b基因工程的常规技术上.pptx

第四章 基因工程的常规技术(上）一、凝胶电泳技术一、凝胶电泳技术1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理2.琼脂糖凝胶电泳的影响因素琼脂糖凝胶电泳的影响因素二、杂交技术二、杂交技术1.1.探针与探针标记探针与探针标记2.Southern杂交杂交3.Northern杂交杂交4.Western杂交杂交5.5.菌落原位杂交菌落原位杂交三、三、PCR技术技术基因工程常规技术基因工程常规技术常规的基因工程技术的研究方法常规的基因工程技术的研究方法：凝胶电泳技术、：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细胞转化、文库构建、核酸分子杂交技术、细胞转化、文库构建、PCR技术、技术、DNA 测序技术、酵母双杂交技术等。测序技术、酵母双杂交技术等。一、凝胶电泳技术一、凝胶电泳技术琼琼脂脂糖糖是是一一种种线线性性多多糖糖，从从红红色色海海藻藻琼琼脂脂中中提提取取而而来来的的良良好好的的电电泳泳介介质质，其其密密度度是是由由琼琼脂脂糖糖的的浓浓度度决决定定的的。分分辨辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间之间。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶：过过硫硫酸酸胺胺与与TEMED(N、N、N、N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺)是是单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺的的催催化化剂剂和和诱诱变变剂剂，它它们们使使单单体体丙丙烯烯胺胺聚聚合合成成长长链链，长长链链与与长长链链间间就就交交联联成成凝凝胶胶，链链长长和和交交联联成成决决定定了了凝凝胶胶的的孔孔径径。分分辨辨DNA范范围围为为1个个碱碱基基对对到到1000个碱基对之间个碱基对之间。琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖电泳的基本原理琼脂糖电泳的基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。电泳分子的迁移速度定的速度移向适当的电极。电泳分子的迁移速度同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。成正比。1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理电泳图谱电泳图谱1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理电电泳泳分分子子的的迁迁移移速速度度又又同同分分子子的的摩摩擦擦系系数数成成反反比比。因因此此根根据据分分子子大大小小、构构型型或或形形状状所所带带的的净净电电荷荷的的不同，便可各种成分分离开来不同，便可各种成分分离开来。在在生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团，呈呈离离子子化化状状态态（负负电电荷荷）。当当核核酸酸分分子子在在电电场场中中时时，会会向向正正电电极极的的方方向向迁迁移移。在在一一定定的的电电场场强强度度下下，DNA分分子子的的电电泳泳迁迁移移率率，取取决决于于核核酸酸分分子子本本身身的的大小和构型。大小和构型。1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理溴化乙锭溴化乙锭核酸分子染色剂核酸分子染色剂在在凝凝胶胶电电泳泳中中，加加入入溴溴化化乙乙锭锭对对核核酸酸分分子子染染色色之之后后，在在紫紫外外光光下下观观察察，便便可可以以十十分分敏敏感感而而方方便便地地检检测测出出凝胶介质中凝胶介质中DNA谱带。谱带。溴溴化化乙乙锭锭是是一一种种具具扁扁平平分分子子的的核核酸酸染染料料，可可以以插插入入到到DNA或或RNA分分子子的的碱碱基基之之间间，并并在在300nm波波长长的的紫紫外外光光照照射射下下放放射射出出荧荧光光，可可用用来来显显现现凝凝胶胶中中的的核酸分子核酸分子。一一是是直直接接在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中加加入入EB，电电泳泳完完后后直直接接检测检测；也可以在电泳完后进行也可以在电泳完后进行EB染色检测染色检测。1.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理溴化乙锭扁平分子染料插入到核酸中溴化乙锭扁平分子染料插入到核酸中2.琼脂糖凝胶电泳的影响因素琼脂糖凝胶电泳的影响因素（1）凝胶的类型和浓度）凝胶的类型和浓度琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分辨辨大大小小在在0.1-60kb间间的的DNA片片段段；而而要要分分辨辨较较小小分分子子质质量量的的DNA 片片段段，要要用用聚聚丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在0.001-1kb之间之间。凝胶浓度凝胶浓度DNA片段的大小片段的大小/kb0.3%琼脂糖琼脂糖0.7%琼脂糖琼脂糖1.0%琼脂糖琼脂糖1.2%琼脂糖琼脂糖1.5%琼脂糖琼脂糖2.0%琼脂糖琼脂糖10-601-200.5-80.4-60.2-50.1-32.琼脂糖凝胶电泳的影响因素琼脂糖凝胶电泳的影响因素（2）缓冲液的）缓冲液的pH值值常常用用电电泳泳的的缓缓冲冲液液的的pH一一般般在在8.0左左右右，其其离离子子强度为强度为0.02-0.05。实实验验室室常常用用的的缓缓冲冲液液有有硼硼酸酸盐盐缓缓冲冲液液（TBE）与与醋醋酸酸缓缓冲冲液液（TAE），TBE 的的缓缓冲冲能能力力要要高高于于TAE。为为防防止止电电泳泳缓缓冲冲液液pH和和离离子子强强度度的的改改变变，可定期更换缓冲液可定期更换缓冲液。2.琼脂糖凝胶电泳的影响因素琼脂糖凝胶电泳的影响因素（3）电泳的电压和时间）电泳的电压和时间适适当当减减低低电电压压，可可使使分分子子筛筛效效应应相相对对增增强强而而提提高高分辨率分辨率。一般使用电压为。一般使用电压为100-150V。电电泳泳时时间间过过长长，DNA 条条带带易易弥弥散散；但但电电泳泳时时间间过过短，很多带又分不开。短，很多带又分不开。2.琼脂糖凝胶电泳的影响因素琼脂糖凝胶电泳的影响因素（4）琼脂糖凝胶的种类）琼脂糖凝胶的种类 低低熔熔点点（LMP）琼琼脂脂糖糖经经过过了了羟羟乙乙基基修修饰饰。LMP琼琼脂脂糖糖(熔熔点点为为6265)一一旦旦熔熔解解，在在37下下持持续续保保持持液液体体状状态态达达数数小小时时，在在25下下可可持持续续保持液体状态约保持液体状态约10分钟。分钟。LMP琼琼脂脂糖糖可可以以不不经经电电洗洗脱脱或或破破碎碎凝凝胶胶，即即可可用用来回收来回收DNA分子。分子。一一旦旦LMP琼琼脂脂糖糖已已经经熔熔化化，并并保保持持在在37下下，可可直接进行一定的酶催反应。直接进行一定的酶催反应。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶(polyacrylamide gel)是是由由单单体体(monomer)丙丙烯烯酰酰胺胺(acrylamide，简简称称Acr)和和交交联联剂剂(crosslinker)N,N-甲甲 叉叉 双双 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺(N,N-methylenebisacrylamide，简简称称Bis)在在催催化化剂剂和和加加速速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用用此此凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳称称为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(polyacrylamide gel electrophorsis，简称，简称PAGE)。3.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化（化（APTEMED）和光化学催化（核黄素）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。体系。（1）化学聚合（）化学聚合（AP-TMTED催化体系）：催化体系）：TMTED是一是一种脂肪族叔胺，它的碱基可催化溶液中的种脂肪族叔胺，它的碱基可催化溶液中的AP使其形成游使其形成游离氧自由基，激活离氧自由基，激活Acr单体形成单体长链，同时在交联单体形成单体长链，同时在交联剂剂Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶。的作用下长链彼此交联聚合成凝胶。（2）光聚合：催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产）光聚合：催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照生自由基，催化聚合反应。一般光照23小时即可完成小时即可完成聚合反应。聚合反应。3.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。和测定蛋白质分子量。n蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX 式中：式中：MW为分子量，为分子量，X为迁移率，为迁移率，k、b均为常数，若将已均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。3.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳二、杂交技术二、杂交技术1.探针与探针标记探针与探针标记杂杂交交的的目目的的是是为为了了检检测测出出同同源源DNA 序序列列，为为了了达达到这一目的，需要使用有标记的探针。到这一目的，需要使用有标记的探针。探探针针：带带有有能能检检测测的的标标记记物物的的DNA或或RNA片片段段称称为探针。为探针。探探针针标标记记：使使DNA或或RNA 带带有有可可检检测测的的标标记记物物的过程叫探针标记。的过程叫探针标记。1.探针与探针标记探针与探针标记（1）切口平移标记（）切口平移标记（nick translation）控制控制Dnase I的浓度，在双链的浓度，在双链DNA 分子一条链的有限位置打开切口，形成分子一条链的有限位置打开切口，形成3-OH和和5-P末端；末端；DNA聚合酶聚合酶I结合到切口处，它的结合到切口处，它的5 3外切酶活性将外切酶活性将DNA一条链的核苷酸一条链的核苷酸一个个切除，暴露出另外一条单链，以其为模板以一个个切除，暴露出另外一条单链，以其为模板以5 3聚合酶的活性将聚合酶的活性将标记的核苷酸加在标记的核苷酸加在3-OH末端。末端。1.探针与探针标记探针与探针标记（2）随机引物标记（）随机引物标记（Random Primer）使使用用人人工工合合成成的的能能与与任任何何DNA模模板板多多个个位位点点配配对对的的随随机机引引物物。双双链链DNA模模板板变变性性后后，随随机机引引物物与与单单链链模模 板板 DNA形形 成成 杂杂 合合 分分 子子 后后，在在 DNA聚聚 合合 酶酶 I的的Klenow片片段段的的作作用用下下，以以标标记记的的核核苷苷酸酸为为原原料料合合成成与模板互补的探针。与模板互补的探针。只需使用一种酶，更为简单，合成的探针长度均一。只需使用一种酶，更为简单，合成的探针长度均一。随随机机引引物物法法标标记记探探针针2.Southern杂交杂交 由由E.Southern于于1975年首次设计使用。年首次设计使用。为鉴别为鉴别DNA的杂交技术的杂交技术。原理原理：毛细管作用或在真空状态下使电泳凝胶中毛细管作用或在真空状态下使电泳凝胶中分离的分离的DNA片段转移到滤膜上，片段转移到滤膜上，再与同标记的单链再与同标记的单链DNA或或RNA探针杂交作探针杂交作用，检测杂交信号。用，检测杂交信号。Southern杂杂交交技技术术Southern DNA印迹杂交印迹杂交X显像图片显像图片2.Southern杂交杂交.Northern杂交杂交1979年，年，J.C.A1wine等人发展出了一种新的方法。等人发展出了一种新的方法。同同Southern的的DNA印印迹迹杂杂交交技技术术十十分分类类似似，所所以以叫叫做做Northern杂杂交交技技术术(Northern blotting)。为为鉴鉴别别RNA的杂交技术的杂交技术。Northern杂杂交交的的定定义义是是：将将RNA分分子子从从电电泳泳凝凝胶胶转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜或或其其它它化化学学修修饰饰的的活活性性滤滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。4.Western杂交杂交为为鉴别蛋白质的杂交技术鉴别蛋白质的杂交技术。蛋蛋白白质质用用SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳分分离离后后，将将蛋蛋白白质质从从凝凝胶胶转转移移到到一一固固相相支支持持物物上上（如如醋醋酸酸纤纤维维素素膜膜、PVDF膜膜），通通过过抗抗体体与与附附着着于于固固相相的的蛋蛋白白质所呈现的抗原抗体反应来对蛋白质进行检测。质所呈现的抗原抗体反应来对蛋白质进行检测。转膜转膜4.Western杂交杂交Western杂交显像图片杂交显像图片5.菌落原位杂交菌落原位杂交对菌落中对菌落中DNADNA进行原位鉴定进行原位鉴定三、三、PCR技术技术1.PCR技术的发现技术的发现聚聚合合酶酶链链式式反反应应（Polymerase Chain Reaction,PCR）方方法法始始于于20世世纪纪70年年代代早早期期，有有Khorana与与其其同同事事提提出出建建议议，作作为为一一种种降降低低化化学学合合成成基基因因工作量的策略。工作量的策略。其其想想法法被被遗遗忘忘，在在1985年年Kary Mullis及及其其Cetus公公司司的的同同事事们们，首首次次用用大大肠肠杆杆菌菌DNA 聚聚合合酶酶I的的Klenow片片段段体体外外扩扩增增出出哺哺乳乳动动物物基基因因片片段段。他他们们因此获得因此获得1993年诺贝尔生理学和医学奖。年诺贝尔生理学和医学奖。但但在在发发现现耐耐热热的的Taq酶酶之之前前，PCR还还不不是是成成熟熟的的技技术术。多多种种耐耐热热聚聚合合酶酶的的发发现现，使使PCR技技术术走走向了每一个分子生物学的实验室。向了每一个分子生物学的实验室。目前目前PCR技术可扩增长达技术可扩增长达35-50kb的的DNA片段。片段。PCR技技术术得得到到了了快快速速的的发发展展，在在分分子子生生物物学学研研究中发挥着重要的作用。究中发挥着重要的作用。1.PCR技术的发现技术的发现2.PCR技术的基本成分技术的基本成分（1）模板）模板（2）DNA聚合酶（如：聚合酶（如：Taq酶）酶）（3）引物（一般）引物（一般18-30个核苷酸）个核苷酸）（4）四种脱氧核苷酸的混合物）四种脱氧核苷酸的混合物 即：即：dATP、dTTP、dCTP、dGTP（5）反应的缓冲液）反应的缓冲液（1）模板）模板理理论论上上讲讲一一个个DNA 分分子子也也能能扩扩出出。一一般般来来说说，模板在反应体系中最低模板在反应体系中最低50pg也能扩出。也能扩出。但但是是，模模板板量量不不可可太太多多，太太多多容容易易糊糊掉掉。非非特特异扩增。异扩增。（2）DNA聚合酶聚合酶A.Taq DNA聚聚合合酶酶，从从耐耐热热的的水水生生嗜嗜热热菌菌（Thermus aquaticus）中中分分离离出出来来，故故名名。扩扩增增速速度度高高，约约1kb/min。因因无无校校对对功功能能，错错掺掺比比例为例为1/20000左右（左右（1/300）；B.Pfu聚聚合合酶酶，扩扩增增效效率率低低，约约600bp/min。因因有校对功能，包真性好；有校对功能，包真性好；C.Taq Plus，为为Taq DNA聚聚合合酶酶与与Pfu酶酶按按一一定定比例混合，保真性好、扩增效率高；比例混合，保真性好、扩增效率高；D.Adventure黄黄金金酶酶，保保真真性性好好、扩扩增增效效率率高高，但价格昂贵。但价格昂贵。（3）引物）引物A.G+C含含量量，在在40-60%之之间间，避避免免4-5个个一一样样的的碱基相连，如碱基相连，如AAAA；B.引物长度，在引物长度，在15-25个核苷酸个核苷酸,Tm值在值在55 以上；以上；C.扩扩增增长长度度，以以300-500bp合合适适，也也可可长长到到几几个个kb，其，其3碱基要求严格配对，避免为碱基要求严格配对，避免为T；D.引引物物尽尽量量避避免免自自身身配配对对，避避免免引引物物内内部部出出现现二二级结构；级结构；E.引引物物的的特特异异性性，应应与与序序列列数数据据库库中中的的其其他他序序列列具有显著差异；具有显著差异；F.引引物物上上可可加加上上酶酶切切位位点点，对对于于接接下下来来的的克克隆隆操操作有利。作有利。引物设计是关键！引物设计是关键！（4）四种脱氧核苷酸的混合物）四种脱氧核苷酸的混合物工作浓度一般为工作浓度一般为20-200mol/L。浓度太高不好。浓度太高不好。连连续续几几次次PCR 扩扩增增时时要要注注意意补补充充四四种种脱脱氧氧核核苷酸的混合物。苷酸的混合物。（5）反应的缓冲液）反应的缓冲液Mg2+的的浓浓度度可可显显著著影影响响PCR 的的产产量量、保保真真性性、酶酶活活力力等等，一一般般用用量量为为1.5-2mmol/L。明明胶胶、BSA、Tween20及及DTT对对酶酶有有一一定定的的保保护护作作用用。Tris-HCl（pH8.3）提供缓冲环境。）提供缓冲环境。以上物质均保存于以上物质均保存于-20。3.PCR技术的原理和过程技术的原理和过程1.变变性性温温度度，保保证证DNA双双链链解解开开，一一般般为为94 30s即可；即可；2.退退火火温温度度和和时时间间，PCR的的特特异异性性取取决决于于退退火火过过程程中中引引物物与与模模板板的的结结合合，一一般般在在50-60 之之间间。退退火温度越高，产物的特异性越高；火温度越高，产物的特异性越高；3.延延伸伸温温度度和和时时间间，一一般般为为72 延延伸伸，小小于于1kb的的长度长度1-2min即可；即可；4.循循环环数数，一一般般在在30-36左左右右，也也可可多多到到45个个循循环环。但循环次数太多后，会增加非特异扩增的出现。但循环次数太多后，会增加非特异扩增的出现。指指数数增增长长变性变性退火退火延伸延伸3.PCR技术的原理和过程技术的原理和过程PCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期4.荧光定量荧光定量PCR荧荧光光定定量量PCR：通通过过荧荧光光染染料料或或荧荧光光标标记记的的特特异异性性的的探探针针，对对PCR产产物物进进行行标标记记跟跟踪踪，实实时时在在线线监监控控反反应应过过程程，结结合合软软件件可可对对产产物物进进行行分分析析，计计算样品的量，也叫算样品的量，也叫实时定量实时定量PCR。EB内内插插染染料料，SYBRgreen I内内插插染染料料，Taqman探针、探针、Fret探针、探针、Molecular Beacon探针技术等。探针技术等。（1）内插染料）内插染料双双链链DNA的的内内插插染染料料是是一一种种能能插插入入到到双双链链DNA并并发发出出强强烈烈荧荧光光的的化化学学物物质质，其其荧荧光光强强度度的的增增加加与与双链双链DNA的数量呈正比。的数量呈正比。如如EB内插染料内插染料，SYBRgreen I内插染料内插染料等。等。