糖尿病大鼠心室电重构的特征_杨淑红.pdf

糖尿病大鼠心室电重构的特征杨淑红，杨峥李文星吴成云王雪芬 摘要目的探讨糖尿病大鼠心室电重构特征。方法将 只健康雄性 大鼠随机分为对照组和糖尿病组，每组 只，糖尿病组大鼠喂高糖高脂高热量饲料周，在第周经腹腔注射链脲佐菌素（）诱导。对照组大鼠喂以常规饲料，同期内经腹腔注射同等体积的柠檬酸缓冲液。观察组的临床体征和空腹血糖（）以及胰岛素敏感指数（）等血液生化指标改变以确定糖尿病模型制备成功，后继续按分组后的饲料喂养周进行实验。通过记录二组在体心室肌组织单相动作电位，测量动作电位静息膜电位（）、动作电位幅度（）、动作电位最大上升速率（）、动作电位平台期电位（）、动作电位复极化恢复到、时间（、）以及动作电位时程三角测量值（）的变化。利用程控刺激和 ，测量刺激周长（）为 和 时的有效不应期（和 ）及其与自律心率下 比值（和 ）改变，监测诱发室性心律失常所需的刺激周长和诱发率。酶解法分离单个心室肌细胞，全细胞膜片钳技术记录测量两组心室肌细胞型钙电流（）及其电流电压（）曲线。结果与对照组比较，糖尿病组大鼠出现明显多食、多饮、多尿和体重减轻等临床症状，血液生化指标 水平显著增加和 值明显降低（均），提示糖尿病组模型制备成功。之后，糖尿病组 和 明显降低，减慢，缩短以及 和 显著延长（均）；同时，糖尿病组的 和 显著延长，和 明显缩短（均）；糖尿病组诱发室性心律失常的周期均明显延长，诱发率显著增加（）（），均 ；在电压钳制方式下，糖尿病组 的电流密度及幅度显著减小，当钳制电压为 时，糖尿病组心室肌细胞 的电流密度由对照组心室肌细胞的（）减少为（）（）。糖尿病组 的曲线明显抬高，且整个图形向右偏移。结论糖尿病存在心室电重构，发生室性心律失常的易感性增加，其电生理基础可能是心室肌细胞 幅度减小和活动改变。关键词电生理学；糖尿病；电重构；易感性；型钙通道；室性心律失常 ：中图分类号 文献标识码文章编号 （）湖北省自然科学基金资助项目（项目编号：）；湖北省卫生计生科研基金资助项目（项目编号：）作者单位：武汉大学人民医院乳腺甲状腺外科；心血管病研究所；护理部（湖北武汉 ）作者简介：杨淑红（），女（汉族），湖北石首人，副主任护师，医学硕士，研究方向为心脏疾病的基础与临床研究。通讯作者：王雪芬，：，；，：，：（）（），（），（）（）（）（），（），（），（），中国心脏起搏与心电生理杂志 年第 卷第期 （）（），（）（）（，），（），（），（），（，），（，），（），（）（）（），（）：；糖尿病患者心电图常出现宽大异常的 波和间期延长，发生心室颤动（简称室颤）和心脏猝死的风险比无糖尿病的心血管病患者高，但潜在机制尚不清楚。动物实验发现，糖尿病的形成造成心脏发生无菌性炎症加重，诱发心脏电重构，出现 间期延长，段抬高或压低，心室肌细胞动作电位时程（）显著延长，且在咖啡因等药物作用下容易诱发室性心律失常，其可能机制是糖尿病引起心室肌细胞 电流减小。糖尿病对心室动作电位（）更多参数及其有效不应期的影响，以及其它离子通道参与其中的电生理机制还需要进一步探究。由于糖尿病引起的心室电重构的基础为离子通道重构，内向型 电流和或外向型的电流起重要作用。这种重构过程除了外向型电流参与外，可能还与组成 平台期及其复极化过程 电流改变，心室肌细胞外 通过 型钙通道（，）进入细胞内的量，及其参与组成的心室肌细胞 形态、传导时间和顺序异常密切相关。笔者通过制备糖尿病模型，运用电生理记录技术对糖尿病心室电重构特征及 变化进行了初步探讨，旨在为临床防治糖尿病室性心律失常提供实验依据。材料与方法实验动物与分组实验选取 级雄性、周龄 大鼠，购于湖北省疾控动物养殖中心，起始体重 ，共 只。动物从购回到用于实验前均寄养于江汉大学实验动物中心（级）。适应性使用啮齿动物日常食用的 灭菌饲料（总热量约为 ，北京科澳协力饲料有限公司生产）饲养一周后随机分为对照组和糖尿病组，每组 只，且糖尿病组大鼠改喂高糖高脂高热量饲料（组成：常规饲料 猪油 蔗糖 蛋白粉，总热量约为 ，购于郑州仁恒化工产品有限公司，批号：），并在第一天上午饮食完后一次性经腹腔注射链脲佐菌素（，购于 公 司，批 号：，剂 量：），现用现配并避光保存。对照组大鼠在相同鼠龄及时间段仍维持原有饲料喂养，并经腹腔注射同等体积的柠檬酸缓冲液。周后判断造模是否成功，即在鼠龄第周每天清晨还未进食前测定空腹血糖（）和胰岛素（）水平糖尿病大鼠心室电重构的特征次，次测量间隔 ，当同一天次 水平的平均值 ，视为造模成功。另通过测定 水平计算胰岛素敏感指数值 ，（）作为建模成功另一判定指标（判定成功标准为）。组按分组后的饲养饲料继续喂养周，期间所需饮用水以及环境湿度、温度和光线仍和制模期间一致，之后拖回武汉大学人民医院心血管实验室开展所有实验。心室单相动作电位（）的记录与分析动物在大鼠咽喉镜引导下气管插管，接呼吸机（，公司，德国）辅助呼吸，潮气量每 体重 ，频率 次分，呼吸比。大鼠胸部脱毛、消毒、备皮，按无菌手术操作步骤开胸，使用眼睑撑开器（公司，美国）撑开胸廓充分暴露心脏，小心剪开心包膜。用接触式双极铂金微电极（公司，美国）记录自律心率下左心室前壁靠近心尖部，记录心电信号经生物电放大器放大后由 导数模转换器（，澳大利亚）转换并由滤波器（）滤过形成动作电位数据，输入到计算机保存，后用测量和分析系统（，澳大利亚）对实验数据进行测量、分析和统计。观察 主要参数包括静息膜电位（）、动作电位幅度（）、动作电位最大上升速率（）、动作电位平台期电位（）、动作电位复极化恢复到 、时间（、）以及动作电位复极化时程三角测量值（）。心室有效不应期（）的测量在获得 主要参数后，安放铂金刺激双电极于右室心外膜，由刺激器（，美国）发放刺激对心脏进行起搏，刺激方波均为，刺激强度为倍舒张阈值，按每个基础起搏 后发出一个期前刺激 刺激，偶联间期的基础刺激周长（）分别为 和 ，程控电刺激从各自的 开始，以 步长反扫递减，直到不能诱发心室激动，此时的偶联间期定义为左室的 ，即：和 。记录心电信号经放大器放大并经滤波器（，澳 大 利 亚）过 滤（至）后存在计算机中，用自带的分析软件（，澳大利亚）进行测量和分析。为了校正 影响，本实验用 比上自律心率下获取的 （即 ）作为观察值之一。组观察指标包括 、和 。室性心律失常诱发在完成 测定后，采用 法，以刺激波宽 ，从 开始，递减，直至 。观察组大鼠诱发的室性早搏、室性心动过速或室颤，图形存于计算机。用自带的分析软件进行测量和分析各组诱发室性心律失常的 和诱发率。心室肌细胞的分离将各组完成在体实验仍然存活并恢复到清醒状态的大鼠，麻醉且腹腔注射肝素钠（）抗凝，后开胸迅速剪下心脏置于冰冻生理盐水中。洗净残血并作简单修饰，旋即插入主动脉套管，安放到 灌流装置上。用正常的台式液对心脏逆行灌流 （速度 ，温度为 并持续通 ），后用低 的台式液灌流 ，接着用含有胶原酶型（）和蛋白酶 型（）以及小牛血清白蛋白（，）（均为 公司）的无 液循环灌流心脏 后终止反应。剪取心室肌置于含 液烧杯中剪碎、震荡和过滤，得到含单个心室肌细胞的悬液。以 转分低速离心 ，弃上清液，用含 和 氨苄青霉素 液将细胞密度调整至 个，贴上标签供膜片钳实验。正常台式液组成（）：、，用 调至。无和低 台式液为正常台式液中无和仅加 。心室肌细胞 及其电流电压曲线（）记录分别 吸 几 滴分 离 的 细胞悬 液 加 至 倒 置 显 微 镜（，日本）载物台上的细胞记录槽（容积）中，等细胞静置沉底贴壁，用记录 细胞外液循环灌流 ，整个实验环境和灌流液体维持室温（）。选取耐受 特征的横纹清晰，表面没有任何颗粒的杆状细胞进行全细胞膜片钳操作。在 软件（，德国）控制下，指令程序和记录信号经放大器（，德国）转换和放大，用充灌 电极内液、电阻为的玻璃微电极与细胞封接直到电阻达 以上，补偿快电容，施加负压吸破细胞膜并作慢电容和漏电容补偿，形成膜片钳记录模式。以钳制电位，指令电位从 到，跃阶，持续时间 ，可记录到一缓慢内向电流，此电流能被钙通道阻滞剂维拉帕米（）阻断，表明此电流为。记录 的数据经 软件采集并存储于计算机，后用 分析软件（美国）对实验图形进行拟合分析处理。中国心脏起搏与心电生理杂志 年第 卷第期为消除细胞大小对统计结果造成误差，单位用电流密度（）。的 曲线绘制是以各自指令电位为横坐标，相对应的电流密度为纵坐标完成。细胞外液（）：、，用 调至；开始灌流细胞前，为消除 和 电流干扰，需要在 细胞外液中加入 （）（购置河北省水产研究所）阻断 和 （）阻断。细胞内液（）：、，用 调至，主要试剂购自 公司或国内生物公司。统计学处理计量数据符合正态分布和方差齐性以均数标准差（?）表示，两组数据比较用单因素方差分析（），采用检验；计数资料以率百分比表示，组间比较采用检验；统计分析用 （公司，美国）软件完成，以 为差异有显著性。结果糖尿病组只大鼠在喂养过程中死亡，对照组只大鼠未完成实验，剩下各组 只大鼠均完成实验。与对照组比较，糖尿病组出现明显多饮、多食、多尿、消瘦、皮毛无光泽等临床表现。水平显著增加（）（），值明显降低（）（）（均），提示糖尿病组模型制备成功。两组心室 主要参数比较与对照组比较，糖尿病组 和 降低，减慢，缩短以及 和 延长（均 或）。另外，两组 无差异（）。见表。表两组 主要参数比较组别 （）对照组 糖尿病组 注：与对照组比较，两组心室 和诱发室性心律失常的比较与对照组比较，糖尿病组 和 均显著延长（均 ）（表），而 和 均明显减小（均 ）。糖尿病组诱发室性心律失常的 明显延长，诱发率显著增加（均）（表）。从两组大鼠经 后同步记录 和心电图发现，对照组即使在很短的刺激周长下，仅极少数能诱发局部触发电活动，心电图为插入性早搏，后转为正常电活动及窦性心律；糖尿病组例却在很慢的刺激周长便能诱发连串局部电活动，心电图上为室性心动过速或室颤，持续时间不一，后转为窦性心律。其中具有代表性例在 （刺激频率约为），持续，可诱发一连串局部触发异位电活动，心电图上表现为尖端扭转型室性心动过速，持续时间为 后转为窦性心律及其形态规整的 ；而对照组有例在 （刺激频率为 ），持续，仅能诱发个触发异位电活动，心电图上为插入性室性早搏，后经过一段舒张期后很快转为正常窦性心律（）。见图。表两组 和室性心律失常诱发比较组别 诱发心律失常 诱发率对照组 （）糖尿病组 （）注：与对照组比较，两组心室肌细胞 及其曲线比较在电压钳制方式下，两组的 随钳制电压增加而增加，在指 令 电 位 为 达 到 最 大 值，随后出现反 转 并 减 小。与 对 照 组 比 较，糖 尿 病 组 的电流密度及幅度在各钳制电压下均明显减少，当钳制电压为 时，糖尿病组心室 肌细胞 的电流密度由对照组心室肌细胞的（）（）减 少 为（）（，）。拟合 曲线也能发现相同结果，糖尿病组 的 曲线明显高于对照组，整个图形向右偏移，最大峰值在 附近，而对照组在 附近，二者 的曲线的整 个 形 态 和峰 值 方 向均没有发 生 明 显变化。见图。糖尿病大鼠心室电重构的特征：对照组，：糖尿病组图两组经不同 的 后诱发室性心律失常的比较：对照组，：糖尿病组，：记录 钳制方案，：组 的曲线图两组心室肌细胞 及其曲线讨论糖尿病患者可出现不同程度电重构，包括 间期延长，段的抬高或压低，间期离散度增加等。等推测糖尿病引起这种心脏电生理特征改变可能与形成心室 的形态和复极化时程异常，以及组成 复极化的 幅度改变密切相关，以致造成心脏对室性心律失常的发生具有显著易感性。笔者的研究也证实，糖尿病大鼠心室肌组织的 和二相平台期电位均比正常大鼠严重降低，也明显减慢，二相平台期缩短，其它复极化时相显著延长，说明糖尿病心室肌的电生理特征发生了明显重构，出现 形成和下传减慢、受抑制或间断；而 和平台期电位降低也为左室舒张间期延长提供了更宽的时间窗口，使得心肌收缩的动力减弱，平台期变窄，相和相复极化时程显著延长，从而为折返性心律失常中碎波发生和逆传提供了途径，为异位搏动占主导地位增加了机会，造成糖尿病心室肌细胞对室性心律失常的诱发具有 显 著 的 易 感 性。糖 尿 病 心 室 肌 组 织 的 在不同刺激周长的额外刺激下均明显延长，与 比值减小，说明 糖尿病心室肌组织 均明显长于 ，使得糖尿病心室肌组织电活动的不稳定性和不均一性加重，易于诱发早后除极和或晚后除极从而触发性室性心律失常。本实验糖尿病心室肌组织诱发室性心律失常所需的刺激周长显著延长，诱发率明显增多，提示糖尿病心室肌不能像正常的心室肌组织耐受快速额外刺激，比正常心室肌组织诱发室性心律失常的敏感性阈值明显提高。而这种异常电生理特征可能是由于中国心脏起搏与心电生理杂志 年第 卷第期糖尿病 引 起 的 心 室 肌 细 胞 幅 度 和 特 征 的 改变。对于 诱导的糖尿病心室肌细胞的，存在没有改变的争论性实验报道，推测与糖尿病建模后持续周期较短相关，只有在 诱导的糖尿病存在周期达到周左右，心室肌细胞上的 才能受到显著影响。本实验 诱导的糖尿病经历周后，心室肌细胞 的电流密度在各钳制电压下均明显减少，曲线幅度显著上抬，活动方向向右偏移，提示糖尿病造成了心室肌细胞 幅度显著减小，通道开放动力学放缓，从失活中恢复减慢。而在糖尿病引起心室肌细胞肌浆网上钙调蛋白功能下降，肌浆网受损易渗漏 到胞浆，整个 交换异常的基础上。心室肌细胞外 通过 进入细胞内减少，触发肌浆网上储备 大量释放入胞浆，影响了心室肌细胞内 循环的动态平衡，造成钙超载，利于触发性和折返性室性心律失常发生。因此，糖尿病具有室性心律失常的易感性，其可能机制是心室肌细胞 幅度减小和动力学特征改变。参考文献 ，（）：，（）：，：，（）：汪志卓，吴志罕，周芳等型糖尿病大鼠神经重构的实验研究 武汉大学学报（医学版），（）：，：，（）：，：，（）：王腾，吴平亚，李文星，等 甲硫基三磷酸腺苷对心力衰竭兔心室电生理的影响中国心脏起搏与心电生理杂志，（）：李健，刘彤，李广平糖尿病心肌离子通道重构的研究进展中国病理生理杂志，（）：，（）：，：，（）：（收稿）（李晓清编辑）糖尿病大鼠心室电重构的特征