PCR产物的回收.pptx

实验五实验五 PCRPCR产物的回收产物的回收一、实验目的及背景l在生物技术实验中，反应获得的目的片段，酶切后所得特定的序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它分开，这就需要有一套方法将目的从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。从凝胶中分离回收的方法从凝胶中分离回收的方法现在常用的技术有：l电洗脱法l低熔点琼脂糖凝胶法l玻璃奶法快速纯化玻璃奶法快速纯化l凝胶回收试剂盒低熔点琼脂糖凝胶法低熔点琼脂糖凝胶法l65oC琼脂糖凝胶熔点l低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体电洗脱法基本原理电洗脱法基本原理l将电泳分离后含目的片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。l取出透析袋中含的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。二、实验试剂及仪器lDNA回收试剂盒l琼脂糖l电泳仪、电泳槽l紫外检测仪l手术刀 三、三、实验步骤1.切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称 重，如凝胶重为100 mg，可视为100 l（100 mg100 l），以此类推。2.加入3倍体积溶液GSB，于55水浴融胶6-10 min，间断（2-3 min）混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠（pH 5.2），调整颜色和GSB颜色相同（黄色）。（为增加DNA回收量，可加入1倍体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中，如凝胶重为100 mg，加入100 l异丙醇）。3.待融化的凝胶溶液降至室温（高温时吸附柱结合DNA能力弱），加入吸附柱中静置1分钟，10,000g离心1分钟，弃流出液。4.加入650 l溶液WB，10,000g离心1分钟，弃流出液。5.10,000g离心1-2分钟，去除残留的WB。6.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50 l EB或去离子水（pH7.0）（EB或去离子水在60-70水浴预热，使用效果更好），室温静置1分钟。7.10,000g离心1分钟，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20保存。结果与分析计算回收效率，判断纯度。记录电泳结果。