水稻OsMDH基因的克隆及其生物信息学分析_彭波.pdf

：文章编号：（）水稻 基因的克隆及其生物信息学分析彭波，孙晓宇，张庆茜，彭娟，娄安琪，孙艳芳，庞瑞华，周伟，汪全秀（信阳师范学院 生命科学学院大别山农业生物资源保护与利用研究院，河南 信阳 ；信阳市植保植检站，河南 信阳 ）摘要：水稻（）基因是控制水稻种子蛋白质含量的主效数量性状座位（，）基因，对水稻品质性状产生重要影响，而 蛋白能够与 基因发生相互作用。利用生物信息学策略对 蛋白的理化性质、蛋白结构及功能进行预测，探究 基因的生物学功能。结果表明：水稻 基因的编码区（，）区长 ，编码 个氨基酸；编码蛋白为疏水蛋白且不存在信号结构，包含两个跨膜结构。通过蛋白互作分析，发现 可能与柠檬酸合酶、延胡索酸酶等发生相互作用，参与三羧酸循环过程。关键词：水稻；基因；结构域功能；生物信息学分析中图分类号：文献标识码：开放科学（资源服务）标识码（）：o o o o o，o ，（，；，）：（）（），（），；，o ：；引言水稻（）是一种重要的粮食作物，我国有超过一半的人口以稻米为主食，并且水稻也是作物分子遗传研究的模式植物。稻米的品质性状是一个复杂的遗传性状，受多个基因共同协调控制，并且容易受到外界因素的影响（如光、温度、水分、土壤等环境因子）。影响稻米品质的因素有很多，其中水稻种子蛋白质含量是决定性因素之一，提高种子蛋白质含量，进而改善稻米品质就显得尤为重要。目前，已经定位到较多的数量性状座位（，）位点收稿日期：；修订日期：；通信联系人，：；基金项目：国家自然科学基金项目（，）；河南省科技攻关项目（，）；河南省高等学校青年骨干教师培养计划项目（）；河南省高等学校重点科研项目（，）；信阳市创新专项项目（）；信阳师范学院大学生科研基金项目（）作者简介：彭波（），男，河南信阳人，副教授，博士，主要从事水稻遗传育种研究。信阳师范学院学报（自然科学版）第 卷第期 年月 参与调控稻米淀粉、蛋白质含量。前期研究表明：是一个控制水稻种子蛋白质含量的主效 基因；通过酵母单杂交试验，发现苹果 酸 脱 氢 酶（，）是 基因的上游调控因子，但 基因在水稻体内的功能尚不清楚。苹果酸脱氢酶（）是糖代谢的关键酶，主要功能是催化苹果酸生成草酰乙酸。苹果酸脱氢酶可以分为依赖 的苹果酸脱氢酶和依赖 的苹果酸脱氢酶。在植物中，在为 代谢、平衡、气孔和叶脉运动、呼吸、脂肪酸氧化和豆类根瘤功能提供苹果酸方面有重要作用。苹果酸脱氢酶主要通过 作为辅助因子催化草酰乙酸生成苹果酸和 。苹果酸从叶绿体输出后，可以作为细胞质中 的来源，并促进线粒体 的产生，为糖代谢过程提供能量。已有研究表明，拟南芥基因组中共存在种编码的不同亚型，分别是种质体亚型、种线粒体、种过氧化物酶亚型、种胞质亚型。拟南芥中线粒体苹果酸脱氢酶基因正向调控缺铁胁迫响应，胞质苹果酸脱氢酶（）氧化影响 的动力学、二级结构和热力学稳定性。质体 依赖性苹果酸脱氢酶（）和线粒体苹果酸脱氢酶（）的突变都可以挽救 中的 积累和 表型。叶绿体 苹果酸脱氢酶，其活性的硫醇开关氧化还原调节对于维持叶绿 体 中 的 稳 态 至 关 重 要。质 体 依赖性苹果酸脱氢酶，通过与 蛋 白 酶 复 合 物 的 相 互 作 用 参 与 早 期 叶 绿 体 发育。但是，基因在水稻体内的生物学功能尚不明确。因此，本研究借助生物信息学方法对水稻 基因的结构和功能进行分析，以期为深入解析 调控水稻种子蛋白质含量的分子机制提供理论依据。材料与方法基因来源本研究组通过酵母单杂交试验筛选到一个能够与 基因相互作用的基因 。试验材料取中花 水稻幼叶组织冻存于，用于提取水稻的总 ，以及反转录试验。中花 基因的克隆采用 （）在 线 网 站，通 过 基 因 序 列 号（）查找并获得水稻 基因的序列。根据基因序列，设计特异性扩增引物（表），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以中花 水稻幼叶组织提取的 为模板，采用 酶进行目的基因的扩增，反应体系参考说明书。产物经过琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段进行胶回收，得到的产物送安徽通用生物股份有限公司进行测序。表本研究使用的引物序列 引物名称引物序列（）：注：下划线是酶切位点。水稻 基因编码蛋白质的生物信息学分析采用在线网站（，），对 蛋白质的理化性质进行分析预测；采用在线网站（：），对 蛋白质的磷酸化位点进行预测；采用在线网站（：），对 蛋白质有无信号肽进行 预测；采 用 在 线 网 站（：），对 蛋白质的亲疏水性进行预测；采用在线网站（：），对 蛋白质的跨膜区域进行预测；采用在线网站（：），对 蛋白质 的 二 级 结 构 进 行 预 测；采 用 在 线 网 站（：），对 蛋白质的高级空间结构进行分析预测；采用在线网站（：），对 蛋白质与其他蛋白质的互作关系进行分析预测；在 数据库中获得其同源氨基酸序列，借助 第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月软件进行 基因的进化树分析。结果与分析水稻 基因的克隆以水稻中花 幼叶组织提取的 为模板。利用特异性引物（表）对 基因进行扩增，经的琼脂糖凝胶电泳分离发现在 左右有条带，并进行测序。测序结果如图所示，表 明 该 基 因 的 开 放 阅 读 框（，）为 ，编码 个氨基酸。对 基因的编码区序列进行分析，结果显示：种密 码 子 的 平 均 使 用 频 率 为（）（）（）（），其 中（）的 含 量 为 ，（）的 含 量 为 ，表明水稻 蛋白质密码子中 含量与含量基本一致。该蛋白质对密码子的使用无偏爱性。注：下划线是起始密码子与终止密码子。图水稻 基因的测序结果 o 水稻 基因编码的氨基酸序列分析采用 软件对水稻 基因编码的氨基酸进行分析，共编码 个氨基酸。结果显示：在 氨基酸序列中，丙氨酸（）含量最高；其次为精氨酸（）和亮氨酸（）。各氨基酸含量预测如表。水稻 基因编码蛋白质的理化性质理化性质预测结果显示：水稻 蛋白质的分子量约为 ，为，不稳定系数为 （小于），表明水稻 蛋白质的稳定性较好。亲疏水性预测结果显示：其亲水性平均值为 ，为疏水性蛋白质（规定蛋白质亲水性平均值大于为疏水性蛋白质）。其详细理化性质预测如表。表氨基酸含量预测 o o o o 简称类别数量占比 表基本理化性质预测 o o o 性质数量备注相对分子量 理论 值 脂肪指数 蛋白质稳定亲水性 疏水蛋白质负电荷的残基数（）个正电荷的残基数（）个注：水稻 蛋白质分子式为 。水稻 磷酸化位点、亲疏水性及跨膜区预测预测磷酸化位点有 个左右，其中丝氨酸较多，苏氨酸次之、酪氨酸最少（图）。推测该蛋白质可能被这种磷酸激酶磷酸化和激活，从而发挥其相应功能。已有研究表明，苹果酸脱氢酶参与水稻种子淀粉的合成。该蛋白质属于非分泌性蛋白质，没有发现信号肽结构（图）。氨基酸中的极性基团能够与水发生较强反应，具有亲水性；非极性基团水之间的相彭波，孙晓宇，张庆茜，等 水稻 基因的克隆及其生物信息学分析互作用较弱，具有疏水性 。图亲疏水性预测结果显示：蛋白质的疏水性区域明显多于亲水区域，推测该蛋白质为疏水蛋白质（图）。跨膜区域预测结果显示：该蛋白质含有两个跨膜区域，推测在生物的生命过程中担任某些转运作用（图）。图磷酸化位点预测 o o o o o 图信号肽预测 o o 图亲疏水性预测 o o o o 图跨膜区预测 o o o 水稻 蛋白质结构预测二级 结 构 预 测 显 示：该 蛋 白 质 由螺 旋（）、转角（）、无规则卷曲（）、延伸 链（）等 种 结 构 组 成（图）。以 （）为模板构建水稻 蛋白质的三级结构。预测结果显示：二者之间的序列一致性为 ，值为 ，该蛋白质结构包含大量的螺旋与无规则卷曲（图），其中包含硫酸根离子，呈现出苹果酸脱氢酶的催化特性。图二级结构预测图 o o 图三级结构预测 o 水稻 蛋白质互作关系分析采用 在线工具分析水稻 蛋白质与其他蛋白质的互作关系，发现 蛋白质与柠檬酸合酶（，参与三羧酸循环的蛋白质）、延胡索酸酶（，参与三 羧 酸 循 环 的 蛋 白 质）的 互 作 关 系 均 高 达 ，说明 参与三羧酸循环过程。此外还与 苹 果 酸 酶（）、天 冬 氨 酸 氧 化 酶（）、柠檬酸合酶（属于柠檬酸合酶家族）、柠檬酸合酶（，属于柠檬酸合酶家族）、第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月苹果酸酶（）、天冬氨酸氨基转移酶（）、苹果酸酶（）、苹果酸酶（）等蛋白质相互作用（图）。图水稻 蛋白质互作分析 o o o 水稻 基因的聚类分析根据已有研究，在 网站上下载拟南芥（）、小麦（）、大麦（）、玉米（）、高粱（）中 的同源基因序列，运用 软件构建其聚类图（图）。由聚类图可以看出，水稻 基因与拟南芥、小麦、大麦、玉米、高粱中很多预测的基因存在较高的相似性，并且该基因与玉米、高粱的进化关系较近。注：方框水稻 基因。图水稻 基因的进化树分析 o o 结论水稻 蛋白质由 个氨基酸组成，无信号肽，属于疏水蛋白质，存在个跨膜结构域，与多种蛋白质共同参与三羧酸循环，并且 基因与其他主要粮食作物（如小麦、大麦、玉米、高粱）中很多预测的基因存在较高的相似性。这些结果为后期研究 基因的功能奠定了理论基础，并为解析 调控水稻种子蛋白质含量的分子机制提供重要信息。参考文献：杨维丰，詹鹏麟，林少俊，等水稻粒形的遗传研究进展华南农业大学学报，（）：，（）：闸雯俊，李三和，胡刚，等水稻 基因 载体的构建及遗传转化湖北农业科学，（）：，（）：，（）：彭波，赵雨贺，董超，等云南软米在豫南稻区的品质性状检测与分析信阳师范学院学报（自然科学版），（）：，（），（）：，（），（）：彭波，孙艳芳，庞瑞华，等 水稻种子蛋白质含量遗传研究进展 南方农业学报，（）：，：，（）：陆丹丹，叶苗，张祖建，等 稻米蛋白质及其组分研究概况及其对稻米品质的影响 作物杂志，（）：，（）：刘岩，傲雁，徐茂森，等稻米淀粉合成和食味品质改良研究进展江苏农业科学，（）：彭波，孙晓宇，张庆茜，等 水稻 基因的克隆及其生物信息学分析 ，（）：彭波，孙艳芳，庞瑞华，等植物氨基酸转运蛋白的研究进展热带作物学报，（）：，（）：，（）：何璐璐水稻 基因启动子功能性位点的鉴定及其调控机制研究信阳：信阳师范学院，：，（）：李鹏祥，唐桂英，徐平丽，等 花生线粒体型苹果酸脱氢酶基因 的结构与表达分析 中国油料作物学报，（）：，（）：，（）：，：，（）：朱香豫基因在调控拟南芥缺铁响应中的功能分析 合肥：合肥工业大学，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：彭波，孔冬艳，黄亚娟，等 水稻 基因结构与功能的生物信息学分析 西南农业学报，（）：，（）：巫群，李永亮，邹肖肖，等小麦 基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位与表达分析生物学杂志，（）：，（）：黄恻隐，赵永彬，陈荣辉，等白及 基因的序列分析及 多态性分析生物资源，（）：，（）：徐宗昌，孔英珍 普通烟草 基因家族成员的鉴定、亚细胞定位及表达分析 遗传，（）：，（），（）：，（）：胡贤巧，张卫星，邵雅芳，等 我国近 年稻米品质优质率状况分析 中国稻米，（）：，（）：责任编辑：任长江第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月