粉病侵染所引起的活性氧爆发，从而提高了甜瓜对白粉病的抗性。关键词:甜瓜;白粉病;表没食子儿茶素没食子酸酯;抗氧化酶中图分类号:S436.5文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0138-08Effects of exogenous epigallocatechin gallate on resistance of melon seedlings to powdery mil-dewFANG Mingya1，YU Hongwei2，WU Yaxian1，HAN Wenyan3，LI Xin3，*，LIU Haihe1，*(1 College of Horticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071700，Hebei，China;2 Jiande Agriculturaland Rural Bureau，Jiande 311600，Zhejiang，China;3 Tea Research Institute，Chinese Academy of AgriculturalSciences，Hangzhou 310008，China)Abstract:Powdery mildew is a common fungal disease in melon production，which seriously affects the yield andquality of melon fruit Effects of exogenous epigallocatechin gallate(EGCG)on the resistance of melon to powderymildew was explored in this study The results of diaminobenzidine(DAB)staining and malondialdehyde(MDA)determination showed that exogenous spraying with EGCG could reduce the accumulation of reactive oxygen speciescaused by powdery mildew infection，accompanied with the content of MDA decreased significantly，and the degreeof cell membrane lipid peroxidation was decreased The analysis of antioxidant enzyme activities in melon leavesshowed that the activities of catalase(CAT)，ascorbate peroxidase(APX)，superoxide dismutase(SOD)and per-oxidase(POD)were increased significantly after exogenous EGCG pretreatment Antioxidant enzymes activity wasalso induced by powdery mildew invasion，but exogenous EGCG pretreatment will further promote the improvement ofantioxidant enzymes The expression of related genes was further analyzed by real-time quantitative PCR The resultsshowed that the antioxidant enzyme related genes CmCAT，CmAPX，CmSOD and CmPOD were also induced by exog-enous EGCG The above results revealed that exogenous spraying EGCG could reduce the reactive oxygen speciesburst induced by powdery mildew infection by regulating the antioxidant enzymes system to improve the resistance ofmelon to powdery mildewKey words:melon;powdery mildew;epigallocatechin gallate;antioxidant enzymes甜瓜(Cucumis melo L)是一年生双子叶植物。由于其果实色、香、味俱佳，营养成分丰富且经济效益高而在世界各地广泛栽培，是世界十大水果之一1。我国是世界甜瓜种植面积最大的国家2。然而，在甜瓜的栽培过程中，尤其是在设施栽培中容易受到各种病害的威胁，其中白粉病是最严重的病害之一。甜瓜白粉病是由白粉病菌(Podosphaera xanthii)引起的一种毁灭性病害，从甜瓜苗期到果实成熟，无不影响着甜瓜植株的生长和果实的产量及品质3。温室大棚等高温高湿的环境更加有利于白粉病的发生和传播。另外，栽培管理措施也与白粉病的发生有着密切的关系。例如，施肥不足、灌溉不及时、光照不充足等均会降低甜瓜的抗性水平，诱发白粉病4。研究表明，自 20 世纪 70 年代以来，人们相继采用苯并咪唑类、取代嘧啶类、麦角甾醇生物合成抑制剂类和甲氧丙烯酸酯类杀菌剂防治瓜类白粉病，但病原菌在短时间内陆续对上述杀菌剂产生了抗药性，田间防治效果下降或完全丧失。而采用化学药剂进行防治则会产生药剂残留以及土壤和环境污染等问题4。因此，采用生物防治或选育抗病的甜瓜品种是防止和减轻甜瓜白粉病危害的有效途径。但采用常规育种和杂交育种技术进行甜瓜抗白粉病育种工作，育种周期较长，难以在短时间内获得优质抗病品种。使用分子标记辅助育种可以加快选育白粉病抗病品种，但由于甜瓜对白粉病抗性遗传机制的复杂性以及缺乏高效的白粉病抗性连锁标记，甜瓜抗白粉病育种工作一直进展缓慢。因此，研究环境友好型、绿色无污染的甜瓜白粉病防治手段对甜瓜生产具有重要的意义。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocate-chin gallate，EGCG)属于黄酮类化合物，是茶多酚中含量最丰富的一种组分，是茶叶特有的儿茶素，其含量占茶多酚制品的 40%50%，因其活跃的抗氧化特性而一直备受关注。与其他儿茶素组分相比，EGCG 具有更强的抗氧化能力。在医学方面的研究也表明，EGCG 具有多种抗炎5、抗氧化6 和骨调节特性7。近年来，大量关于抗肿瘤治疗的研究表明，EGCG 可单独或与标准疗法联合作为口腔癌的治疗药物，可以增强疗效，并且可减少肿瘤患者治疗的副作用8。EGCG 可以提高植物的非生物胁迫，例如外源 EGCG 不仅提高了盐胁迫下种子的发芽率，而且提高了种子的发芽势和发芽指数;150 mmolL1NaCl 处 理 的 种 子 产 生 了 大 量 的 活 性 氧(ROS)，加剧了细胞膜脂过氧化程度，而 100mol L1EGCG 处理清除了过量的 ROS。100mol L1EGCG 处理显著提高了胚根抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)活性9。抗氧化酶系统分析表明，EGCG 能提高盐胁迫下超氧化物歧化酶(POD)、过氧化物酶(POD)、APX 和 CAT 的活性10。植物生理研究表明，外源 EGCG 在冷热胁迫下对抗氧化酶活性的提高最为显著。尽管外源 EGCG 在干旱条件下抑制或不改变 APX、SOD 和 POD 的活性，但 EGCG 处理后，干旱胁迫下植物体内 CAT 活性显著增加，表明 CAT 可能在 EGCG 诱导的耐旱性中发挥主要作用11 12。近年来关于 EGCG 在植物应对非生物胁迫中的调控机理也被进一步阐明。但关于 EGCG 在植物与生物胁迫互作中的作用及其调控机理仍然有待进一步探讨和开发应用。本研究拟以甜瓜品种甜宝为试验材料，通过外源 EGCG 处理，探讨 EGCG 对甜瓜白粉病抗性的影响，并利用生理生化分析和实时定量 PCR 等分子生物学技术阐明外源 EGCG 对甜瓜白粉病抗性的影响及其调控机理，以期利用外源 EGCG931方明雅，等 外源表没食子儿茶素没食子酸酯对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响提高甜瓜对生物胁迫尤其是白粉病的抗性水平，从而提高甜瓜在设施栽培中的产量、品质以及经济效益。1材料与方法1.1实验材料与处理供试甜瓜品种为甜宝，由西北农林科技大学惠赠。EGCG 采购于湖州荣凯植物提取有限公司，分析纯(99%)。白粉病病原菌由浙江省农业科学院从发病甜瓜植株分离，并通过电子显微镜观察确定其为白粉病病原菌。试验在中国农业科学院茶叶研究所温室进行，2020 年 5 月中旬至 7 月下旬进行预实验，在预实验基础上于 2020 年8 月至2021 年5 月完成实验。本试验设置以下 4 个处理，即用清水喷施叶片(Control)、用 EGCG 喷施叶片(EGCG)、只接种白粉病病原菌(Podosphaera x)、喷施 EGCG 并且接种白粉病病原菌(EGCG+Podosphaera x)，每个处理 30 株甜瓜幼苗。甜瓜种子于 55 进行温汤浸种 15 min，随后放于 28 培养箱催芽。待甜瓜种子露白后，将其播于穴盘中，穴盘苗生长至一叶一心时移栽至直径 20 cm 的花盆中，培养箱昼/夜温度为 28/18，昼/夜相对湿度为 70%80%/85%95%，光照/黑暗条件为16 h/8 h。待甜瓜幼苗长至六叶一心时，用 100 mol L1EGCG 溶液喷施叶片，至叶片腹背布满溶液且不滴落为宜，经过12 h 后，进行白粉病病原菌接种试验，将田间发病甜瓜叶片上的白粉病菌抖落，配置成 2 105mm3孢子悬浮液，并将孢子悬浮液均匀喷施在甜瓜叶片上，待接种后 12 h 后进行取样。样品采集后立即放入液氮中，随后放于实验室 80 超低温冰箱进行保存。1.2测定项目与方法1.2.1二氨基联苯胺(DAB)染色参考 Li 等13 的方法进行 DAB 染色。配制质量体积比为 0.1%的 DAB 溶液，将鲜叶按照处理组浸没于 DAB 溶液中，25 下光照培养使之充分吸收 DAB 染色液，待叶片上出现深褐色类似伤害斑点即可停止染色，将叶片放入 95%乙醇中，置于 100 水浴煮沸 15 min，再将叶片放置于新鲜的 95%乙醇中，待叶绿素完全脱去，进行拍照。1.2.2丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性测定参考 Ahammed 等14 的方法进行 MDA 含量，以及 SOD、APX、POD、CAT 活性的测定。粗酶液的提取:取甜瓜冷冻叶片 0.2 g，分 3次加入总体积 3 mL 50 mmol L1pH 7.8 磷酸缓冲液(PBS)，再加2%PVP 研磨，12 000 g 4 离心 20 min，取上清液，用于各种酶活性和 MDA 含量的测定。MDA 含量的测定:取 1 mL 提取液，加入 3mL TCA 反应液，在95水浴保温30 min，立即置于冰浴中完全冷却，15 000 g 离心 10 min，取上清液，测定其在 532 nm 和 600 nm 处的紫外吸收值。SOD 活性的测定:取 50 L 上清液，加入 3mL NBT 反应液，空白对照为 50 L pH 值 7.8 磷酸缓冲液中加入 3 mL NBT 反应液，将样品和空白对照置于 25 光照下，充分照光 25 min，保证受光均匀，以缓冲液调零，在 560 nm 下检测其紫外吸收值。POD 活性的测定:取 1 700 L 25mmol L1PBS(pH 值 7.0)缓冲液，分别加入 1%愈创木酚100 L，20 mmol L1过氧化氢100 L，以及 100 L 粗酶提取液，立即置于 470 nm 下检测其紫外吸收值。CAT 活性的测定:取 1 700 L25 mmol L1PBS(pH 值 7.0)缓冲液，分别加入100 mmol L1过氧化氢 200 L，以及 100 L 粗酶提取液，立即置于 240 nm 下检测其紫外吸收值。APX 活性的测定:取 1 700 L 25 mmolL1PBS(pH 值 7.0)缓冲液，分别加入 5 mmol L1抗坏血酸100 L，20 mmol L1过氧化氢100 L，以及 100 L 粗酶提取液，立即置于 290 nm 下检测其紫外吸收值。1.2.3实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析本次实验采用 Tiangen 试剂盒提取甜瓜叶片的 RNA 并进行反转录。利用 Light Cycler 480II和 SYBR Green 荧光染料试剂盒进行 qRT-PCR 分析，引物序列见表 1。SYBR Green 10 L，ddH2O8.8 L，正义引物0.1 L，反义引物0.1 L，DNA模板 1 L，共组成20 L 的反应体系。PCR 的反应条件为:95 反应 30 s 后，相同温度下变性 10s，最后在 58 下退火 45 s，进行 40 个循环。PCR 循环完成后，分析熔解曲线，确定得到的 PCR041浙江农业学报第 35 卷第 1 期表 1实时荧光定量 PCR 引物设计Table 1Primers used for qRT-PCR基因 Gene正向引物 Forward primer(53)反向引物 Reverse primer(53)CmCATTGGATACGACGATACAATGGTGAGGACACTTAGGAGCATCmPODTTAGGACACCAGCAAGATTTGAGAAGTGAGGACATTGATCmSODTCACGCTCACCAAGAAGACGTTGGCAATTATGTTTCCCAGGTCACCCmAPXCTTCCAGATGCTCACCAATTGCGTATGCCTTCACATCmEF1aACTGTGCTGTCCTCATTATTGAGGGTGAAAGCAAGAAGAGC产物均为单一物质。采用 Livak15 的方法计算基因相对表达量。1.3数据统计使用 Origin 9.0 软件绘制图表，数据采用SPSS 统计软件进行分析。2结果与分析2.1外源 EGCG 对甜瓜白粉病抗性表型的影响本试验通过对甜瓜叶片进行组织化学染色，分析过氧化氢(H2O2)的积累情况作为甜瓜白粉病抗性的表型。DAB 染色结果显示，在接种白粉病后，甜瓜叶片的 H2O2积累增加，表现为强烈的深棕色。而外源 EGCG 预处理的甜瓜叶片则呈浅棕色，表现出相对较少的 H2O2积累量(图 1)。图 1外源 EGCG 对甜瓜白粉病抗性表型的影响Fig 1Effect of exogenous EGCG pretreatment on the phenotype of resistance in melon seedlings after powdery mildew infection2.2外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗 MDA 含量的影响MDA 是脂质过氧化的终产物，通常被认为是氧化应激或者 ROS 诱导的植物细胞膜损伤的标志14。与对照相比(清水处理)，经过白粉病处理的甜瓜幼苗 MDA 含量均显著(P 0.05)提高;而在外源 EGCG 预处理后接种白粉病 12 h，甜瓜幼苗的 MDA 含量比只接种白粉病的甜瓜幼苗显著降低，降幅为 32.6%(图 2)。2.3外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗抗氧化酶活性的影响植物的抗氧化酶系统在其应对各种生物胁迫和非生物胁迫中均发挥着重要作用。本研究中，对照条件下，外源 EGCG 处理可以在一定程度上诱导甜瓜幼苗叶片中 CAT、APX、SOD 和POD 活性，分别提高了46.65%、130.33%、37.55%图中不同字母代表差异显著(P 0.05)，下同。Different letters in the picture represented significant differences(P 0.05)The same as below图 2外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗 MDA含量的影响Fig 2Effect of exogenous EGCG pretreatment on MDAcontent in melon seedlings after powdery mildew infection141方明雅，等 外源表没食子儿茶素没食子酸酯对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响和 17.60%(图 3)。白粉病入侵也导致甜瓜叶片中抗氧化酶活性的显著(P 0.05)提高，其中CAT 活性响应最为明显，与对照相比，提高了214.85%。在白粉病侵染的条件下，外源 EGCG预处理对甜瓜叶片中的抗氧化酶活性有进一步的促进作用。与单独接种白粉病相比，外源EGCG 预处理导致 CAT、APX、SOD 和 POD 活性分 别 提 高 了 62.22%、60.64%、36.17%和32.56%(图 3)。2.4外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗抗氧化酶相关基因表达的影响进一步分析了外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗抗氧化酶相关基因表达的影响。与抗氧化酶活性的结果相一致，在经过外源EGCG 预处理后，接种白粉病，甜瓜幼苗叶片中的抗氧化酶合成相关基因 CmCAT、CmAPX、CmSOD和 CmPOD 的转录水平较其他处理均出现显著(P 0.05)上升趋势。其中 CmCAT 和 CmPOD 最为明显。与单独接种白粉病相比，外源 EGCG 预处理的甜瓜幼苗 CmCAT 和 CmPOD 基因的转录水平提高了 9.62 倍和 11.82 倍(图 4)。CmAPX和 CmSOD 基 因 的 表 达 水 平 也 分 别 提 高 了81.91%和 35.88%。3讨论在受到外界环境条件刺激或者遭遇病原物侵害时，植株最主要的表现是会在其体内产生氧化应激反应等生理生化过程，以提高自身对抗逆境胁迫的抗性。在之前的研究中我们发现，外源EGCG 可以诱导番茄植株抗氧化酶活性，缓解氧化应激15，对提高番茄幼苗对盐胁迫的耐受性发挥着重要作用。同时，EGCG 可以作为一种广谱非生物胁迫抗性诱导物质，缓解番茄对冷害、高温胁迫、干旱等的抗性14。然而，外源 EGCG在植物应对生物胁迫中的作用及其调控机理仍不清楚。本试验研究表明，外源 EGCG 显著降低了甜瓜遭遇白粉病后的甜瓜幼苗叶片中 H2O2的积累和 MDA 含量，并伴随相关抗氧化酶活性和合成基因表达量的上调。这表明外源 EGCG 增强了白粉病菌感染后甜瓜幼苗的抗氧化能力，减少了 ROS 的积累，从而提高了甜瓜对白粉病的抗性。MDA 是多不饱和脂肪酸的分解产物，MDA含量的高低展示的是植物脂膜过氧化的严重程度，过量的 MDA 会使植物存在膜损伤现象，引起图 3外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗抗氧化酶活性的影响Fig 3Effects of exogenous EGCG pretreatment on antioxidant enzyme activities in melon seedlings after powdery mildewinfection241浙江农业学报第 35 卷第 1 期图 4外源 EGCG 预处理对白粉病侵染后甜瓜幼苗抗氧化酶相关基因表达的影响Fig 4Effects of exogenous EGCG pretreatment on the expression of antioxidant enzyme-related genes in mel-on seedlings after powdery mildew infection植物组织坏死甚至死亡16 17。前人研究发现，伴生小麦能够提高西瓜根系的抗氧化酶活性18，减少 MDA 含量，提高西瓜对枯萎病的抗性。本试验中，在接种白粉病后，MDA 含量显著上升，表明白粉病入侵将导致甜瓜幼苗的膜脂过氧化程度提高。而经过外源 EGCG 处理的甜瓜幼苗的 MDA 含量显著下降。这表明，外源 EGCG可以减缓脂膜过氧化现象，防止植物细胞膜氧化损伤，维持正常的生命状态，提高了甜瓜对白粉病的抗性。近年来，研究普遍，植物中的 H2O2具有双重作用19 20，一方面，高浓度的 H2O2被认为是ROS，过量产生的 ROS 可诱导生物分子的氧化损伤，造成植物的氧化胁迫19 20。另一方面，瞬时和特异性的 H2O2积累是各种植物发育和应激反应过程中的信号物质，可以诱导植物的抗逆性21。在研究中，白粉病侵染诱导甜瓜叶片中ROS 的大量积累，ROS 过度累积会扰乱光合活性和细胞完整性，造成叶片的膜脂过氧化程度加重。此外，研究还发现，外源 EGCG 可以诱导的甜瓜叶片中少量 H2O2积累，而在白粉病侵染的条件下，外源 EGCG 预处理可以减少 ROS 积累改善植株受胁迫程度。这表明，在正常条件下，外源 EGCG 诱导 H2O2积累可能作为信号物质，参与了对甜瓜抗氧化酶系统的调控。相关结果与前期研究中发现的，外源 EGCG 通过诱导 H2O2信号提高番茄对非生物胁迫的广谱抗性相一致。在植物组织中，ROS 的清除能力在很大程度上归因于抗氧化酶活性的强弱。本研究表明，在正常条件下，外源 EGCG 对 CAT、APX、SOD、POD活性均有显著促进作用。在白粉病侵染后，植物的抗氧化酶活性均显著增强，表明植物通过提高自身的应激响应以清除病原菌入侵引发的 ROS积累。这表明，在遭受生物胁迫时，植物的抗氧化酶系统发挥了重要的作用。同时，研究还发现，外源 EGCG 预处理可以进一步提高患白粉病甜瓜叶片中 CAT、APX、SOD、POD 的活性。CmCAT、CmPOD、CmAPX 和 CmSOD 基因的定量表达分析表明，CmCAT 和 CmPOD 的表达模式与 CAT 和 POD 的活性相一致，都不同程度地被外源 EGCG 诱导上调。而 CmAPX 和 CmSOD仅在遭受白粉病侵染后，被外源 EGCG 诱导上调表达。本 研 究 中，CmCAT、CmPOD、CmAPX 和CmSOD 基因表达没有受到白粉病侵染的诱导，可能是由于相关基因家族在病害诱导时容易受到反馈调节22，而外源 EGCG 处理则能在白粉病341方明雅，等 外源表没食子儿茶素没食子酸酯对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响侵染时进一步诱导抗氧化酶相关基因表达。上述研究进一步证实，外源 EGCG 诱导了甜瓜叶片中抗氧化酶活性从而提高了甜瓜对白粉病的抗性，这与前人的研究结果基本一致23。然而，外源 EGCG 诱导的信号如何在转录水平上调控抗氧化酶活性还有待进一步研究。参考文献(References):1张凯歌，胡倩梅，靳志恒，等 219 份甜瓜种质资源的遗传多样性分析J 河南农业大学学报，2020，54(2):216 230ZHANG K G，HU Q M，JIN Z H，et al Genetic diversity a-nalysis of 219 melon germplasmsJ Journal of Henan Agri-cultural University，2020，54(2):216 230(in Chinesewith English abstract)2潘秀兰，梁改荣 甜瓜种质资源的研究与应用J 河南农业，2017(15):37 38PAN X L，LIANG G R Study and application of melon germ-plasm resourcesJ Henan 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