RNA操作培训解析.pptx

从从RNARNA提取到荧光定量提取到荧光定量PCRPCR内容摘要一、荧光定量PCR的原理二、荧光定量PCR的应用三、荧光定量PCR的操作四、荧光定量PCR结果分析一、荧光定量PCR的原理 定时定量PCR技术-定义 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct或标准曲线的关系对起始模板进行定量分析 名词概念：扩增曲线 荧光阈值 Ct值扩增曲线l曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，l曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。l标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。l扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。荧光阈值一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期.Ct值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数实时定量实时定量PCR的几种方法比较的几种方法比较二、荧光定量二、荧光定量PCR的应用的应用 提取总提取总RNA DNA消化消化 RT-PCR Real Time PCR 三、荧光定量三、荧光定量PCR操作操作RNA含量含量RNA质量质量 PCR验证验证!PCR验证验证!数据处理数据处理注意事项-提取总RNA培养条件：菌种需同步活化后转接，平板培养取样研磨：使用无菌枪头刮取孢子到1.5mL无RNA EP管中,然后转移到研钵中研磨至粉末状，保存于1mL的Trizol溶液中提取过程：按照说明书规范操作注意事项-DNA消化RNA检测检测 OD280:蛋白或有机试剂；OD260:核酸；OD260/OD280=1.8-2.0时，RNA可用；当R2.2时，RNA降解成单核酸消化前消化前RNA需定量需定量 赛百盛总RNA提取试剂盒：提取量1-2ug/mL检测消化是否完全检测消化是否完全 普通PCR程序：25ul体系，模板RNA加4ul注意事项-RT-PCR反转录酶 RevertAid H Minus M-Ml V Reverse Transcriptase(200u/ul)RNA定量 若DNA消化前未定量，反转成cDNA之前这一步定量PCR验证cDNA 注意事项-上机混样模板仪器操作A226-3A226-1A226-2四、荧光定量PCR结果分析-扩增曲线扩增曲线Ct的必要条件的必要条件 两个基因（目的基因和内参基因）必须有两个基因（目的基因和内参基因）必须有相一致的相一致的扩增效率，并尽可能接近扩增效率，并尽可能接近100%！如何判断扩增效率一致如何判断扩增效率一致 同时扩增目的基因和内参基因同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似似 THANK YOU!