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法罗培南对质粒介导β内酰胺酶的稳定性及抑酶作用研究
【摘要】 目的　研究 青霉烯类抗生素法罗培南对14种标准β内酰胺酶(TEM1、TEM2、TEM3、TEM5、SHV1、SHV2、SHV4、SHV5、PSE1、PSE2、PSE3、OXA1、OXA2和OXA3)的稳定性及抑酶作用。 方法　采用紫外分光光度法，以其它β内酰胺抗生素(亚胺培南、美罗培南、头孢噻啶、头孢西丁、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢哌酮、氨曲南、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦)为对照。结果 所有抗生素对超广谱β内酰胺酶(TEM3、TEM5、SHV2、SHV4和SHV5)的IC50低于μmol/L；但对广谱酶TEM1、TEM2和SHV1的IC50超过100μmol/L。法罗培南对OXA1、OXA2和OXA3的IC50低于μmol/L。法罗培南、亚胺培南、美罗培南和头孢西丁对14种标准β内酰胺酶均稳定。结论 法罗培南对14种β内酰胺酶的抑制作用强于亚胺培南和美罗培南。
【关键词】 法罗培南 β内酰胺酶 稳定性 抑酶作用
Study of stability and inhibitory activity of
ABSTRACT Objective To study the stability and inhibitory activity of faropenem against 14 plasmidmediated standard βlactamases (TEM1, TEM2, TEM3, TEM5, SHV1, SHV2, SHV4, SHV5, PSE1, PSE2, PSE3, OXA1, OXA2 and OXA3). Method　The　ultraviolet spectrophotometry was used with other βlactams (imipenem, meropenem, cephaloridine, cefoxitin, cefuroxime, cefotaxime, cefoperazone, aztreonam, clavulanic acid, sulbactam and tazobactam) as control. Results Faropenem, imipenem, meropenem and cefoxitin were very stable to 14 plasmidmediated βlactamases. The IC50s of all tested antibiotics against extendedspectrum βlactamases (TEM3, TEM5, SHV2, SHV4 and SHV5) were below μmol/L. The IC50s of all antibiotics against broadspectrum βlactamases (TEM1, TEM2 and SHV1) were beyond 100μmol/L. The IC50s of faropenem against OXA βlactamases (OXA1, OXA2 and OXA3) were below μmol/L. Conclusion Faropenem showed stronger inhibitory activity than imipenem and meropenem against 14 plasmidmediated βlactamases.
KEY WORDS Faropenem; βlactamases; Stability; Inhibitory activity
青霉烯类抗生素是基于青霉素与头孢菌素融合的概念，向青霉素骨架中引入双键，以增大β内酰胺反应性，提高抗菌活性的设想而设计合成的。它与现在广泛　的碳青霉烯抗生素不同之处在于五元环上由硫代替了碳。与碳青霉烯相比，青霉烯化合物也具有广泛的抗菌活性，同时对脱氢肽水解酶2I(DHP2I)较碳青霉烯稳定，但抗铜绿假单胞菌活性低于碳青霉烯。对除铜绿假单胞菌外的需氧及厌氧革兰阳性菌、革兰阴性菌均显示出广谱抗菌活性［1］。法罗培南为第一个口服的青霉烯类抗生素，由日本Suntory公司开发，于1997年在日本上市。法罗培南在青霉烯母核的2位上接有一个四氢呋喃基团，化学结构稳定。本品对青霉素结合蛋白显示出强亲和力，尤其对金葡菌、耐青霉素的肺炎链球菌、粪链球菌等革兰阳性菌与脆弱拟杆菌等厌氧菌的抗菌作用明显优于头孢替安、头孢特仑、头孢克肟与头孢克洛等现有口服头孢菌素；对葡萄球菌属、链球菌属、流感嗜血菌、淋球菌等革兰阳性及革兰阴性菌的抗菌活性与上述头孢菌素相当或略优。本品对β内酰胺酶稳定，耐药菌株少，对头孢菌素耐药的弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等亦有良好作用［2～4］。本品吸收和分布良好，广泛应用于各系统细菌感染的 治疗 ［5，6］。碳青霉烯类抗生素在抗菌的同时对β内酰胺酶有程度不等的抑制作用，特别是对质粒介导的β内酰胺酶有良好抑制作用［7，8］。为考察青霉烯类抗生素对β内酰胺酶的抑制作用，本文以头孢噻啶等抗生素为对照，测定了法罗培南及亚胺培南、美罗培南和帕尼培南等3种碳青霉烯类抗生素对14种质粒介导的标准β内酰胺酶的稳定性，并对其抑酶作用进行了研究。
1 材料和方法
　药品
法罗培南(faropenem，FRP，江苏正大天晴药业有限公司)；亚胺培南(imipenem，IMP，美国Merck Sharp & Dohme公司)；美罗培南(meropenem，MRP，英国Zeneca药厂)；头孢噻啶(cephaloridine，CER，Sigma公司)；头孢西丁(cefoxitin，CFX，美国Merck Sharp & Dohme公司)；头孢呋辛(cefuroxime，CXM，Glaxo公司)；头孢噻肟(cefotaxime，CTX，重庆制药六厂)；头孢哌酮(cefoperazone，CPZ，Pfizer公司)；氨曲南(aztreonam，AZ，Squibb公司)；克拉维酸(clavulanic acid，CA， 中国 药品生物制品检定所)；舒巴坦(sulbactam，SB，Pfizer公司)；三唑巴坦(tazobactam，TB，Lederle公司)。
　菌株
14株标准产酶菌由英国London大学赠送，分别产生质粒介导的TEM1、TEM2、TEM3、TEM5、SHV1、SHV2、SHV4、SHV5、OXA1、OXA2、OXA3、PSE1、PSE2和PSE3β内酰胺酶。除PSE2、PSE3产酶株为铜绿假单胞菌外，其余产酶株均为大肠埃希菌。
　β内酰胺酶的制备［8］
取过夜培养菌液2ml转种于200ml MH肉汤中，37℃恒温摇床(SHZ22型，江苏太仓医用仪器厂)振荡孵育24h，4℃，5000g离心(L860M超速离心机，Beckman)30min，收集菌体并用/L的PBS()洗涤菌体2次，在冰浴中超声破碎(Virsonic 300型超声细胞破碎仪，美国)菌体；在4℃，20000g离心菌液1h，上清液即为粗酶液。用β内酰胺酶特异性鉴定试剂nitrocefin(Glaxo公司赠品)鉴定产酶情况，再用等电聚焦法确证，保存于-70℃冰箱中。
　酶稳定性实验［8］
以/L的PBS()配制9种β内酰胺抗生素，在药物加粗酶液前、后分别用分光光度计(DU650，Beckman公司)作光谱扫描，选择吸收度值下降最大且稳定的波长为测定波长。底物浓度均为10-4mol/L，在3ml底物中加入20μl粗酶液，记录加酶前与加酶后15min的A值， 计算 酶对底物的水解率，并以CER的水解率为100%，分别计算其它抗生素的相对水解率。测定波长为：CER 260、CFX 262、CXM 275、CPZ 266、CTX 260、AZ 295、IMP 300、MRP 298、FRP 307nm。
　IC50的测定［8］
各取终浓度为、、、、、、、10、25、100μmol/L的CA、SB、TB、IMP、MRP和FRP与20μl粗酶液混合放置5min，然后加入CER按前述方法测定在抑制剂存在和不存在时酶对CER的水解率，以抑制剂的浓度为横坐标，抑制效率为纵坐标作，根据曲线求出抑制效率为50%时的抑制剂浓度，即为IC50。按下列公式计算抑酶率
抑酶率=1-抑制剂存在时底物水解率无抑制剂时底物水解率×100%
2 结果
　β内酰胺酶稳定性
显示，FRP对质粒介导的14种β内酰胺酶均高度稳定，相对水解率不超过6%，与IMP、MRP等碳青霉烯类抗生素相当，远优于CTX、CPZ、CXM等第二、第三代头孢菌素；AZ除对TEM5和SHV4相对水解率为13%和12%以外，对其余12种酶的相对水解率也不超过7%；CFX显示出对14种β内酰胺酶良好的稳定性，相对水解率不超过11%。
　　　抑酶作用
显示，2种碳青霉烯类抗生素IMP、MRP对TEM1、TEM2、SHV1、OXA1、OXA2和OXA3的IC50值均超过实验最大浓度100μmol/L，抑制效率差；FRP对TEM1、TEM2、SHV1的IC50值也超过实验最大浓度100μmol/L，对其余11种酶FRP显示了良好的抑酶作用，IC50值至少与SB相当。值得注意的是，2种碳青霉烯类抗生素对OXA1、OXA2和OXA3型β内酰胺酶无抑制作用，而FRP显示了良好的抑制率，与CA、SB和TB相比，IC50值高出1个数量级。
3 讨论
一直以来，β内酰胺抗生素以其安全、高效的特点在细菌感染 治疗 中发挥着举足轻重的作用。随着β内酰胺抗生素的广泛　，特别是第三代头孢菌素的大量使用，耐药菌株日益增多。细菌对β内酰胺抗生素产生耐药的机制主要有两种：PBPs改变和产β内酰胺酶，而后者造成的细菌耐药更具意义［9］。β内酰胺酶通过与β内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键使β内酰胺抗生素失活。随着近年来超广谱β内酰胺新品种的广泛应用，β内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度　， 目前 从临床分离得到的β内酰胺酶已超过340种［10］。从临床分离的耐药菌所产生的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大多数是由质粒介导的β内酰胺酶，与TEM1、TEM2和SHV1等广谱酶相比，ESBLs不仅能水解青霉素和头孢菌素，还可水解第三代头孢菌素与单环类抗生素［11］，但对头霉素类与碳青霉烯类无 影响 ［12］。解决以上细菌耐药性的途径除了开发新的耐酶抗生素外，β内酰胺酶抑制剂的使用也是一个有效的手段，如临床广泛使用的舒巴坦、三唑巴坦和克拉维酸。这些物质本身并无抗菌活性，但它们通过抑制β内酰胺酶活性而达到保护β内酰胺抗生素的目的。近年来随着临床上耐β内酰胺酶抑制剂的细菌被陆续报道，对耐药菌治疗提出了更严峻的挑战。在此背景下，开发具有良好酶稳定性甚至直接具有抑酶作用的新型抗生素成为新的发展方向。
本实验结果表明，FRP对包括超广谱β内酰胺酶(TEM3、TEM5、SHV2、SHV4和SHV5)在内的14种酶高度稳定，与目前在临床上广泛使用的碳青霉烯类抗生素IMP、MRP相当，显着优于第二、第三代头孢菌素的代表品种CTX、CPZ和CXM等。从抑酶作用的结果来看，FRP对除TEM1、TEM2、SHV1型β内酰胺酶外的酶均具有良好的抑酶活性，抑酶作用至少与SB相当，对包括TEM1在内的3种广谱β内酰胺酶，FRP与2种碳青霉烯类抗生素在本实验浓度范围均未显示抑酶作用；FRP对OXA1、OXA2、OXA3型β内酰胺酶显示了优异的抑酶作用，说明FRP与Class D型β内酰胺酶具有良好的底物亲和力，表明在对β内酰胺酶的抑制作用方面，FRP优于碳青霉烯类抗生素。IC50为抑制50%的酶活性所需的抑制剂浓度，是一个评价抑酶作用非常有效的参数。尽管IC50要受酶浓度、底物浓度、酶活性指标和测定 方法 的影响，测定值在不同酶和不同实验之间不具可比性，但在同一实验条件下对同一个酶还是可以通过不同抑制剂的IC50来反映抑酶作用的强弱［13］。本实验结果表明，FRP不论在对β内酰胺酶的稳定性还是抑酶作用上均优于目前临床所使用的多数β内酰胺类抗生素。FRP对本试验未涉及到的其他类β内酰胺酶(Class C、Class B型)的稳定性和抑酶作用还有待进一步 研究 ［14，15］。
本实验首次对青霉烯类抗生素FRP的酶稳定性和抑酶作用进行了系统研究，结果可为临床合理使用该类抗生素和开发新抗生素提供 理论 依据。
作为第一个口服青霉烯类抗生素的代表品种，FRP不仅显示了良好的酶稳定性，且具有优异的抑酶作用，在治疗由产酶菌引起的细菌感染上，FRP无疑提供了一个新选择。
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