四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究_曹欢.pdf

第12期曹欢，黄泽昊，苏彩萍，等.四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究J.环境科学与技术，2022，45（12）：19-28.Cao Huan，Huang Zehao，SuCaiping，et al.Screening and degradation characteristics of tetracyclines degrading bacteriaJ.Environmental Science&Technology，2022，45（12）：19-28.环境科学与技术 编辑部：（网址）http:/（电话）027-87643502（电子信箱）收稿日期：2022-07-01；修回2022-09-08作者简介：曹欢（1997-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学，（电子信箱）；*通讯作者，（电子信箱）。Environmental Science&Technology第45卷 第12期2022年12月Vol.45 No.12Dec.2022四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究曹欢1，黄泽昊2，苏彩萍2，任宇红1*（1.华东理工大学生物工程学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海200237；2.上海舒圣投资管理有限公司，上海201399）摘要：利用微生物降解环境中的抗生素是一种绿色有效的方式。为了减轻环境中大量残留的四环素类抗生素（TCs）污染，文章从生物肥料样品中分离得到2株具有同时降解四环素（TC）和土霉素（OTC）能力的Lysinibacillus sp.菌株，分别命名为TO1和TO2；以及2株具有降解强力霉素（DC）能力的菌株，分别命名为D1（Providencia sp.）和D2（Proteus sp.）。在以TCs为唯一碳源的条件下，探究接种量、初始抗生素浓度、温度及pH对TCs降解率的影响，结果表明：TO1、TO2对OTC的生物降解率在第4天最高可达到30.15%和32.59%，总降解率分别为91.50%和92.94%。在第7天，TO1、TO2对TC的生物降解率最高可达到61.81%和59.20%，总降解率分别为88.66%和 91.61%；且D1、D2对DC的生物降解率最高可达到48.21%和52.73%，总降解率分别为56.15%和60.22%。选取Bacillus subtilis 和Escherichia coli作为毒性指示菌以评估TCs生物降解反应中的产物毒性，结果显示：生物降解产物的毒性显著低于水解产物，证明微生物降解抗生素对环境安全友好，具有实际应用前景。关键词：四环素；土霉素；强力霉素；生物降解；降解特性中图分类号：X172；X53文献标志码：Adoi：10.19672/ki.1003-6504.1560.22.338文章编号：1003-6504(2022)12-0019-10Screening and Degradation Characteristics of Tetracyclines Degrading BacteriaCAO Huan1，HUANG Zehao2，SU Caiping2，REN Yuhong1*（1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,School of Biological Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Shanghai Shusheng Investment Management Co.,Ltd.,Shanghai 201399,China）Abstract：Using microorganisms to degrade antibiotics in the environment is a green and effective way.In order to mitigatethe contamination of large amounts of residual tetracycline antibiotics(TCs)in the environment,two strains of Lysinibacillussp.with the ability to degrade both tetracycline(TC)and oxytetracycline(OTC),named TO1 and TO2,respectively,and twostrains with the ability to degrade doxycycline(DC),named D1(Providencia sp.)and D2(Proteus sp.),respectively,wereisolated from biofertilizer samples.The effects of inoculum,initial antibiotic concentration,temperature and pH on the degradation rate of TCs were investigated under the condition of using TCs as the only carbon source,the results were obtained:the biodegradation rates of TO1 and TO2 for OTC could reach up to 30.15%and 32.59%on the fourth day,and the total degradation rates were 91.50%and 92.94%,respectively.On the seventh day,the highest biodegradation rates of TO1 and TO2 toTC could reach 61.81%and 59.20%,and the total degradation rates were 88.66%and 91.61%,respectively;and the highest biodegradation rates of D1 and D2 to DC could reach 48.21%and 52.73%,and the total degradation rates were 56.15%and60.22%,respectively.Bacillus subtilis and Escherichia coli were selected as toxicity indicator bacteria to assess the toxicity ofproducts in the biodegradation reaction of TCs.The results showed that the toxicity of biodegradation products was significantly lower than that of hydrolysis products,which proved that microbial degradation of antibiotics is environmentally safe andfriendly,and has practical application prospects.Key words：tetracycline;oxytetracycline;doxycycline;biodegradable;degradation characteristics四环素类抗生素（tetracycline antibiotics，TCs）通过与细菌核糖体30S亚单位上的tRNA结合位点相结合，从而抑制细菌蛋白质的合成，可用于预防或治疗病原微生物引起的感染1，2。因其具有成本低、副作用小第45卷和抗菌范围广等特点，被广泛应用于人类医药行业、畜禽养殖业及农业等3，4。由于TCs的使用量过大，且通常不能被人类或动物完全吸收或代谢，因而其在各种环境基质（如水体、土壤）中残留较高5。环境中残留的TCs不仅会影响微生物群落的组成结构及功能活性，还会通过食物链的生物累积导致人体肠道微生物菌群的破坏6。因此，寻找绿色有效的方式来解决环境中TCs污染的问题具有重要意义。目前，常用的去除TCs 的物理化学方法包括水解7、吸附8、光解9、电化学10及高级氧化11等。虽然上述方法在一定程度上可以去除TCs，但其存在效率较低、工艺复杂、成本及能耗较高以及易造成二次污染等问题12，13。相较物理化学法，生物降解法具有高效、成本低廉、操作简单以及安全环保等优势，是一种极具前景的去除抗生素的方式14。研究人员已从活性污泥、废水、污染的土壤或海水中分离得到一些TCs降解菌，如克雷伯氏菌Klebsiella sp.SQY515、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia DT116及烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae OTC-1617等。值得注意的是，大部分菌株均需提供额外的营养物质才能发挥高效的降解作用。因此，仍需筛选适应性更强、效率更高的TCs降解菌。TCs中的四环素（tetracycline，TC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）及强力霉素（doxycycline，DC）等使用范围最广，因此文章选取TC、OTC及DC作为研究对象，对上海舒圣投资管理有限公司提供的生物肥料样品进行驯化分离，并在以TCs为唯一碳源的条件下筛选得到具有降解TCs能力的菌株。同时，通过探究不同条件（温度、pH、接种量及初始抗生素浓度）对TCs降解率的影响，得到TCs降解菌的最适降解条件。本研究为生物治理TCs污染提供了新的候选微生物，并为环境生物修复技术提供实验依据。1材料与方法1.1材料与试剂生物肥料样品来自上海舒圣投资管理有限公司；四环素（TC）、土霉素（OTC）及强力霉素（DC）标准品均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，均购自上海玻尔化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母粉、氯化钠及草酸为分析纯，均购自上海泰坦科技股份有限公司。1.2TCs的检测分析方法使用高效液相色谱仪（HPLC）对TCs进行定性定量检测，色谱柱：Aglient SB-aq C18（250 mm4.6 mm，5 m）；检测器：紫外检测器；流动相：0.1 mol/L草酸/甲醇/乙腈=76/16/8（用于TC/OTC检测）、0.1 mol/L草酸/甲醇/乙腈=7/2/1（用于DC检测）；流速：1 mL/min；柱温：30；波长：355 nm（用于TC/OTC检测）、350 nm（用于DC检测）；进样量：10 L。1.3菌株的富集驯化及分离称取 0.05 g 生物肥料样品分别加入含 20 mg/LTC/OTC/DC的50 mL LB液体培养基17中，在37、200 r/min的条件下培养24 h，以获得种子液。随后按1%的接种量吸取500 L种子液分别接种至含40 mg/LTC/OTC/DC的50mLLB液体培养基中，继续培养24h。重复以上操作，并通过梯度增加TC/OTC/DC的浓度（60、80、100 mg/L）对菌株进行富集驯化，以获得TCs耐药菌。接下来，对TCs耐药菌进行分离纯化。将富集驯化后的培养液用无菌水稀释106倍，吸取100 L稀释后的培养液均匀涂布于含60 mg/LTC/OTC/DC的LB固体平板上，放至 37 的恒温培养箱中培养 24 h。挑取平板上大小形态不同的单菌落分别划线至含60 mg/LTC/OTC/DC的LB固体平板上进行进一步纯化。而后，挑取纯化后的单菌落分别接种至含60 mg/LTC/OTC/DC的LB试管中，培养至对数期。将对数期菌液与50%甘油混合均匀（甘油终浓度为25%），保藏至-20 冰箱，以便后续实验使用。1.4TCs降解菌的形态特征及生理生化特征通过观察TCs降解菌在LB固体平板上的大小、颜色、形状、边缘、光滑度等特征，以及在光学显微镜下的形态，对细菌进行初步鉴定。生理生化特征16的具体实验操作如下：（1）接触酶实验。用于判断细菌是否产生过氧化氢酶。将细菌划线于LB固体平板中，在37 条件下进行培养，挑取单菌落涂抹于滴有3%H2O2溶液的载玻片上，如立即产生大量气泡说明该菌能产生过氧化氢酶，为阳性，无气泡为阴性。（2）淀粉水解实验。用于判断细菌是否产生具有水解淀粉能力的淀粉酶。将细菌划线于含0.2%可溶性淀粉的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在37 的条件下培养至菌落生长。随后，在平板上滴加碘液进行观察，如出现无变色透明圈说明该菌能产生淀粉酶，为阳性，碘液颜色无变化为阴性。（3）甲基化（MP）实验。由于各细菌糖代谢途径的不同，根据所生产的不同产物与甲基红指示剂反应形成不同的颜色对菌种进行鉴定。将菌液接种至葡萄糖蛋白胨培养中，在37 的条件下培养3 d，取1 mL培养液加入1滴甲基红指示剂进行观察，如呈红色为阳性，呈黄色为阴性。20第12期1.5TCs降解菌的分子生物学鉴定使用 Omega 细菌基因组提取试剂盒分别提取TCs降解菌的基因组DNA，然后对细菌的16S rDNA序列进行 PCR 扩增。其中，通用引物序列为:27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)。扩增体系：2FastPfu Master Mix 12.5 L，引物27F和1492R各1 L，模板DNA 3 L，ddH2O 7.5 L。将PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳验证后，送往上海擎科生物科技有限公司进行测序。得到的测序结果通过NCBI网站的BLAST检索工具中的数据库进行比对分析，并选择多组同源性较高的序列，采用Mega 7.0软件以Neighbour-Joining法构建系统发育树。1.6TCs降解菌的生长曲线将TCs降解菌分别划线纯化后，挑取单菌落分别接入含60 mg/L TC/OTC/DC的LB试管中，在37、200 r/min的恒温摇床中培养12 h，获得种子液。随后，按1%的接种量分别接入含60 mg/L TC/OTC/DC的20 mL LB摇瓶中，每隔2 h进行取样。将样品稀释到合适浓度后，经紫外分光光度计测量其OD600的吸光值，直至菌株生长到达衰亡期。根据不同时间段样品的 OD600值绘制出菌株在 LB 培养基中的生长曲线。1.7TCs降解菌的降解能力验证考虑到培养基组分对TCs降解率的影响，降解实验均在TCs的水溶液中进行，以筛选到适应性更强的TCs降解菌。将分离得到的各菌株按5%的接种量分别接种至含200 mg/L TC/OTC/DC的溶液中进行生物降解，同时设置不含菌的对照组以评估TCs自身的水解作用。实验在37、200 r/min的条件下进行，每隔24 h进行取样，样品经0.22 m滤膜处理后利用HPLC对TCs的浓度进行测定，并利用紫外分光光度计测量其OD600的吸光值。由于TCs对光敏感，整个实验操作需在避光条件下进行。在TCs降解实验过程中，TCs的总降解率与生物降解率分别通过式（1）及式（2）计算得到。总降解率（%）=（C0-Ct）/C0100%（1）生物降解率=总降解率-自身水解率（2）式（1）中，C0为初始时刻的抗生素浓度；Ct为t时刻的抗生素浓度。1.8降解特性探究1.8.1接种量对TCs降解率的影响在初始抗生素浓度为200 mg/L、pH为3.7（抗生素溶液初始pH）、温度为37 的条件下，设置4组不同接种量（1%、3%、5%、8%）的实验组以及不含菌的对照组，以研究接种量对TCs降解率的影响，每组实验设置3个平行。1.8.2初始抗生素浓度对TCs降解率的影响在接种量为5%、pH为3.7、温度为37 的条件下，设置 5 组不同初始抗生素浓度（50、100、200、300、400 mg/L）的实验组以及相应抗生素浓度的对照组（不含菌），以研究初始抗生素浓度对TCs降解率的影响，每组实验设置3个平行。1.8.3温度对TCs降解率的影响在初始抗生素浓度为200 mg/L、接种量为5%、pH为3.7的条件下，选取30、34、37及40 4个温度进行实验，以研究温度对 TCs 降解率的影响。同时，设置相应的对照组，每组实验设置3个平行。1.8.4pH对TCs降解率的影响市售的TCs为其盐酸盐产品，200mg/LTC/OTC/DC溶液的初始pH值为3.7。因此，在初始抗生素浓度为200 mg/L、接种量为5%、温度为37 的条件下，设置pH值分别为3.7、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0时的TCs降解实验以及相应的对照组，以研究pH值对TCs降解率的影响，每组实验设置3个平行。1.9降解产物的生理毒性评估因枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B.subtilis）和大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）对TCs敏感，且在自然环境中广泛存在，因此将其选为毒性指示菌，通过其在降解反应液中OD600值的变化来评估TCs降解产物的安全性。文中共评估了9组TCs降解实验中的产物毒性，见表1。表1TCs降解实验Table 1Degradation experiments of TCs实验组TCT1T2OTCO1O2DCD1D2降解实验内容TC的水解TO1对TC的降解TO2对TC的降解OTC的水解TO1对OTC的降解TO2对OTC的降解DC的水解D1对DC的降解D2对DC的降解以 B.subtilis 为例，设置了相关实验，每组实验3 个平行。实验组一：收集菌株降解抗生素后的反应液，离心去除菌体，将 B.subtilis 按 1%的接种量接入反应液上清与LB培养基1 1的混合液中，以评估生物降解产物的安全性，包括T1、T2、O1、O2、D1及D2这6组生物降解实验。实验组二：收集抗生素水解后的反应液，将B.subtilis按1%的接种量接入反应液与LB培养基1 1的混合液中，以评估水解产物的安全性，包括TC、OTC和DC这3组水解实验。同曹欢，等四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究21第45卷时设置了菌株正常生长的对照组，即将B.subtilis按1%的接种量接入 LB 培养基中，测定其生长情况。实验在 37、200 r/min 的恒温摇床中进行，12 h 后进行取样，监测其OD600值的变化。E.coli的实验步骤同上。2结果与讨论2.1菌株的富集驯化及降解能力验证经富集驯化，共分离得到 18 株 TCs 耐药菌，其16S rDNA序列比对结果如表2所示。其中，TC耐药菌11株；OTC耐药菌10株；DC耐药细菌3株。对各耐药菌进行TCs的降解能力验证，结果如图1所示。由图1(a)和图1(b)可知，得到2株能够同时降解TC和OTC的菌株Lysinibacillus sp.1与Lysinibacillus sp.2，分别将其命名为TO1、TO2；由图1(c)可知，得到 2 株具有降解 DC 能力的菌株 Providencia sp.2 与Proteus sp.1，分别将其命名为D1、D2，后续实验将对以上4株TCs降解菌进行进一步研究。表2TCs耐药菌Table 2TCs resistant strains菌株名称Lysinibacillus sp.1Providencia sp.1Providencia sp.2Staphylococcus sp.Enterobacter sp.Proteus sp.1Brevundimonas sp.Enterococcus sp.Pichia sp.Apiotrichum sp.Lysinibacillus sp.2Proteus sp.2Enterococcus sp.Ochrobactrum sp.Talaromyces sp.Wickerhamomyces sp.Candida tropicalisPediococcus pentosaceus耐药性TC/OTCTCTC/DCTC/OTCTCTC/OTC/DC/CTCTCTC/CTCTCTCTC/OTCOTCOTCOTCOTCOTCOTCDC2.2TCs降解菌的分离及形态学鉴定通过观察 TCs 降解菌在平板上培养形成的菌落形态以及在显微镜中的特征得知：TO1菌落呈圆形，乳白色，表面湿润光滑，中间隆起，边缘规则，且在显微镜中呈短小的杆状,见图2(a)；TO2菌落的特征表现为中间为白色，四周伴有一圈微透明的不规则边缘，表面干燥皱褶，且在显微镜中呈短小的杆状,见图 2(b)；D1 菌落呈圆形，乳白色，表面湿润光滑，中间隆起，边缘规则，菌落较大，且在显微镜中呈短小的杆状,见图2(c)；D2菌落的特征表现为中心为白色圆点，四周由较大的透明圈包围，边缘不规则，表面干燥，且在显微镜中呈短小的杆状,见图2(d)。TCs降解菌的部分生理生化结果见表3，在接触酶实验中，TO1、TO2的实验结果为阳性，其可能为需氧和兼性厌氧菌。在淀粉水解实验中，TO1、TO2、D1及D2被证明不可水解淀粉，结果均为阴性。在甲基红实验中，D1、D2的实验结果为阳性，与肠杆菌科中的沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属以及普罗维登斯菌属等相符。2.3TCs降解菌的分子生物学鉴定经测序比对及构建系统发育树可知，TO1 所得序列总长度为 1 449 bp，与纺缍形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis 具有高度同源性，见图 3(a)；TO2 所得序列总长度为 1 450 bp，与细长赖氨酸芽胞杆菌 Lysinibacillus macroides 具有高度同源性，见图 3(b)；D1 所得序列总长度为 1 403 bp，与居幼虫普罗威登斯菌 Providencia vermicola 具有高度同源性，见图 3(c)；D2 所得序列总长度为 1 416 bp，与奇异变形杆菌Proteus mirabilis具有高度同源性，见图3(d)。结合形态学及分子生物学鉴定，初步将 TO1、22第12期TO2 鉴定为 Lysinibacillus sp.，将其序列提交至 GenBank数据库，登录号分别为ON430651、ON430652；将D1鉴定为Providencia sp.，登录号为ON430653；将D2鉴定为Proteus sp.，登录号为ON430654。表3生理生化特征Table 3Physiological and biochemical characteristics实验接触酶实验淀粉水解实验甲基红实验TO1+-TO2+-D1+-+D2+-+注：+表示阳性；-表示阴性。2.4TCs降解菌的生长曲线由图4可知，TO1、TO2、D1及D2经过2 h左右的迟缓期后开始迅速生长，进入生长对数期。TO1、TO2在 10 h 后生长速率逐渐减缓，在 20 h 时，其生物量OD600最高可达到8.6、8.2左右，之后进入衰亡期。D1与D2的生长对数期较短，在7 h后生长速率逐渐减缓，其生物量OD600最高可达到4.8左右。D1在16 h时开始进入衰亡期，D2在12 h时进入衰亡期。根据绘制的生长曲线图，可以确保菌株在生长状态最佳的时刻进行降解实验，使其发挥最大的降解作用。为保证实验结果具有可重复性，在后续的实验中，控制TO1、TO2一级种子液的生物量OD600为7.0，D1、D2一级种子液的生物量OD600为4.0。曹欢，等四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究23第45卷2.5TCs降解菌的降解能力验证图5为TCs降解菌在降解过程中的生长曲线和生物降解率曲线，由图 5(a)可知，在 TO1、TO2 降解TC 的过程中，由于营养物质的不足，TO1、TO2 的生物量 OD600在前期表现出下降趋势，在第 4 天后无明显变化。同时，TO1与TO2在初始阶段没有表现出明显的TC降解作用，在第2天后TC降解率显著提高，并在第7天达到稳定，此时TO1、TO2对TC的生物降解率分别为 60.59%、56.98%。由图 5(b)可知，在TO1、TO2降解OTC的过程中，TO1、TO2的生物量OD600在第1天表现出下降趋势，之后无明显变化。同时，TO1、TO2对OTC的生物降解率在第4天达到最高，分别为 25.46%、27.63%。由图 5(c)可知，在 D1、D2 降解 DC 的过程中，其在以 DC 为唯一碳源的生长环境中具有更强的适应性，其生物量OD600在前 3 天无明显变化，3 天后开始逐步增加。同时，D1、D2 对 DC 的生物降解率随着时间的延长而稳步提高，在第 7 天达到最高，分别为 37.81%、40.24%。因此，在后续实验中，OTC的降解实验在反应第4天取样，TC与DC的降解实验均在反应第7天取样。由于TCs结构复杂，相较其他抗生素而言，其更难进行生物降解18。因此，目前得到的大部分TCs降解菌均需提供额外的营养物质才能发挥高效的降解作用。文中所得TCs降解菌被证明能够在以TCs为唯一碳源，且高浓度TCs的环境中具有高效降解能力。这说明其具有更强的TCs适应性，在生物治理抗生素污染中具有较大的潜力，后续可对其他类抗生素的耐受性及降解作用进行考察研究。2.6降解特性探究2.6.1接种量对TCs降解率的影响通过添加不同比例的降解菌考察了接种量对TCs降解率的影响，结果见图6。由图6(a)可知，在TO1、TO2降解TC的实验中，当接种量为5%时，生物降解率达到最高(P0.000 1)，分别为 51.95%、51.62%，总降解率达到82.20%、81.87%；由图6(b)可知，在TO1、TO2降解OTC的实验中，当接种量为3%时，生物降解率达到最高(P0.001)，分别为30.15%、30.30%，且总降解率高达91.50%、91.65%；由图6(c)可知，在D1、D2降解DC的实验中，当接种量为5%时，生物降解率达到最高(P0.000 1)，分别为37.68%、42.02%，总降解率达到49.88%、54.22%。24第12期分析可得，TCs降解菌的降解能力在初始阶段随着接种量的增加而逐步增强，当超过一定范围后，随着接种量的增加，生物降解率不再升高，并出现下降的趋势。Tan等的研究中也发现了类似现象19：在抗生素降解反应中，较高的接种量能使菌株提前生长为固定菌，即细菌细胞内将发生更多的酶促反应来促进生物降解，而过高的接种量也可能抑制细菌体内关键的酶促反应，从而抑制了生物降解过程。2.6.2初始抗生素浓度对TCs降解率的影响通过实验考察了不同初始抗生素浓度对TCs降解率的影响，结果发现TCs浓度对生物降解率的影响并不大，TCs降解菌在高浓度TCs的条件下均能发挥较高的降解作用，结果见图7。由图7(a)可知，在TO1、TO2降解TC的实验中，当初始TC浓度为200 mg/L时，生物降解率达到最高(P0.000 1)，分别为60.45%、59.20%，总降解率为92.77%、91.61%；由图7(b)可知，在TO1、TO2降解OTC的实验中，当初始OTC浓度为300 mg/L时，生物降解率达到最高(P0.001)，分别为25.13%、26.11%，总降解率为86.15%、87.13%；由图7(c)可知，在D1、D2降解DC的实验中，当初始DC浓度为200 mg/L时，生物降解率达到最高(P0.000 1)，分别为37.68%、41.52%，总降解率为49.88%、53.72%。实验结果表明，通过增加初始抗生素浓度可以提高生物降解率，但当超过一定浓度范围时，生物降解作用会受到抑制。这可能是因为当抗生素的浓度高于降解菌的耐受范围时，菌株不能及时去除抗生素对自身的毒害作用，从而抑制了微生物活性及降解能力。同时，降解产物的积累也可能抑制生物降解反应。2.6.3温度对TCs降解率的影响通过实验考察了温度对TCs降解率的影响，结果见图8。由图8(a)可知，在TO1、TO2降解TC的实验中，当温度为30 时，TCs的水解作用及生物降解作用均受到了一定程度的抑制，说明不同的温度条件会影响微生物的生长和微生物体内酶的活性及稳定性，进而影响生物降解作用。当温度为37 时，TO1与TO2的生物降解率最高(P0.000 1)，分别达到61.81%、57.98%，总降解率为88.66%、84.82%。由图8(b)可知，在TO1、TO2降解OTC的实验中，TO1在37 时的生物降解率最高(P0.001)，达到 23.48%，总降解率为86.10%；TO2在34 时的生物降解率最高(P0.001)，达到 26.22%，总降解率为 87.35%。由图 8(c)可知，在D1、D2降解DC的实验中，当温度为37 时，D1、D2的生物降解率最高(P0.000 1)，分别达到37.37%、33.91%，总降解率为49.04%、45.57%。曹欢，等四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究25第45卷2.6.4pH对TCs降解率的影响通过实验考察了不同 pH 值对 TCs 降解率的影响，结果见图9。由图9(a)可知，在TO1、TO2降解TC的实验中，当pH为3.7时，TO1、TO2的生物降解率最高(P0.000 1)，分别为48.52%、47.06%，总降解率达到75.84%、74.38%；当pH为7.0或9.0时，生物降解作用受到抑制，实验组的TC降解率低于对照组的水解速率。由图9(b)可知，在TO1、TO2降解OTC的实验中，当pH为3.7时，TO1、TO2的生物降解率最高(P0.001)，分 别 为 27.55%、32.59%，总 降 解 率 达 到 87.89%、92.94%。由图9(c)可知，在D1、D2降解DC的实验中，当pH为3.7时，D1、D2的生物降解率最高(P0.000 1)，分 别 为 48.21%、52.73%，总 降 解 率 达 到 56.15%、60.22%。实验发现，pH值的变化对TC、OTC及DC的水解和生物降解作用均产生较大的影响。在降解实验中，随着pH值的增加，TCs的水解速率增快，且生物降解作用受到抑制，该结论与Leng等的研究结论一致16。这可能是由于过高的pH值影响了微生物的生长及酶的活性，从而抑制了菌株的降解能力20。文中所得TCs 降解菌均被证实在酸性条件下的降解能力更强，与Shao等得到的TC降解菌Klebsiella sp.SQY5表现一致15，然而Stenotrophomonas maltophilia DT116、Arthrobacter nicotianae OTC-1617等被证实在碱性条件下表现出更高的生物降解能力。这说明不同的菌株具有不同的酶系统及降解途径，因此后续实验还需进一步揭示TCs生物降解的功能基因及关键途径。2.7降解产物的生理毒性评估通过观察12 h后2株毒性指示菌OD600值的变化得出：B.subtilis与E.coli在T1、T2、O1、O2、D1及D2实验组的OD600值明显高于水解组，结果见图10。这说明生物降解产物的生理毒性均较水解小，证明了TCs 降解菌在实际应用中具有较好的生物安全性。该结论与Shi等17的研究结果一致，其在Arthrobacternicotianae OTC-16对OTC的生物降解过程中发现生物降解通过减少EOTC等水解产物的积累，将OTC转化为毒性较低的代谢产物，从而有效降低了降解产物的生理毒性。3结论（1）从生物肥料样品中分离得到2株具有同时降解 TC 和 OTC 能力的菌株，分别为 Lysinibacillus sp.TO1、Lysinibacillus sp.TO2；以及2株具有降解DC能力的菌株，分别为Providencia sp.D1、Proteus sp.D2。这是首次发现上述菌属具有TCs降解能力，为生物治26第12期理抗生素污染提供了新的候选微生物。（2）通过设置不同的接种量、初始抗生素浓度、温度及pH进行实验，得到TCs降解菌的最适降解条件。结果表明，TO1和TO2对TC的最适降解条件为：接种量5%，初始TC浓度200 mg/L，温度37，pH 3.7；TO1和TO2对OTC的最适降解条件为：接种量3%，初始OTC浓度300 mg/L，温度分别为37 和34，pH 3.7；D1、D2对DC的最适降解条件为：接种量5%，初始DC浓度200 mg/L，温度37，pH 3.7。（3）TO1、TO2对OTC的生物降解率在第4天最高可达到30.15%和32.59%，总降解率分别为91.50%和92.94%；TO1、TO2对TC的生物降解率在第7天最高可达到61.81%和59.20%，总降解率分别为88.66%和91.61%；D1、D2对DC的生物降解率在第7天最高可达到48.21%和52.73%，总降解率分别为56.15%和60.22%。（4）对 TCs 降解菌的降解产物进行生理毒性评估，结果得出生物降解的产物毒性均显著低于水解产物，证明了TCs降解菌在实际应用具有较高的生物安全性。参考文献1 Delius J,Emmerich M,zyurt V,et al.Biotransformation oftetracyclines by fungi：challenges and future research perspectivesJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2022,70(5):1454-1460.2 Shao Y T,Wang Y P,Yuan Y W,et al.A systematic reviewon antibiotics misuse in livestock and aquaculture and regulation implications in ChinaJ.Science of the Total Environment,2021,798:149205.3 Liu X H,Lu S Y,Guo W,et al.Antibiotics in the aquatic environments:a review of lakes,ChinaJ.Science of the TotalEnvironment,2018,627:1195-1208.4Topal M,Arslan Topal E I.Occurrence and fate of tetracycline and degradation products in municipal biologicalwastewater treatment plant and transport of them in surfacewaterJ.Environ Monit Assess,2015,187(12):750.5 Wu X,Gu Y,Wu X,et al.Construction of a tetracycline degrading bacterial consortium and its application evaluationin laboratory-scale soil remediationJ.Microorganisms,2020,8(2):292.6 Sun X M,Leng Y F,Wan D J,et al.Transformation of tetracycline by manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporiumJ.Molecules(Basel,Switzerland),2021,26(22):6803.7Zhong S F,Yang B,Xiong Q,et al.Hydrolytic transformation mechanism of tetracycline antibiotics:reaction kinetics,products identification and determination in WWTPsJ.Ecotox