rnai用于基因功能的鉴定和确证.pptx

Gain of functionORF expression clonesTansfection/TransductionLoss of functionshRNA/miRNAChemical geneticsInhibitors and activators of biological processAutomated read-outmechanismTherapeutic strategycellFulenGenGene Function ScreeningMechanism of RNAi(shRNA/miRNA)Comparison of shRNA and miRNA propertiesArchitectureshorthairpinSingle-strandOriginalExogenousEndogenousNo.ofintendedtarget1ManyDegreeofgenesilenceHighLowComplementarytomRNAtargetPerfectImperfectEffectonmRNAEndonucleolyticcleavageRepressedtranslationshRNA miRNAFulenGenFulenGenu shRNA的设计与构建u shRNA的验证u miRNA的克隆与检测u miRNA靶标的确证u 基因沉默后的功能拯救FulenGenFulenGenshRNA 表达克隆的构建表达克隆的构建载体体选择筛选标记和报告基因目的细胞shRNA序列序列设计高准确性的预测方法茎和环序列有效性有效性检测 3-5个shRNA/基因目的基因是否表达克隆和克隆和测序序合成引物的长度茎环结构难以有效测序27mer shRNA Oligo Design 5 GATCGAGAGTGGAGGACGCTTTGCCTCCAAGCTCAAGAGGCTTGGAGGCAAAGCGTCCTCCACTCTTTTTTTGG 3 3 CTCTCACCTCCTGCGAAACGGAGGTTCGAGTTCTCCGAACCTCCGTTTCGCAGGAGGTGAGAAAAAAACCTTAA 5A(30)B(44)D(42)C(32)N1N27N27ASN1ASN1N27N27ASN1ASu保证高表达抑制效率和最低的脱靶效应；u慢病毒载体和以哺乳动物细胞表达载体；u序列已经过测序；u每个基因提供4个克隆，至少有1抑制水平达到70%以上u提供包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。OmicsLink shRNAOmicsLink shRNA表达克隆表达克隆FulenGen经过验证的人类激酶组经过验证的人类激酶组shRNA表达克隆表达克隆 350个人类激酶基因的确证shRNA表达克隆表达抑制效应都经过验证，达70以上低的脱靶效应。FulenGenshRNA克隆用于信号通路研究克隆用于信号通路研究qPCR Primer array 即将上市即将上市p采用先进的算法，精心设计的qPCR引物p扩展长度100250bp；pPCR扩展效率90%；p每对引物的都经过扩展曲线、溶解曲线和电泳检测，包括扩展的特异性ExonicNon-codingMicroRNAs 由由RNA Polymerase II转录转录IntronicNon-codingandcodingLee,etal.,EMBOJ.23:4051-602004/-OHmature and primary microRNA 的结构的结构Pri-miRNADroshaCleavagesiteMatureVector-Based microRNA Expression Clones Promoter5 miR flank3 miR flankPre-miR TerFulenGenIII 型启动子II 型启动子CMVeGFPPriMiRNAIRESPuromycinpolyAH1/U6eGFPPriMiRNAIRESPuromycinTTTTTTCMVVector-Based microRNA Expression Clones IIII型启动子型启动子IIIIII型启动子型启动子转录序列PriPri/Pre转录终止位置不确定确定转录产物不确定确定FulenGenOmicsLink Human Precursor miRNA Expression Clones pEZ-MR02u650种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（11.0版本）中已知的678种miRNA的95%umiRNA表达框已完全测序确证 u基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率 u提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定或瞬时表达调控 u通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率 FulenGenmicroRNA肿瘤发生miR-9神经母细胞瘤miR-10b乳腺癌miR-15、miR-15a白血病、垂体腺瘤miR-16、miR-16-1白血病、垂体腺瘤miR-17-5p、miR-17-92肺癌、淋巴瘤miR-20a肺癌、淋巴瘤miR-21乳腺癌、胆管腺癌、头颈癌、白血病、宫颈癌miR-29、miR-29b白血病，胆管腺癌miR-31结肠直肠癌miR-34a胰腺癌miR-96结肠直肠癌miR-98头颈癌miR-103胰腺癌miR-107白血病、胰腺癌miR-125a、miR-125b神经母细胞瘤、乳腺癌miR-128胶质母细胞瘤miR-133b结肠直肠癌miR-135b结肠直肠癌miR-143结肠癌、宫颈癌miR-145乳腺癌、结肠直肠癌miR-146甲状腺癌miR-155乳腺癌、白血病、胰腺癌miR-181、miR-181a、miR-181b、miR-181c肺癌、白血病、胶质母细胞瘤、甲状腺癌miR-183直肠结肠癌miR-184神经母细胞瘤miR-196a-2胰腺癌miR-221胶质母细胞瘤、甲状腺癌、胰腺癌miR-222甲状腺癌miR-223白血病miR-301胰腺癌miR-376胰腺癌let-7、let-7a、let-7a-1、hsa-let-7a-2、let-7a-3肺癌、结肠癌miRNA与肿瘤与肿瘤miRNA的检测和定量检测方法检测方法 pNothernblotpMicroarraypQuantitativeReal-timePCR检测对象检测对象pPrimary-miRNApPre-miRNApMaturemiRNAFulenGenQuantitativeReal-timePCRdetectmiRNApolyApolyA加尾法加尾法LoopLoop反转录法反转录法通用性高；适用于同一样本检测多种miRNA经济、方便特异性高；适用于多个样本中检测同一miRNA价格较高FulenGenqPCR检测miRNA的特异性qPCR检测miRNA的特异性 qPCR检测miRNA困难采用采用LNALNA探针探针miRNA Target的分析研究发现，在哺乳动物中，miRNAs的基因抑制作用是通过其5一段长为68nt的核苷酸与mRNAs3端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于 miRNA序列5的28个nt，被称为seed区。2007年，美国约翰霍普金斯大学发现miR-29b 5的6个核苷酸与该miRNA的细胞定位有关。FulenGenmiRNA 5的seed区域在miRNA家族中具有很高的保守性，对脊椎动物的miRNA target的识别具有重要的作用，尤其是第2-8个碱基。FulenGen针对针对HDAC5HDAC5的三个不同版本的算法的的三个不同版本的算法的microRNAmicroRNA的预测结果的预测结果红色表示第三和第四版重叠的microRNA，黄色表示第四和第五版重叠的microRNAmicroRNAhLucTranslationDegradeationOr Translation inhibitionLightNo LightpEZX-MT01RenillaLuciferasedataFirefly Luciferase datamiRNA的编辑及其靶标的变化seedelment：AImiR376a-5p 经过编辑后，其靶标的变化经过编辑后，其靶标的变化FulenGenOmicsLinkHumanmiRNATargetSequence(3UTR)ExpressionClonesSV40 hLuc RLuc CMV polyA polyA pUC oriKan/Neo3UTRSV40 GLuc sAP CMV polyA polyA pUC oriKan/Neo3UTRpEZX-MT01pEZX-MT02FulenGenGaussia luciferase expression in CHO cellsFulenGen构建克隆构建克隆转染细胞转染细胞分泌表达Luciferase取上清取上清加入底物加入底物读取荧光值读取荧光值FulenGenmiRNADeliverintocell,tissueoranimalRestorethesilencegenefunctionmRNAcleavageortranslationinhibitionSilencegenefunction基因沉默后的功能拯救基因沉默后的功能拯救RNAi临床药物开发临床药物开发Thank You!Phone：[phone];FAX：[phone] Email：S,S