DNA的变性和复性.pptx

1 1DNA的变性和复性一）DNA的变性 二）DNA的复性 三）核酸分子杂交 2 2变性变性(denaturation)和复性和复性(renaturation)u 是双链核酸分子的两个重要物理特性。是双链核酸分子的两个重要物理特性。u 是核酸研究中经常引用的术语。是核酸研究中经常引用的术语。u 双链双链DNA、RNA双链区，双链区，DNA:RNA杂种双杂种双链链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子以及其它异源双链核酸分子(heteroduplex)都具有此性质。都具有此性质。3 3一一)DNA)DNA的变性的变性 指指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象无规则线性结构的现象。n本质：本质：氢键氢键和和疏水键疏水键断裂断裂n部分的或全部的部分的或全部的n可逆的或非可逆的可逆的或非可逆的n不涉及到其一级结构的改变不涉及到其一级结构的改变4 4 变性变性DNA DNA 的理化及生物学性质的理化及生物学性质溶液粘度降低溶液粘度降低溶液旋光性发生改变溶液旋光性发生改变增色效应或高色效应增色效应或高色效应DNA的增色反应 5 5 破坏双螺旋稳定性的因素破坏双螺旋稳定性的因素 加热加热 极端的极端的pHpH 甲醇甲醇 乙醇乙醇 尿素尿素 甲酰胺甲酰胺 6 6热变性使热变性使DNA分子双链解开所需温度分子双链解开所需温度(melting temperature)很狭很狭的温度范围内突发的跃变过程的温度范围内突发的跃变过程熔解温度（Tm）7 7 不同来源不同来源DNA间的间的Tm存在差别的原因存在差别的原因（A）DNA的均一性的均一性DNA分子中碱基组成的均一性分子中碱基组成的均一性 待测样品待测样品DNA的组成是否均一的组成是否均一8 8(B)DNA的的(G+C)含量含量 (G+C)含量越高，即含量越高，即G-C碱碱基对越多，基对越多，Tm值越高。值越高。Tm与与(G+C)含量含量(X)百分数百分数的关系可用以下经验公式表示的关系可用以下经验公式表示(DNA溶于溶于0.2mol/L NaCl中中)：X%(G+C)=2.44(Tm69.3)DNA的Tm值与G-C含量的关系 9 9离子强度低，离子强度低，Tm值低，融点范围宽值低，融点范围宽离子强度增高，离子强度增高，Tm值增高，融点范围变窄值增高，融点范围变窄DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在保存在1mol/NaCl溶液中较稳定。溶液中较稳定。（C）溶剂的性质）溶剂的性质1010二二)DNA的复性的复性 指变性指变性DNA 在适当条件下，两条互补链全部或在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。部分恢复到天然双螺旋结构的现象。是变性的一种是变性的一种逆转过程逆转过程 经经缓慢冷却缓慢冷却即可复性，又称为即可复性，又称为“退火退火”1111热变性过程和两种冷却过程示意图 1212影响因素a）温度和时间）温度和时间 比比TmTm低低2525左右的温度是复性的最佳条件左右的温度是复性的最佳条件 越远离此温度，复性速度就越慢越远离此温度，复性速度就越慢 复性时温度下降必须复性时温度下降必须缓慢缓慢 降温时间太短及温差大不利于复性降温时间太短及温差大不利于复性 1313b）DNA浓度浓度复性复性速度与速度与DNADNA浓度的平方成正比浓度的平方成正比1414c）DNA顺序的复杂性顺序的复杂性 顺序越简单，配对越快。顺序越简单，配对越快。DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性越慢。片段愈大，扩散速度愈低，复性越慢。盐浓度越高，复性速度越快。盐浓度越高，复性速度越快。d）DNA分子的大小分子的大小e）溶液的离子强度）溶液的离子强度1515