Sanger测序流程.doc

Sanger测序
一、原理
Sanger法测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
    ABI 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛，可同时分析96个样品。该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。
二、技术路线

三、操作流程
1、DNA的提取
一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的protocol）。
2、PCR扩增与电泳
① 配置PCR体系（25ul体系）
DNA浓度大于30ng/ul（DNA浓度需要测定）:
试剂名称
用量
H2O
15.2μl
10*PCR buffer
2.5μl
2.5Mm dNTPs
3μl
primer（前后引物各1ul）
2μl
LA Taq酶
0.3μl
DNA模板
2μl
注意: 对于CEBPA和NOTCH1此类GC含量高的将10*PCR buffer 2.5ul换为2*GC buffer 12.5ul, H2O 为5.2ul。
每次96孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（2000g 1min）, 防止挂壁。EP管与96孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。
② 设置PCR反应程序
一般程序：96℃预变性2min, 96℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 2min, 35cycles; 72℃延伸5min; 4℃/15℃∞。
CEBPA和NOTCH1程序：96℃预变性5min, 95℃ 40s, 64℃/66℃ 40s, 72℃ 1min, 35cycles; 72℃延伸5min; 4℃/15℃∞。
③ 琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%（60ml 0.9g, 大胶板150ml 2.25g）的琼脂糖凝胶, 再分别取2ul loading buffer与4ul DNA扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。
3、PCR产物纯化
① 配制消化液
TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾碱酶
0.5μl
TaKaRa Exonuclease I 外切酶
0.5μl
配置消化液, 分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。PCR产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到PCR反应液中。
② 纯化反应：上PCR仪进行程序反应。
程序为SAP: 37℃ 60min, 80℃ 15min, 4℃/15℃∞。
4、测序反应
① SEQ MIX配置
试剂：ABI PRISM® BigDye® Terminator v3.1 cycle Sequencing Kit
根据PCR反应的数量按照下表配制MIX：
试剂名称
用量
BigDye
0.4μl
Sequencing Buffer
0.8μl
H2O
1.8μl
Primer（3.2pmol/μl）（引物可单加）
1μl
模板（即3-②中的产物）
1ul
按照测序反应表在96孔板中加入3μl以上MIX，1μl对应引物，1μl对应PCR产物（注意封膜后要求压膜）,离心。（测序反应只有一个引物，为避免加样过程中的液体消耗，体系需要超量配置）。
② SEQ程序: 96℃预变性2min, 96℃ 10s, 55℃ 5s, 60℃ 90s, 25cycles; 4℃/15℃∞。
5、纯化
此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除, 以减少ABI 3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。
① 试剂准备：
0.125 mol/L EDTA-Na2溶液：称取2.325g EDTA-Na2·2H2O于50ml离心管中，加入40ml去离子水， 65℃水浴加热，间歇振荡几次至完全溶解，用去离子水定容至50ml ，振荡10秒混匀。
无水乙醇（优级纯）
去离子甲酰胺HIDI
② 将无水乙醇与蒸馏水混合配制成85%乙醇，70%乙醇，当天使用。
③ 测序反应板离心后，每个反应孔加入EDTA-Na2溶液2.5μl，85%乙醇40μl，充分震荡3min，离心3000g，4℃，30min（EDTA作为金属离子螯合剂, 能与测序PCR反应体系中的离子结合从而去除离子）。
④ 离心结束后将测序反应板倒置于吸水纸上，倒离心至离心力达到185g（或900rpm）时立即停止。
⑤ 每孔加入70%乙醇50μl，充分震荡1min，离心3000g，4℃，15min（DNA片段在70%的乙醇中溶解度低, 能通过离心沉淀下来）。
⑥ 重复4步骤。
⑦ 避光风干15~30min，每孔加入10μl HIDI（变性处理，生物安全柜中进行），离心后在PCR仪中96℃反应2min，降温至4℃后取出。
6、上机测序
变性结束后，上测序仪（ABI 3730）进行测序。
1.创建样品板程序
① 选择GA Instruments > ga3730 > Plate Manager；
② 点击New按钮，弹出的New Plate Dialog窗口中填写相应的内容（在ID和Name空白栏中输入样品板的名字; 在Application中选择相应的测序程序; 在Plate Type中选择96或者384孔板; 在Scheduling中定义取样顺序; 在Plate Sealing中选择Septa; 在Owner Name、Operator Name中输入操作者。
③ 点击“OK”按钮; 在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中, 填入相关的内容（在Sample Name中填入样品名, 96孔板在A01行填写“1”，384孔板依次在A01、B01、A02、B02行写1、2、3、4；在Results Group 1栏中选择数据上传路径; 在Instrument Protocol 1栏中选择测序程序; 在Analysis Protocol 1栏中选择数据分析程序）。
④ 然后全选A01行，点击Edit > Fill Down Special, 选中Fill Down Special (96 Cap), 将自动生成96行; 如果是384孔板, 依次全选A01、A02、B01、B02行，重复4次操作, 点击“OK” 。
2.载入样品板
①拉出样品栈, 打开进样栈门;
②放入样品板（顺序自下到上排列待上机）,注意缺角方向;
③关上进样栈门, 将载样栈推回原处。
3.调用上机程序
①选择 GA Instruments > GA 3730 > Instrument Name > Run Scheduler。
②点击Search按钮, 在弹出的Add Plate to In Stack窗口中输入样品板名, 点击Search按钮，选中相应的样品板名, 点击Add按钮将其调出, 点击Done按钮关闭窗口。
4.启动程序
如果机器为待机状态, 点击DC软件左上角的绿色箭头按钮, 再点击OK按钮, 机器开始启动; 如果机器一直在运行, 则不需此步骤。
7、结果分析
获得峰图后对其进行改名和分析，判断突变的有无及类别。目前使用软件Variant Report v1.1分析。