疏肝和胃方水提醇沉法的急性毒性试验及部分药效学研究_徐亭亭.pdf

引用:徐亭亭，朱生樑，周秉舵，王轶，王阿会，迪力库马尔马坎，李亚鼎疏肝和胃方水提醇沉法的急性毒性试验及部分药效学研究 J 湖南中医杂志，2023，39(1):168172.疏肝和胃方水提醇沉法的急性毒性试验及部分药效学研究徐亭亭，朱生樑，周秉舵，王轶，王阿会，迪力库马尔马坎，李亚鼎(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437)摘要 目的:探索疏肝和胃方水提醇沉法的安全性并验证其疗效，为疏肝和胃方新药的推广提供实验依据。方法:1)急性毒性试验。将昆明小鼠分为药物高、中高、中、低剂量组及对照组，每组各 10 只，雌雄各半。灌胃剂量根据昆明小鼠 10 倍生药量计算，并按 85%等比递减，按照 4 ml/10 g 体质量，1 d 内灌胃2 次，连续 14 d。观察 14 d 内实验小鼠的一般情况、体质量变化、内脏湿重与内脏病理改变。2)药效学研究。将 SD 大鼠分为假手术组(0.9%氯化钠注射液 1.5 ml)、模型组、中药组(中药混悬液 1.5 ml)、西药组(奥美拉唑水溶液 1.5 ml)，每组各 10 只。对除假手术组外的其余组大鼠制备酸反流模型后给药，每天 2次，连续 14 d。观察各给药组大鼠食管病理改变及食管下段组织白细胞介素1(IL1)mNA、白细胞介素6(IL6)mNA 表达情况。结果:急性毒性试验结果显示，各组小鼠精神状态良好，组间体质量差异无统计学意义(P0.05)，组间内脏湿重无明显改变、内脏无明显病理改变。药效学研究结果显示，中药组大鼠食管下段组织黏膜上皮基底层更为平坦，棘细胞减少，无黏膜糜烂与溃疡。各给药组大鼠食管 IL1mNA、IL6 mNA 表达较模型组、西药组下降，差异有统计学意义(P0.05)。结论:疏肝和胃方水提醇沉法安全性高，且可修复食管黏膜，抑制食管炎症。关键词 疏肝和胃方;提取方法;急性毒性试验;药效学实验 中图分类号 285.5 文献标识码 ADOI:1016808/jcnkiissn10037705202301040基金项目:上海市 2018 年度科技创新行动计划生物医药领域科技支持项目(18401932600);上海市科学技术委员会科技创新行动计划项目(19401971800);上海中医药大学杏林传承型人才培养计划项目(上中医人字 2019 10 号)第一作者:徐亭亭，女，主治医师，研究方向:中医内科学(脾胃病方向)通信作者:周秉舵，男，主任医师，研究方向:中医内科学(脾胃病方向)，Email:bingduozhou 163comAcute toxicity test of the waterextraction and alcoholprecipitation method forShugan Hewei prescription and a partial pharmacodynamics studyXU Tingting，ZHU Shengliang，ZHOU Bingduo，WANG Yi，WANG Ahui，DILIKUMAE Makan，LI Yading(Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China)AbstractObjective:To investigate the safety of the water extraction and alcohol precipitation method forShugan Hewei prescription and its clinical effect，and to provide an experimental basis for promoting the new drug of Shu-gan Hewei prescription.Methods:In the acute toxicity test，Kunming mice were divided into high，mediumhigh，middle，and lowdose drug groups and control group，with 10 mice(5 male mice and 5 female mice)in each group.The dosefor gavage was calculated as 10 times of crude drug in Kunming mice and was reduced proportionally at a percentage of85%，and the drug was given by gavage twice a day at a dose of 4 ml/10 g body weight for 14 consecutive days.The micewere observed in terms of general status，change in body weight，visceral wet weight，and pathological changes of viscera.Inthe pharmacodynamic study，SpragueDawley rats were divided into shamoperation group(0.9%sodium chloride injec-tion 1.5 ml)，model group，traditional Chinese medicine(TCM)group(TCM suspension 1.5 ml)，and Western medicine861第 39 卷第 1 期2023 年 1 月HUNAN JOUNAL OF TADITIONAL CHINESE MEDICINEVol.39No.1Jan.2023group(omeprazole solution 1.5 ml)，with 10 rats in each group.All rats except those in the shamoperation group wereused to establish a model of acid reflux，and then the drug was given twice a day for 14 consecutive days.The rats were ob-served in terms of the pathological changes of the esophagus and the mNA expression levels of interleukin1(IL1)and interleukin6(IL6)in the lower segment of the esophagus.esults:The acute toxicity test showed that the mice ineach group had a good general status，and there was no significant difference in body weight between groups(P0.05)，while there were no obvious changes in visceral wet weight or no pathological changes of viscera.The pharmacodynamicstudy showed that the TCM group had a smooth basal layer of the mucosal epithelium in the lower segment of the esophagusand a reduction in prickle cells，with no mucosal erosion or ulceration.The medication groups had significantly lower m-NA expression levels of IL1 and IL6 than the model group and the Western medicine group(P0.05).Conclusion:The waterextraction and alcoholprecipitation method shows high safety for Shugan Hewei prescription，and Shugan Heweiprescription can repair esophageal mucosa and inhibit esophageal inflammation.Keywords Shugan Hewei prescription;extraction method;acute toxicity test;pharmacodynamic study胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GED)是常见的上消化道系统疾病，临床症状包括烧心、反酸等食管内症状，也包括咽喉梗阻感、呛咳等食管外症状，长期反复可导致患者生活质量下降1。质子泵抑制剂(PPI)是 GED 常规治疗药物，可通过抑制胃酸分泌减少其对食管黏膜的损伤，但研究发现经标准剂量的 PPI 治疗后高达54.1%的 GED 患者仍存在着相关症状，同时 PPI毒副作用明显，长期服用会增加骨折的风险，也会改变肠道菌群增加肠道感染的几率23。朱生樑教授带领团队从事 GED 的中医研究近三十年，提出了肝失疏泄、胃失和降是其基本病机，自拟疏肝和胃方，并经大量临床试验证实，该方在缓解症状、提高患者生活质量、改善食管黏膜炎症方面优于 PPI45。本研究拟将疏肝和胃方药物及剂量固定，采用水提醇沉法制成粉剂，并进行急性毒性试验及部分药效学研究，以期为疏肝和胃方中成药的研制奠定基础。1急性毒性试验1.1实验材料1.1.1实验动物SPF 级昆明小鼠 50 只，雌雄各半，体质量(202)g，动物由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证编号:SYXK(沪)20180040，饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物中心。1.1.2药物与试剂疏肝和胃方组成:柴胡9 g，香附 12 g，枳壳 12 g，旋覆花 12 g，代赭石 15 g，黄连3 g，吴茱萸3 g，焦山栀9 g，煅瓦楞30 g，延胡索9 g，黄精15 g，生姜3 g。中药由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房提供。试剂:无水乙醇(国药集团医药股份有限公司，货号:100092683)，二甲苯(国药集团医药股份有限公司，货号:10023418)，HE染液(Servicebio，生产批号:G1003)。1.1.3仪器正置显微镜(日本尼康，型号:E100)。1.2实验方法1.2.1动物分组按照随机数字表法将小鼠分为药物高、中高、中、低剂量组及对照组，每组各10 只，雌雄各半。适应性饲养 3 d 后给药。1.2.2剂量换算根据小鼠与人的体质量换算系数为 9.01，计算小鼠的常规生药量为 1.32 g/ml，将生药量扩大 10 倍设为高剂量(13.2 g/ml)，按 85%剂量等比递减设为中高剂量(11.22 g/ml)、中剂量(9.537 g/ml)、低剂量(8.10 g/ml)6。1.2.3给药方法按照最大给药体积 0.4 ml/10 g小鼠体质量、1 d 内灌胃 2 次，持续 14 d。对照组给予相同剂量的 0.9%氯化钠注射液灌胃。1.3标本制备与指标检测1.3.1标本制备灌胃结束后禁食 24 h，分别取心脏、肝脏及肾脏放入甲醛中固定。HE 染色观察脏器损伤情况。1.3.2观察指标1)小鼠一般情况。给药 4 h 内观察小鼠的精神状态及死亡情况;连续 14 d 观察小鼠的毒性反应情况，包括小鼠的精神状态、有无异常分泌物，计算 LD50(半数致死剂量)。如有死亡对小鼠进行解剖，明确死因。2)观察 14 d 内各组小鼠体质量的变化。3)观察心、肝、肾脏脏器湿重的变化。4)HE 染色观察脏器的病理改变。2药效学实验2.1实验材料2.1.1实验动物SPF 级 SD 大鼠 40 只，雄性，体质量(25050)g，购于上海斯莱克实验动物技术有限公司，动物许可证编号:SYXK(沪)20120002，饲961第 1 期徐亭亭，朱生樑，周秉舵，等:疏肝和胃方水提醇沉法的急性毒性试验及部分药效学研究养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物中心，适应性饲养 3 d 后造模。2.1.2药物与试剂中药:疏肝和胃方水提醇沉取剂。由中国科学院上海药物研究所对方药进行水提醇沉取，具体方法为:黄连、延胡索、吴茱萸的主要有效成分为生物碱类，旋覆花、柴胡、枳壳、焦山栀、生姜和香附的主要有效成分为脂溶性成分，两者故选用水提醇沉法得到水提醇沉液并浓缩备用(浸膏含量为 10 mg/ml)。黄精以总糖为主要有效成分，故采用水提醇沉法提取得粗多糖稠膏(含量为 1.2 mg/ml 的黄精水提物)。将上述生物碱水提醇沉浓缩液，其他药材水提醇沉浓缩液，粗多糖稠膏混合，干燥得干膏粉，加入矿物药代赭石，煅瓦楞粉末，再加入辅料，干燥成粉剂。浓缩方法为70%乙醇浓度对药材进行回流提取，加入 8 倍量的提取液，提取 2 次，每次 15 h。西药:奥美拉唑肠溶胶囊(常州四药有限公司，规格:20 mg)。HE 染液(Servicebio，生 产 批 号:G1003)，TIzol(美 国QIAGEN 公司)，氯仿(上海国药有限公司)，异丙醇(上海国药有限公司)，无水乙醇(上海国药有限公司)，Master Mix(ThermoFisher scientific)，SYBGEEN(ocher 公司)。引物:白细胞介素1(IL1)(GCTTCCTTGTGCAAGTGTCT，TCTGGACAGCCCAAGTCAAG);白细胞介素6(IL6)(TCCGGAGAG-GAGACTTCACA，GCCATTGCACAACTCTTTTCT);GAPDH(ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，TTTGAGGGTGCAGCGAACTT)。IL1、IL6 引物均由上海生物工程股份有限公司提供。2.1.3仪器Light Cycler 480II(oche 公司，型号:oche Light Cycler 480)，梯度 PC 仪(Eppendorf公司)，酶标仪(Bio TeK 公司)。2.2实验方法2.2.1动物分组及造模按照随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、中药组、西药组，每组各10 只。对除假手术组外的其余组大鼠制备酸反流模型7。食管下段组织黏膜病理学改变包括乳头延长，基底层不规则改变，并存在血管湖。假手术组仅做开腹手术。术后观察大鼠出血情况及精神状态。2.2.2给药方法根据大鼠与人的体质量换算系数为 6.4 倍(1.32 g/ml)进行计算。假手术组给予0.9%氯化钠注射液 1.5 ml，每天 2 次;中药组给予中药混悬液 1.5 ml，每天2 次;西药组给予奥美拉唑水溶液 1.5 ml，每天 2 次;连续灌胃 14 d。2.3标本制备与指标检测2.3.1标本制备末次给药后禁食 24 h 取材。自胃食管结合部上缘取材 1 cm，并纵行剖开平铺于滤纸上，纵行沿中线剪开，一半放入中性甲醛中固定，HE 染色观察食管下段黏膜 病 理 改 变，一 半 放入80冰箱冻存，检测食管组织(IL1)mNA、(IL6)mNA 表达情况。2.3.2观察指标1)食管下段组织病理改变情况。2)食管下段组织 IL1 mNA，IL6 mNA 表达情况。2.4统计学方法采用 SPSS 24.0 统计软件分析，计量资料以均数标准差(xs)表示，2 组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。3实验结果3.1急性毒性实验结果3.1.1一般情况低剂量组死亡 2 只，死亡原因为灌胃引起的气管破裂。其余组小鼠无死亡。14 d内各组小鼠精神状态良好，毛发润泽，饮食饮水正常，大便正常。3.1.2体质量增长情况14 d 内各组小鼠体质量增长稳定，各组比较，差异无统计学意义(P0.05)(见图 1)。图 11各组雌性小鼠体质量变化图 12各组雄性小鼠体质量变化图 1各组小鼠 14 d 内体质量增长情况0712023 年第 39 卷第 1 期(总第 287 期)3.1.3脏器湿重比较各剂量组小鼠心、肝、肾脏湿重 与 对 照 组 小 鼠 相 比，差 异 无 统 计 学 意 义(P0.05)。(见表 1、2)表 1各组雌性小鼠心、肝、肾脏湿重比较组别动物数/只心脏肝脏肾脏对照组50.280.061.880.560.270.05低剂量组30.150.042.210.580.220.02中剂量组50.200.031.790.610.240.02中高剂量组50.180.091.640.100.240.01高剂量组50.200.161.590.110.250.03F 值2.331.141.55P 值0.100.370.23表 2各组雄性小鼠心、肝、肾脏湿重比较组别动物数/只心脏肝脏肾脏对照组50.230.032.070.390.370.00低剂量组50.240.042.260.300.370.05中剂量组50.260.032.230.340.340.02中高剂量组50.270.032.350.210.370.05高剂量组50.240.032.120.210.350.05F 值0.960.660.77P 值0.450.630.563.1.4脏器病理改变各组小鼠脏器病理染色表现如下:各组小鼠心肌细胞排列有序，心肌纤维呈现不规则圆柱状;肝脏细胞形态正常，排列紧密，肝小叶结构正常;肾脏组织结构正常，各组之间无明显差异。(见图 3)3.2药效学实验结果3.2.1食管下段组织病理改变模型组黏膜基底层弯曲，棘细胞增多，并可见乳头状突起及血管湖，提示酸反流模型造模成功。假手术组食管组织黏膜完整，基底层薄且平坦，无乳头状突起，无明显的血管湖;中药组食管组织黏膜完整，基底层弯曲程度较模型组明显减少，更为平坦，棘细胞减少，有少量血管湖;西药组基底层弯曲明显，且有乳头状突起，棘细胞数量较模型组减少。(见图 4)3.2.2各组大鼠食管下段组织炎症因子基因表达情况与假手术组相比，模型组大鼠食管下段组织中 IL1 mNA、IL6 mNA 表达升高，差异有统计学意义(P0.01)。与模型组及西药组相比，中药组大鼠食管下段组织中 IL 1 mNA、IL 6mNA 表达下降，差异均有统计学意义(P0.001或P0.05)。提示疏肝和胃方水提醇沉法在降低炎症方面优于奥美拉唑。(见表 3)图 31各组心脏病理改变图 32各组肝脏病理改变图 33各组肾脏病理改变图 3各组心、肝、肾脏病理改变(HE 染色，400)171第 1 期徐亭亭，朱生樑，周秉舵，等:疏肝和胃方水提醇沉法的急性毒性试验及部分药效学研究图 41假手术组图 42模型组图 43中药组图 44西药组图 4各组大鼠食管下段组织病理学改变(HE 染色，400)表 3各组大鼠食管下段组织炎症因子基因表达情况比较(TPC)组别动物数/只IL1 mNAIL6 mNA假手术组81.000.421.000.19模型组82.410.73a1.940.30a中药组81.070.25b1.410.15b西药组81.600.43c1.790.15cdF 值1.2628.387P 值001001注:与假手术组相比，aP 0.01;与模型组相比，bP 0.01;与模型组相比，cP0.05;与西药组相比，dP0.05。4讨论中医学根据 GED 的临床症状可将其归属于“吐酸”“食管瘅”“胃脘痛”等疾病范畴。该病虽在食管，但与肝胃密切相关。根据五行理论，肝属木主疏泄，胃土正常运行需要依赖肝脏的疏泄。若肝失疏泄，横逆犯胃，胃失和降，胃气上逆，则引起烧心、反酸等相关症状。临证备要吞酸 中提及“胃中泛酸，嘈杂有烧灼感，多因肝气犯胃”，因此肝失疏泄、胃失和降为该病的基本病因。疏肝和胃方是由柴胡疏肝散、旋覆代赭汤、左金丸等经典方剂化裁而来，具有疏肝理气、和胃降逆之效。其在提高临床有效率、改善 GED 症状方面优于 PPI45。动物实验结果显示，疏肝和胃方可调控食管下括约肌钙通道，使其恢复正常收缩功能，能够调节背根神经节中辣椒素受体(TPV1)的表达，降低高敏感等多靶点作用效应89。本研究将疏肝和胃方制成粉剂，进行急性毒性试验与药效学实验，明确本方的安全性与疗效。在急性毒性试验中昆明小鼠未出现不良反应，无法测得疏肝和胃方的半数致死量。在 2 周的急性毒性观察期内，昆明小鼠饮食饮水正常，皮肤毛发光泽，体质量上升平稳，内脏无异常形态学与病理改变，这提示疏肝和胃方水提醇沉取法安全可靠。炎症因子的改变是 GED 的重要发病机制，相关研究发现 GED 的损伤并不是胃酸直接引起的，而是由食管黏膜下层的炎症细胞浸润开始，自下而上逐渐延伸至黏膜上层，因此炎症因子的改变发生在食管下段黏膜充血、糜烂等损伤之前，是早期评判 GED 的一个非常重要的指标，其中 IL1 和IL6在食管炎症中表达更为突出1012。药效学实验实验结果显示，中药组大鼠食管下段组织黏膜上皮基底层更为平坦，乳头状突起明显减少，黏膜修复更为明显。在炎症改善方面，疏肝和胃方在降低 IL1mNA、IL6 mNA 的表达方面优于奥美拉唑组。综上，本研究结果提示，疏肝和胃方水提醇沉法安全性高，且可修复食管黏膜，抑制食管炎症。参考文献 1张秀莲，程艳梅，朱生樑.中西医改善非糜烂性胃食管反流病患者生活质量概况 J 中国中医急症，2015，24(4):657659.2DELSHAD SD，ALMAIO CV，CHEY WD，et alPrevalence of gas-troesophageal reflux disease and proton pump inhibitor efractorysymptoms science directJ Gastroenterology，2020，158(5):12501261 3MOAYYEDI P，LEONTIADIS GIThe risks of PPI therapy J Natureeviews Gastroenterology Hepatology，2012，9(3):132.4徐亭亭，朱生樑.疏肝和胃方治疗非糜烂性胃食管反流病疗效观察J 时珍国医国药，2017，28(5):11351136 5孙永顺，朱生樑，王宏伟，等.疏肝和胃方治疗难治性胃食管反流病的临床观察 J 时珍国医国药，2016，27(10):24572459.6COMBES，BAATT M，BALLS M.An overall strategy for the tes-ting of chemicals for human hazard and risk assessment under the EUEACH system J Altern Lab Anim，2006，34 1(1):1527.7TUGAY M，YILDIZ F，UTKAN T，et alEsophagitis impairs esophagealsmooth muscle 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