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进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法ELISA编制说明.doc

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资源描述
进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法ELISA编制说明 11 2020年4月19日 文档仅供参考,不当之处,请联系改正。 《进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法 ELISA法》编制说明 一、 标准制定的任务来源及意义 本标准的制定工作是由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口,由北京出入境检验检疫局研究起草,计划编号为 B184。 本标准制定了进出口动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法 ELISA法。 三聚氰胺(英文名Melamine,CAS:108-78-1,分子式C3N6H6)是一种用途广泛的有机化工原料,禁止在食品和动物食品中添加,但因其结构中含有多个氨基氮而被一些不法商贩添加到植物蛋白中以提高蛋白的含量。其危害最早源于 3月美国发生的宠物猫、狗中毒死亡事件。经美国FDA证实,猫、狗死亡是宠物食品的原料受三聚氰胺污染,并指出其中小麦蛋白原料来自中国,由此引起了国内外对三聚氰胺的高度关注。三聚氰胺一方面可能残留于食用动物组织,进而污染畜产品食品;另一方面,三聚氰胺也能够直接污染小麦、大米等谷物食品。无论何种污染途径,都可能危害人类健康、甚至造成人类中毒、死亡的危险。 9月16日,国家质检总局公布了全国婴幼儿配方奶粉22家生产企业的69批次产品检出了含量不同的三聚氰胺的检查结果,再次将三聚氰胺聚焦为食品安全检测中的重要检测对象。 三聚氰胺在食品中的限量值,当前仅针对乳和乳制品。对于婴幼儿配方奶粉限量值中国和香港地区、澳大利亚、新西兰、加拿大以及欧盟都制定在1mg/kg,美国没有对婴幼儿配方奶粉制定一个控制的限量;中国对其它乳和含乳15%的食品限量值为2.5mg/kg。三聚氰胺传统的检测方法有重量法、升华法,但方法检测限不能满足要求。近来发展起了色谱法。中国农业部发布《饲料中三聚氰胺的测定》公告,确定了饲料中三聚氰胺测定的农业行业标准NY/T1372- ,该标准采用高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱-质谱联用法(GC/MS),HPLC法最低定量限为2mg/kg,GC/MS法最低定量限为0.05mg/kg。 10月7号,国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T 22388- )国家标准,规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法,检测定量限分别为2 mg/kg 、0.05 mg/kg 和0.01 mg/kg。 10月15日,又发布了《原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法》(GB/T22400- )国家标准,该标准的定量限为0.3 mg/kg。 然而,尽管色谱法已经很多,但不能完成现场大量样本的检测,而基于抗原抗体反应的免疫检测方法是一项大样本量现场快速的、准确的、成熟的筛查检测技术。本项目是参照美国Abraxis LLC公司建立的动物源性食品中三聚氰胺快速检测方法-ELISA法,制定相应的出入境检验检疫行业标准,作为 GB/T 22388- 和GB/T22400- 方法的补充,为实验室和现场针对动物源性食品中三聚氰胺快速筛查提供检测依据,更为保障中国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。 二、 编制依据 1. 本标准是按照GB/T 1.1- 《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写的规则》、/GN/T 1.4- 《标准编写规则 第4部分:化学分析方法》及SN/T 0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》(简称《基本规定》)的要求编写的。 2. 本标准是经大量实验研究、评估和验证后制定的。 三、 方法概述 基于竞争性ELISA的原理。先用甲醇-磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液将三聚氰胺从样品中萃取出来,再将所获得的样品萃取液与三聚氰胺辣根过氧化物酶(HRP)耦合物和标准品一起加入包备有三聚氰胺抗体的多孔试剂板的微孔中发生反应,经过30分钟的培养,样品中的三聚氰胺和三聚氰胺HRP酶耦合物与三聚氰胺抗体竞争性结合。经过这30分钟的培养,任何没有结合的三聚氰胺和三聚氰胺HRP酶耦合物将被冲洗掉,显色酶底物加入微孔中,任何结合的酶耦合物都会使液体呈现蓝色。经过10-20分钟的培养,反应结束,用酶标仪读数。将未知样品的读数和标准品的读数比较就能得出样品中的三聚氰胺浓度。 四、 主要实验技术论证 酶联免疫法之因此能够方便快捷地应用在食品分析中主要是由于其不需要经过繁琐的净化步骤,从而大大缩短了时间。实验比较了超纯水、PBS、PBST等几种常见的掩蔽剂对于消除基质影响的作用情况。结果显示采用PBS作为基质掩蔽剂可较好地消除基质影响。 五、 方法的主要技术指标 1、方法检测限 研究建立的三聚氰胺直接竞争ELISA检测方法,其标准溶液的线性范围为20~500 µg/L。经加标回收试验,针对婴儿奶粉和婴儿豆奶粉的检测限≤1.0mg/kg,液态奶及含乳巧克力、乳清粉、酸奶等含乳食品样品经前处理及掩蔽剂稀释后的检测限≤2.5mg/kg,均满足当前三聚氰胺的安全限量标准(MRLs)的要求,即针对婴幼儿为1.0mg/kg和其它乳品和含乳制品为2.5mg/kg。同时本方法还使用于肉类(鸡、鱼肉)、鸡蛋和酱油。 2、方法精密度 严格按本标准所确定的操作程序,对三聚氰胺检测进行了精密度的测试,分别以板内变异和板间变异表示。取六个含不同三聚氰胺浓度的实验样品,进行ELISA分析,每个浓度实验样品作10个复孔,对测得抑制率(IC)进行分析,变异系数均<10 %。取六个不同浓度的三聚氰胺标准溶液,进行ELISA分析,每个浓度每天作两次分析,综合5天测得的抑制率(IC)吸光度值进行分析,变异系数均<10 %。 3、方法准确度 选择10种不含三聚氰胺的样品,分别添加三聚氰胺至样品中3个不同含量水平,提取后采用直接竞争ELISA方法检测,计算样品加标回收率,以加标回收率表示检测方法的准确度。结果显示,回收率均在81-128%之间(见表1)。 表1 不同样品中三聚氰胺的加标回收率(n≥6) 样品 加标水平(mg/kg) 平均回收率(%) 鸡蛋 1.8 100 5 84 10 88 冰激淋 2.4 104 5 102 10 98 巧克力 2.5 96 5 94 10 88 液态奶 0.06 117 0.25 120 0.5 102 酸奶 0.16 106 0.25 112 0.5 105 肉类(鸡肉) 1.25 81 2.5 92 5 90 乳糖 0.02 120 0.05 112 0.1 122 婴儿豆奶粉 0.8 124 2.5 125 5 128 婴儿奶粉 0.1 110 0.25 96 1 116 4、方法特异性 抗三聚氰胺抗体与三嗪类似物的交叉反应可用最低检测剂量(LLD,约为90%B/Bo)或用抑制50%的吸光值所需的剂量(50%B/Bo)表示。 表2 抗三聚氰胺抗体交叉反应 化合物 LLD(ng/mL) 50%B/Bo (ng/mL) 三聚氰胺 10 400 三聚氰酸 400 >10,000 三嗪 >10,000 >10,000 三嗪二铵 0.1 2 由表2 能够看出所制备的抗三聚氰胺抗体与三嗪二铵有交叉反应,与三聚氰酸和三嗪的交叉反应性则很低。 5、三聚氰胺检测的液相色谱-串联质谱法验证及实际应用 依据GB/T 22388- 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法中的液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)验证本研究建立的ELISA方法,结果见表3。结果表明,三聚氰胺直接竞争ELISA检测与仪器分析结果一致,但仪器方法回收率偏低。 表3 三聚氰胺直接竞争ELISA检测与仪器分析结果对照(n=3) 样品 加标水平 (mg/kg) ELISA UPLC-MS/MS 回收率(%) 回收率(%) 冰激淋 2.4 104 79.3 液态奶 0.06 117 89.4 酸奶 0.16 106 74.7 婴儿奶粉 0.1 110 79.4 应用本标准方法对约40个实际样品进行了三聚氰胺的定量分析,并随机抽取了阴性检出结果样品(n=20),再以液相色谱-串联质谱法分析,均未检出三聚氰胺残留,表明阴性检出准确率为100%,即假阴性为0%;进一步对阴性样品(n=20)进行三聚氰胺标准添加实验,添加水平为0.1 mg/kg ~ 2.4 mg/kg。以本标准所建立的ELISA方法与液相色谱-串联质谱法进行比对分析,添加样品的测定结果均为阳性,且回收率分布在70% ~ 110% 之间。 6、实验室间验证试验 分别对液态奶和鸡肉样品添加三聚氰胺,针对液态奶添加水平分别为0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0mg/kg,针对鸡肉样品添加水平分别为1.8、5.0 mg/kg、 10.0 mg/kg。上述样品经北京化工大学分析测试中心、中国疾控中心、河北局、天津局、北京生命科学研究所等五个实验室的有关技术人员运用该测定方法进行验证,检测结果如表4。 表4 验证实验结果及实验室间精密度 样品名称 液态奶 鸡肉 添加水平 mg/kg 0.5 1.0 2.0 1.8 5.0 10.0 参 加 单 位 北京化工大学分析测试中心 0.457 1.01 1.83 1.45 4.52 9.25 0.412 0.92 1.79 1.57 4.38 8.15 中国疾控中心 0.447 0.89 1.78 1.69 4.81 7.97 0.434 0.93 1.88 1.59 4.27 8.13 河北出入境检验检疫局 0.401 0.87 1.66 1.47 4.11 8.28 0.395 0.97 1.61 1.78 4.36 8.69 天津出入境检验检疫局 0.411 0.83 1.73 1.83 4.33 9.01 0.398 0.89 1.85 1.51 4.09 8.73 北京生命科学研究所 0.388 1.05 1.88 1.88 4.02 8.11 0.449 0.94 1.83 1.62 4.16 8.51 平均回收率(%) 0.42 0.93 1.78 1.64 4.31 8.48 RSD (%) 5.7 6.6 5.3 9.0 5.1 5.8 六、结论 本标准简便易行,可快速、准确地对食品及农产品中的三聚氰胺残留进行筛选检验。方法的准确度、精确度、检测限均符合残留物检测的定量要求。 参考文献 主要参考文献 1、刘梅,李金强,田德金,等。固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测食品中的三聚氰胺。化学分析计量[J], ,17(2):48-50 2、江泉观,纪云晶,常元勋。环境化学毒物防治手册[M]。北京:化学工业出版社, :727-728 3、NY/T1372- 饲料中三聚氰胺的测定 4、GB/T22400- 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 5、GB/T22400- 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法
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