丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化.docx

丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化【摘要】 目的分析丁酸钠诱导Raji细胞的基因表达变化，探讨丁酸钠诱导凋亡作用机制。方法限制性显示PCR技术(Restriction Display PCR，RDPCR)分析基因表达变化，利用互联网提供的GenBank核酸数据库分析比对获得的差异表达序列。结果获得14条差异表达序列，其中6条是对照组高表达序列，8条是实验组高表达序列。结论采用RDPCR技术可以快速简便地分析药物诱导基因表达变化。分析表达差异的序列发现，丁酸钠可诱导促进细胞凋亡的基因表达，降低肿瘤细胞高表达的基因表达。【关键词】 限制性显示PCR技术；丁酸钠；凋亡；基因表达Change of Gene Expression in Raji Cells Induced by Sodium ButyrateAbstract：Objective This study was designed to analyze the change of gene expression and investigate the mechanism of apoptosis induced by sodium butyrate. MethodsThe change of gene expression was analyzed by Restriction Display PCR .The differences expressed sequences were sequenced. Nucleic acid sequences were analyzed by using the GenBank in internet. ResultsFourteen differential expressed sequences were gained， of which 6 high expressed sequences were in control cells and 8 high expressed sequences were induced by sodium butyrate. ConclusionThe change of gene expression induced by drugs could be analyzed RDPCR methods quickly and simply. Gene expression that prompted cell apoptosis was upregulated induced by sodium butyrate while Gene expression that was high expression in tumor cells was downregulated.Key words：Restriction Display PCR； Sodium butyrate； Apoptosis； Gene expression0引言Raji细胞是悬浮状态生长的，但我们前期研究发现Raji细胞在丁酸钠的处理下可由悬浮生长状态转变为贴壁生长状态，伴随有细胞凋亡现象的发生1。我们研究小组拟通过RDPCR显示mRNA表达差异来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化，试图寻找造成细胞发生形态学变化的主要基因，探讨丁酸钠作用的可能机制。1材料和方法主要试剂丁酸钠(SB)， 溴化乙锭； DNA回收试剂盒； mRNA纯化试剂盒， 限制性内切酶Sau3AI， DNA连接试剂盒， LA Tag酶， RNasin， T4 DNA 连接酶， dNTP， PMD18T Vector， JM109细菌； 丙烯酰胺， N， N甲叉双丙烯酰胺， 琼脂粉， 琼脂糖， Tag酶， 低熔点琼脂糖； 胰蛋白胨， 酵母提取物(英国OXIOD公司)； Tris饱和酚； 逆转录酶， TRIzol试剂， DEPC； RPMI1640； 小牛血清； 100bp DNA Ladder； 氯仿， 异丙醇。细胞培养Raji细胞株(来源于中山大学肿瘤防治中心)以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于5% CO2中培养。细胞mRNA的提取将生长状况良好的Raji细胞接种在6孔培养板中，细胞浓度为106/ml，加入3mmol/L丁酸钠，37、5% CO2培养。总RNA的提取按照Invitrogen公司提供的TRIzol试剂说明书进行操作。最后加30l DEPC处理水溶解总RNA。参照mRNA纯化试剂盒说明书操作，从总RNA中纯化mRNA。从mRNA反转录成为cDNA及双链cDNA末端平滑化 逆转录按照Invitrogen公司的说明书进行逆转录，mRNA约2g，dNTP /L，Oligd T15 mol/L，65，5min，加MMLV 200U和酶反应缓冲液，37延伸时间75min。cDNA样品20l，70，10min。加入5l T4 DNA Polymerase， 5l 10T4 DNA Polymerase Buffer，5l % BSA，l /L dNTP，l灭菌水，轻柔混匀。37反应5min。加入25l EDTA(pH ) 和25l 10%的SDS，轻柔混匀，停止反应。加入100l酚/氯仿溶液，振荡，混匀。10000g离心1min，液相分离，将上层水相转移至另一微量离心管中。加入1/10体积3mol/L NaAc、倍体积预冷的无水乙醇，混匀。-20，静置30min。4离心13000g10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀12次，晾干。的酶切cDNA溶于20l水中，定量后，取大约2 g进行酶切反应。16U Sau3AI，37进行酶切反应，时间不少于2h。接头与cDNA酶切片段的连接采用PCR引物设计软件设计两条单链寡核苷酸片段来生成接头，sip：5pGATCCACACCAGCCAAACCCA3，SIR: 5GGTTTGGCTGGTGTG3。接头生成按如下进行：SIP(500g/ml in water)20l，SIR(380g/ml in water)20l。混合后，90，80，70，60，50，40，30，20，4保持。分装后，贮藏于-20备用。接头与cDNA酶切片段的连接参照TaKaRaDNA连接试剂盒说明及所提供的试剂，步骤cDNA酶切反应液5l，接头5l，SolutionII 10l，SolutionI 20l。混合均匀后，于16连接，时间不少于1h。PCR反应用引物设计软件设计与SIR/SIP接头配套的通用引物U，其序列为GGTTTGGCTGGTGTG。设计的限制性引物是在通用引物的GATC3 端分别加上一个碱基A、T、C、G，以下简称为引物A、T、C、G，引物序列如表1。表1 RDPCR的限制性引物将引物A、T、C、G两两组合，共有10组，以接头与cDNA酶切片段的连接产物为模板，进行限制性分组PCR反应，反应条件 97 2min；95 30s，65 30s，72 1min，共35个循环； 72 5min； 4保持。扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳。经EB染色后，在紫外灯下观察实验组与对照组的基因表达差异，参照DNA回收试剂盒说明书回收差异条带。纯化后PCR产物与载体连接转化测序将纯化的PCR产物与pMD18T Vector连接，操作按说明书进行：pMD18T Vector l，PCR产物l，Solution I l，16连接3h。转化JM109感受态细菌。阳性克隆的挑取、鉴定及扩大培养。目的基因片段由上海博雅公司测序。生物信息学分析差异片段测序后在因特网上登录NCBI的网址，通过Advance BLAST程序进行同源性分析。在GeneBank中搜索是否有和所发现的片段同源的基因，同源性比较见实验结果部分。2结果PCR 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图，EB染色用引物A、T、C、G两两组合，共有10种组合，分别为AA、AT、AC、AG、TT、TC、TG、CC、CG、GG10 组。对从对照组和实验组的细胞中获得的cDNA 进行限制性分组PCR，扩增产物平行地在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经EB染色后，如图1。聚丙烯酰胺凝胶电泳，偶数泳道为对照组，奇数泳道为实验组，可明显看出平行的两组基因表达方面的差异。差异片段的测序与生物信息分析结果差异片段的测序在上海博雅公司进行。测序生物信息分析结果，见表2。1：标准分子量；2：AA组；3 ：AA组；4：AT组；5：AT组；6：AC组；7：AC组；8：AG组；9：AG组；10：TT组；11：TT组；12：TC组；13：TC组；14：TG组；15：TG组；16：CC组；17：CC组；18：CG组；19：CG组；20：GG组；21：GG组图1RDPCR电泳图3讨论RDPCR技术的思路是在获得反转录的cDNA之后，进行Sau3AI酶切。Sau3AI 识别位点是四个碱基，理论上计算平均每256个碱基有一个识别位点。在酶切片段的两端加上由15bp和21bp长的两条互补寡核苷酸单链逐步退火形成的通用接头，接头的一端为4个碱基的粘性端GATC，恰好与选用的Sau3AI的酶切位点互补，另一端为2个碱基的粘性端CA，可以减少片段自身间的串联。酶切片段加上接头之后，用与接头序列配套的限制性引物进行扩增(见表1)。将各引物两两组合，共10组，以接头与cDNA酶切片段的连接物为模板，进行限制性分组PCR反应，各组产物在电泳和染色后，容易观察基因差异表达。表2差异表达序列的分析结果现已知丁酸钠可以通过抑制去乙酰化酶改变染色质的构象，导致基因转录的改变。我们研究小组利用RDPCR来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化，探讨丁酸钠作用的可能机制。现对获得的差异片断分析讨论。对照组细胞高表达的基因有6条。gi|4504150|ref|NM_| 是人granulin(GRN)片断。Progranulin和它的水解产物granulin也称畸胎瘤细胞源性生长因子(PC cellderived growth factor，PCDGF)或epithelin，可刺激细胞增殖，使细胞锚着非依赖性生长。研究表明PCDGF作为一种自分泌生长因子与多种肿瘤，例如乳腺癌、肾上腺癌、神经胶质瘤等的发生、侵袭及细胞存活密切相关3,4。gi|5817109|emb|HSM800843来源于人DKFZp566D143克隆cDNA，尚未见文献报道其功能。gi|3882182|dbj|来源于人KIAA0731蛋白编码序列。有文献报道KIAA0731 蛋白在滤泡状甲状腺瘤中表达上调。gi|33466037|gb| 来源于人线粒体基因序列。尚未见文献报道其功能。gi|188427|gb|HUMMHDRS02来源于人HLADR alphachain(chainp34)基因外显子2、3、4和5。文献报道Raji细胞表面HLADR抗原表达率为%。gi|15431298|ref|NM_| 来源于人核糖体蛋白L18(RPL18)的mRNA序列，全长648bp。有研究发现，核糖体蛋白L18的mRNA 在人类结肠癌组织的表达比普通的结肠组织高。实验组高表达的基因序列8条：gi|33466037|gb|和gi|13272612|gb|来源于人线粒体基因序列，尚未见文献报道其功能。gi|17065925|emb|HSDJ622L5与人染色体同源，未见文献报道其功能。gi|37046837|gb| 来源于人核糖体蛋白L23a的mRNA序列。全长985bp，未见文献报道其功能。 gi|34784771|gb|来源于人葡萄糖磷酸异构酶mRNA，全长3020bp，与糖代谢有关。gi|10441945|gb|AF218008来源于人克隆PP3501的mRNA，功能未明，可能与细胞凋亡有关。gi|9966820|ref|NM_|来源于人溶酶体三磷酸腺苷双磷酸酶类似蛋白1 ：14381441.2Kohroki J, Tsuchiya M, Fujita S, et al. A novel strategy for identifying differential gene expression: An improved method of differential display analysisJ. Biochemical and biophysical research communications, 1999，262(2)：365367.3Qin J， DiazCueto L， Schwarze JE，et al. Effects of progranulin on blastocyst hatching and subsequent adhesion and outgrowth in the mouseJ.Biol Reprod,2005，73(3):434442.4Wang W， Hayashi J， Serrero G. PC CellDerived Growth Factor Confers Resistance to Dexamethasone and Promotes Tumorigenesis in Human Multiple MyelomaJ.Clin Cancer Res, 2006, 12(1): 4956.5Barden CB， Shister KW， Zhu B， et al. Classification of Follicular Thyroid Tumors by Molecular Signature: Results of Gene ProfilingJ.Clin Cancer Res, 2003,9: 17921800.6郭荣，邹萍，金中奎，等.锤头状核酶抑制Raji细胞表面主要组织相容性复合物类抗原的表达J.中华器官移植杂志，2005，26：160163.7Puder M， Barnard GF， Staniunas RJ， et al. Nucleotide and deduced amino acid sequence of human ribosomal protein L18J. Biochim Biophys Acta, 1993,1216(1): 134136.8Mammalian Gene Collection Programand initial analysis of more than 15，000 fulllength human and mouse cDNA sequencesJ. PNAS, 2002, 99(26): 1689916903.9Shi JD， Kukar T， Wang CY， et al. Molecular Cloning and Characterization of a Novel Mammalian Endoapyrase(LALP1)J.J Biol Chem, 2001, 276(20): 1747417478.10Katzenellenbogen RA, Baylin SB, Herman JG. Hypermethylation of the DAPkinase CpG island is a common alteration in Bcell malignanciesJ. Blood, 1999， 93(12): 43474353.11伍俊， 梁标， 郭兰萍.DAPK对IFN抑制PGCl3细胞恶性表型的影响J.肿瘤防治研究，2006，33：9093.