GC-MS及GC测定茶叶中主要游离氨基酸的方法研究.pdf

茶 叶 科 学 2010，30（6）：445452 Journal of Tea Science 收稿日期：2010-02-22 修订日期：2010-07-29 基金课题：国家自然科学基金（30771251）、国家现代茶叶产业技术体系资助项目 作者简介：张佳（1985），女，山西曲沃人，硕士研究生，主要研究方向为茶树营养生理。*通讯作者： GC-MS 及 GC 测定茶叶中主要游离氨基酸的方法研究 张佳1,2，王川丕2，阮建云2*（1.中国农业科学院研究生院，北京 100089；2.中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008）摘要：研究了 N-（特丁基二甲基硅烷）-N-甲基三氟乙酰胺（95%；MTBSTFA）含叔丁基二甲基氯硅烷（1%；TBDMSCl）衍生、气相色谱（GC）和气相质谱联用仪（GC-MS）测定茶叶中游离氨基酸的方法，比较了衍生温度、时间、酸度及辅助试剂等对衍生效率的影响。以正缬氨酸为内标，乙腈为辅助衍生试剂，衍生温度 110，衍生时间 30 min，可以定量检测茶叶中主要的游离氨基酸。茶氨酸产生 3 个衍生峰，经质谱鉴定第 1 个峰（按出峰时间）为环状衍生峰，第 2 个峰为一个 N 端没有衍生，第 3 个峰为完全衍生峰。各氨基酸在 101 000 nmol范围内线性良好（相关系数均大于 0.99），对茶叶样品测定结果与氨基酸自动分析仪基本一致，添加回收试验表明，茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸等的回收率为 85%108%。结果表明，试验建立的 GC-MS及 GC-FID 方法操作简便、准确，重现性好，适用于茶叶中主要游离氨基酸的分离检测，同时 GC-MS 方法还可用于15N 标记的氨基酸的检测，为吸收代谢实验提供研究基础。关键词：GC-MS；GC-FID；MTBSTFA；茶氨酸；游离氨基酸；茶叶 中图分类号：TS272；O656.3 文献标识码：A 文章编号：1000-369X（2010）06-445-08 Determination of Main Free Amino Acids in Tea by Gas Chromatography-Mass Spectrometry(GC-MS)and Gas Chromatography-Flame Ionization Detector(GC-FID)ZHANG Jia1,2,WANG Chuan-pi2,RUAN Jian-yun2*(1.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100089,China;2.Tea Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310008,China)Abstract:Free amino acids are important metabolites and contributors in green tea quality.Methods were developed to quantitatively analyze free amino acids in particular theanine in tea by Gas Chromatography/Mass Spectrometry(GC-MS)and Gas Chromatography/Flame Ionization Detector(GC-FID).The derivative reagent used in this study was N-tertbutyldimethylsily-N-methytrifluroacetamide(MTBSTFA,95%)with tert-butyldimethylsilyl chloride(TBDMSCl,1%).Conditions for derivatization(reagent,temperature,time,and acidity)were optimized to give high efficiency.The optimized procedure was as follows:dried amino acids standards or tea extract(water)under N2 gas were re-dissolved in acetonitrile(ACN)and derivatized with MTBSTFA(1:1 to ACN)at 110 for 30 min.Analysis of pure amino acid standards showed good linearity(R20.99)within the ranges of 10 to 1 000 nmol.Three peaks were detected for theanine.The MS data indicated that only the third peak(according to peak times)was the completely derivatized product while the first was cyclic and the second was a product of one N-end non-derivatization.Free amino acids in tea sample were quantified by the developed methods and the results were comparable to those analyzed by Amino Acids Autoanalyzer.Recoveries of theanine,alanine,serine,aspartate,glutamate,and glutamine were 85%108%ranges for spiked tea extract.The developed GC-MS method provided a potential methodology to 446 茶 叶 科 学 30 卷 investigate nitrogen and theanine metabolism in tea plants by quantifying the abundance of 15N labeled amino acids.Keywords:GC-MS,GC-FID,MTBSTFA,theanine,free amino acid,tea 茶叶中含有丰富的氨基酸，它们是构成茶叶滋味的重要成分，直接影响茶叶的品质。氨基酸的测定方法不断改进1，由早期的纸色谱2、薄层色谱法3进行分离后与水合茚三酮进行显色反应，发展到仪器分析为主，如氨基酸自动分析仪法4、高效液相色谱法5和毛细管电泳法6-7。分析氨基酸的气相色谱仪进行已有许多研究，形成了多种衍生方法8，主要有硅烷化、酯化和酰化等，其中硅烷化反应具有一步加热反应完成，反应条件相对温和、快速，操作简便易行，衍生样品可直接进行上机分析等优点，同时反应的碱性环境可使谷氨酸和谷氨酰胺，天冬氨酸和天冬酰胺得到有效分离9-10。目前用于甲基硅烷化反应的衍生试剂主要有N,O-双三甲硅基乙酰胺（BSA）、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）、N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）及N-（特丁基二甲基硅烷基）-N-甲基三氯乙酰胺（MTBSTFA）反应形成叔丁基二甲基氯硅烷（TBS）衍生物11。而 MTBSTFA 在分析化合物特征离子及稳定性方面更优于 BSTFA12。利用气相色谱-质谱（GC-MS）除了可测定氨基酸浓度外13-15，还可以提供丰富的同位素信息，因此被广泛地用于氨基酸代谢方面的研究。Godber 等人16利用 GC-MS 方法对植物木质部转运氨基酸进行了研究；Persson 等人17建立了 GC-MS 方法，研究植物对13C 和15N双 标 记 氨 基 酸 的 吸 收；金 海 如 等18利 用GC-MS 分析方法研究了精氨酸在 AM 真菌菌丝中的双向运输。红波等人19建立了测定土壤氨基糖和氨基酸手性异构体氮富集比值的方法，从而可有效区分土壤中原有的和利用外源氮素新合成的氨基化合物。茶氨酸（Theanine）是茶树特有的氨基酸，占茶叶游离氨基酸总量的 30%70%，既是茶叶重要的品质成分，又在茶树氮素营养中占有重要地位，对其代谢过程及影响因子的研究是近年来茶树营养的热点20-23。GC-MS 方法提供了丰富的同位素信息，为氮素代谢的研究提供了基础。有关该法研究茶叶中游离氨基酸未见报道，对茶氨酸的衍生特性还不清楚。本文研究了 MTBSTFA 作为衍生试剂对茶叶中主要游离氨基酸的检测方法。1 材料和方法 1.1 仪器 气-质联用仪（Trace 2000 DSQ，Thermo Finnigan 公司），配备气谱（Trace 2000），质谱（Trace DSQ），气相色谱仪（Agilent 7890A，Agilent Technologies 公司），配 FID 检测器；氨基酸自动分析仪（S-433D，Sykam 公司）。1.2 试剂 正缬氨酸（Norvaline）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、氨基酸标样、衍生试剂 N-（特丁基二甲基硅烷）-N-甲基三氟乙酰胺（95%；MTBSTFA）含叔丁基二甲基氯硅烷（1%；TBDMSCl）等购自 SigmaAldrich 公司(St.Louis,MO)。乙腈（ACN）为国产优级纯。1.3 氨基酸标准溶液 用超纯水（Milli-Q，Millipore）或 0.1 mol/L盐酸配制各种氨基酸 100 mmol/L 标准储备液，使用时稀释为 10 mmol/L 及 1 mmol/L 浓度的工作溶液，分别吸取不同的量来设置系列浓度标准。1.4 衍生条件 吸取一定量的氨基酸（10100 L，含10100 nmol 氨基酸）放于 2 mL 的自动进样6期 张佳，等：GC-MS及 GC测定茶叶中主要游离氨基酸的方法研究 447 瓶中，加入 40 nmol 的正缬氨酸作为内标，置于氮吹仪中于室温下吹干，分别加入 40100 L的 ACN 或 DMF 衍生辅助试剂、40100 L 的MTBSTFA 衍生试剂（MTBSTFA 与 ACN 或DMF 的比例为 11），加入量依据不同的氨基酸量而定，依设定温度衍生一定时间，反应完成后冷却至室温，待用。1.5 色谱条件 GC-MS 条件：DB-5 毛细管柱（30 m0.25 mm 0.25 m，Agilent Technologies）；载气为高纯氦气，柱流速 1 mL/min，进样口温度 230，注射温度 270，分流比 30501（取决于不同的氨基酸浓度），柱温程序为：起始温度 120，保持 2 min，以 5/min 速度升温至 270，保持 10 min；进样体积 1 L，质谱离子扫描范围为 200510 m/z。GC-FID 条件：载气氮气，注射温度 270，柱温程序为：起始温度 120，保持 2 min，以 3/min 速度升温至 270，保持 10 min。进样体积 2 L，其余条件同 GC-MS。1.6 标准曲线 取 101 000 nmol 的氨基酸，各加入 40 nmol的正缬氨酸内标，加热衍生 110，30 min。冷却至室温后，分别进行 GC-MS 及 GC-FID检测。1.7 添加回收及精密度 取 0.1 g 茶样，加入 5 mL 超纯水于沸水浴中浸提 5 min，冷冻离心机离心 10 min。分为两份，一份为空白对照，另一份加入 60 nmol的茶氨酸、30 nmol 谷氨酸、4 nmol 谷氨酰胺、4 nmol 丝氨酸、4 nmol 天门冬氨酸，按上述条件进行衍生和测定。精密度试验中，取 100 nmol的氨基酸标准，按上述条件衍生，在 GC-MS 或GC-FID 连续测定 5 次，计算 RSD 值。1.8 样品分析 取 0.1 g 茶样，按上述方法提取，提取液分成两份，一份用于 GC-MS 及 GC-FID 检测，另一份用于氨基酸自动分析仪分析。2 结果分析 2.1 氨基酸衍生条件优化 衍生反应的效率与反应条件有密切关系，酸度、反应温度、时间和试剂对衍生效果有重要影响。酸性条件（HCl，0.1 mol/L）会降低丝氨酸、谷氨酸、茶氨酸、谷氨酰胺等氨基酸的衍生效率，而选用超纯水配制氨基酸具有较高的衍生效率（表 1）。表 2 为不同温度和时间下不同试剂对氨基酸的衍生效率，从表中可以看出，在 70、5 和 30 min 衍生时间条件下，天门冬氨酸、谷氨酸及谷氨酰胺以 ACN 的衍生效率高于DMF，而在 15 min 衍生时间条件下，衍生效率DMF高于 CAN；茶氨酸在较短衍生时间（5、15 min）时以 DMF 的衍生效率较高，衍生时间为 30 min 时，DMF 比 CAN 的低；在 110的衍生条件下，所有氨基酸的衍生效率均明显提高，天门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的衍生效率 ACN 高于 DMF，茶氨酸 30 min 衍生的效率也以 CAN 略高。综合考虑各种氨基酸的衍生，ACN 的衍生效率高于 DMF。综合各项条件，选用 110、30 min 和 ACN 进行衍生，各氨基酸衍生峰分离度良好（图 1、图 2）。2.2 茶氨酸衍生质谱峰分析 茶氨酸由 MTBSTFA 衍生经 GC-MS 分析，产生 3 个衍生峰，出峰时间分别为 19.75、24.60 和 26.90 min（分别为第 8、14、16 峰）（图 1）。通过质谱分析衍生分子量，可推测其结构式。第 1 个茶氨酸峰的相对分子质量为357（图 3-a、图 3-d）；第 2 个茶氨酸峰的相对分子量为 402（图 3-b、图 3-e 和图 3-f），即有 1 个氨基端没有被衍生；第 3 个茶氨酸峰为完全衍生峰，相对分子质量为 516（图 3-c、图 3-g）。2.3 内标的选择 正缬氨酸是一种较常用且不存在于茶叶448 茶 叶 科 学 30 卷 中的氨基酸。与待测目标的分离效果很好，不会影响目标氨基酸峰的分离，且精密度比较高（RSD0.2%，n=6），因此选用正缬氨酸为内标。2.4 标准曲线及茶叶样品分析 采用上述衍生条件，分别以各种氨基酸峰面积 y（经内标较正）对各氨基酸量 x（nmol）作线性回归。各回归方程的相关系数 R2均大于 0.99，相关性较好（表 3）。取 100 nmol 的氨基酸标液衍生后，连续上机测定 5 次，GC-MS 与 GC-FID 两种检测的 RSD均小于 5%，表明测定的精密度良好（表 4）。表 1 盐酸对氨基酸衍生效率的影响（GC-MS 测定）Table1 Impact of hydrochroric acid on derivatization efficiency of amino acids(GC-MS,peak area,106)H2O，氨基酸含量 Amino acid content（nmol）HCl，氨基酸含量 Amino acid content（nmol）10 40 80 10 40 80 氨基酸 Amino acid(峰面积106)(峰面积106)(峰面积107)(峰面积106)(峰面积106)(峰面积107)丝氨酸（Ser）12.0 72.4 16.1 5.98 34.7 6.4 谷氨酸（Glu）13.0 92.2 18.8 3.33 41.1 10.1 茶氨酸（Thea）2.7 8.8 1.0 1.82 9.0 0.8 谷氨酰胺（Gln）6.4 39.0 10.6 0.28 6.6 1.7 表 2 试剂、温度、时间对氨基酸衍生效率（峰面积）的影响（GC-MS 法）Table 2 Impact of reagent,temperature and time on derivatization efficiency(GC-MS,peak area)试剂 Reagent 温度 Temperature（）时间 Time（min）Thea(104)Asp(107)Glu(107)Gln(105)ACN 70 5 1.87 3.09 2.79 28.48 ACN 70 15 1.48 1.31 1.03 0.76 ACN 70 30 40.59 3.46 2.66 26.81 ACN 110 5 6.50 5.04 4.15 33.27 ACN 110 15 51.43 3.37 2.52 32.26 ACN 110 30 96.33 4.31 3.47 66.46 DMF 70 5 48.3 2.46 1.57 9.99 DMF 70 15 5.40 1.39 1.08 2.83 DMF 70 30 20.35 2.79 2.28 26.45 DMF 110 5 44.96 1.86 1.44 7.13 DMF 110 15 53.65 1.91 1.50 6.36 DMF 110 30 92.6 2.16 1.75 15.72 图 1 氨基酸标样（左）和茶叶游离氨基酸（右）经 MTBSTFA 衍生 GC-MS 测定图谱 Fig.1 Chromatogram(GC-MS)of derivative amino acids as pure standards(left)and from tea extract(right)注：峰 1：丙氨酸，峰 2：甘氨酸，峰 3：缬氨酸，峰 4：正缬氨酸，峰 5：亮氨酸，峰 6：异亮氨酸，峰 7：脯氨酸，峰 8：茶氨酸，峰 9：蛋氨酸，峰 10：丝氨酸，峰 11：苏氨酸，峰 12：苯丙氨酸，峰 13：天门冬氨酸，峰 14：茶氨酸，峰 15：谷氨酸，峰 16：茶氨酸，峰 17：赖氨酸，峰 18：谷氨酰胺，峰 19：组氨酸，峰 20：酪氨酸。Note:Peak 1:Ala,Peak 2:Gly,Peak 3:Val,Peak 4:Nor Val,Peak 5:Leu,Peak 6:Ile,Peak 7:Pro,Peak 8:Thea1,Peak 9:Met,Peak 10:Ser,Peak 11:Thr,Peak 12:Phe,Peak 13:Asp,Peak 14:Thea2,Peak 15:Glu,Peak 16:Thea3,Peak 17:Lys,Peak 18:Gln,Peak 19:His,Peak 20:Tyr.时间(分)Time(min)时间 Time（min）时间 Time（min）1009080706050403020100605040302010010 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 326期 张佳，等：GC-MS及 GC测定茶叶中主要游离氨基酸的方法研究 449 表 3 主要氨基酸的线性方程及相关系数 Table 3 Regression equations and coefficients of amino acids standards 氨基酸 Amino acid 含量 Content(x，nmol)GC-MS 法 GC-MS Method（峰面积 Peak area;y，106）R2 GC-FID 法 GC-FIDMethod（峰面积 Peak area;y）R2 Ala 101 000 y=0.17x-1.85 0.992 y=10.80 x+229.96 0.995 Gly 101 000 y=0.08x+1.49 0.994 y=9.52x+396.53 0.998 Val 101 000 y=0.12x+1.08 0.995 y=12.28x+190.78 0.996 Leu 101 000 y=0.16x+2.13 0.990 y=13.08x+244.00 0.999 Iso 101 000 y=0.17x+3.75 0.992 y=12.71x+222.95 0.999 Met 101 000 y=0.06x+1.93 0.996 y=10.09x+288.16 0.997 Ser 101 000 y=0.19x+5.29 0.996 y=12.77x-135.36 0.998 Thr 101 000 y=0.11x+1.31 0.999 y=5.21x-53.54 0.998 Asp 101 000 y=0.19x+3.70 0.995 y=14.72x+146.72 1.000 Glu 101 000 y=0.16x+2.70 0.998 y=15.95x+131.42 1.000 Thea 101 000 y=0.14x-3.03 0.992 y=4.96x+240.82 0.994 Lys 101 000 y=0.07x+1.22 0.997 y=13.52x-221.34 0.999 Gln 101 000 y=0.03x+0.11 0.994 y=27.09x+45.05 0.999 His 101 000 y=0.09x0.74 0.992 y=15.20 x+109.62 1.000 Tyr 101 000 y=0.24x+2.18 0.998 y=18.53x+223.17 1.000 时间(分)Time(min)15图 2 氨基酸标样（上）和茶叶游离氨基酸（下）经 MTBSTFA 衍生 GC-FID 分析图谱 Fig.2 GC-FID chromatogram of pure amino acid standards(above)and from tea extract(below)注：峰 1：丙氨酸，峰 2：甘氨酸，峰 3：缬氨酸，峰 4：正缬氨酸，峰 5：亮氨酸，峰 6：异亮氨酸，峰 7：脯氨酸，峰 8：蛋氨酸，峰 9：丝氨酸，峰 10：苏氨酸，峰 11：苯丙氨酸，峰 12：天门冬氨酸，峰 13：茶氨酸，峰 14：谷氨酸，峰 15：茶氨酸，峰 16：赖氨酸，峰 17：谷氨酰胺，峰 18：组氨酸，峰 19：酪氨酸 Tyr。Note:Peak 1:Ala,Peak 2:Gly,Peak 3:Val,Peak 4:Nor Val,Peak 5:Leu,Peak 6:Ile,Peak 7:Pro,Peak 8:Met,Peak 9:Ser,Peak 10:Thr,Peak 11:Phe,Peak 12:Asp,Peak 13:Thea2,Peak 14:Glu,Peak 15:Thea3,Peak 16:Lys,Peak 17:Gln,Peak 18:His,Peak 19:Tyr.450 茶 叶 科 学 30 卷 表 4 GC-MS 和 GC-FID 检测精密度（峰面积与内标的面积比）Table 4 Relative standard deviation(RSD)of peak area ratios of amino acids to internal standard(Nor Valine)by GC-MS and GC-FID GC-MS GC-FID 氨基酸 Amino acid 平均值 Mean RSD（%）平均值 Mean RSD（%）Ala 2.360.06 2.61 2.430.01 0.30 Gly 2.020.07 3.40 2.840.03 1.18 Leu 3.390.06 1.82 3.340.03 0.78 ILe 3.700.16 4.24 3.080.06 1.93 Met 3.410.14 4.09 3.130.03 0.93 Ser 3.420.12 3.63 1.590.05 2.87 Thr 0.190.01 3.61 0.650.01 2.04 Asp 4.540.15 3.32 3.310.03 0.96 Glu 3.560.14 3.89 3.400.03 0.73 Thea 0.350.01 2.31 0.950.03 3.48 Gln 0.360.01 3.74 2.340.04 1.62 Tyr 4.470.18 3.98 4.290.01 0.30 图 3 茶氨酸衍生峰质谱图及可能结构 Fig.3 Mass spectra and supposed structural formula of derivative products of theanine 注：(a)茶氨酸衍生第 1 峰（出峰时间 19.75 min，图 1 峰 8），可能结构（d，MW:357）；(b)茶氨酸衍生第 2 峰（出峰时间 24.60 min，图 1 峰 14），可能结构（e、f，MW:402）；(c)茶氨酸衍生第 3 峰（出峰时间 26.90 min，图 1 峰 16），可能结构（g，MW:516）。Note:(a)The first peak of derivatized amino acids(19.75 min,Peak No.8 in Fig 1),supposed formula(d,MW357);(b)The second peakof derivatized amino acids(24.60 min,Peak No.14 in Fig 1),supposed formula(e,f,MW402);(c)The third peak of derivatizedamino acids(26.9 0 min,Peak No.16 in Fig 1),supposed formula(g,MW516).(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)6期 张佳，等：GC-MS及 GC测定茶叶中主要游离氨基酸的方法研究 451 表 5 不同分析方法茶样中氨基酸检测结果 Table 5 Concentrations of amino acids in tea extract measured by GC-MS,GC-FID and Amino Acid Autoanalyzer(AAA)mg/g 氨基酸 Amino acid GC-MS GC-FID 自动分析仪(AAA)Ala 0.640.02 0.560.02 0.500.07 Thea 15.600.90 14.600.90 15.201.70 Glu 6.400.37 5.030.27 5.800.72 Gln 1.680.15 2.100.16-Asp 2.430.23 2.600.13 3.150.38 Thr 1.400.25 0.980.45 1.090.15 Ser 0.490.04 0.510.13 0.370.07 表 6 GC-MS 和 GC-FID 分析茶叶中主要氨基酸的回收率 Table 6 Recoveries of selected amino acids in spiked tea extract GC-MS GC-FID 氨基酸 Amino acid 本底(nmol)添加(nmol)实测(nmol)回收率（%）本底(nmol)添加(nmol)实测(nmol)回收率（%）Ala 27.07 4 30.59 88 25.40 4 28.70 85 Ser 17.04 4 20.92 97 14.37 4 18.25 92 Asp 68.54 4 72.06 88 63.45 4 66.97 86 Thea 393.6 60 458.4 108 310.6 60 375.4 106 Glu 144.2 30 170.0 86 135.1 30 165.4 86 Gln 41.38 4 44.94 89 36.7 4 40.26 87 同一茶样提取液分别用 GC-MS、GC-FID检测和氨基酸自动分析仪分析，各仪器测定结果基本一致（表 5），具有可比性。填加回收试验表明，茶氨酸的回收率为107%，其余几种氨基酸的回收率均高于 85%（表 6）。3 讨论与结论 利用气相色谱仪或气-质联用进行氨基酸分析，前人已有许多研究8-19，但未见对茶叶中游离氨基酸分析的研究报道，对茶氨酸的衍生特性也不清楚。氨基酸硅烷化衍生对于温度、时间以及衍生试剂都十分敏感，本研究表明，不 同 温 度、时 间 条 件 下 茶 氨 酸 经MTBSTFA 衍生均产生 3 个衍生峰，最先出现的 1 个峰很小，为环状化合物，不会影响茶氨酸及其他氨基酸，而中间出现的峰为不完全衍生峰，即有 1 个氮端没有被衍生，最后出现的峰可能是茶氨酸的完全衍生峰，符合一般的MTBSTFA 衍生产生的离子碎片结构特征。在两种有机溶剂中，DMF 有时比 ACN 的完全衍生峰要高，而不完全衍生峰低一些，但线性没有 ACN 的好。而就温度而言，对各种氨基酸均产生影响，且茶氨酸随着温度的升高，其完全衍生峰的峰面积也增大，当温度为 30，衍生时间为 5 min 时，第 1 个环状峰及第 2 个不完全衍生峰比第 3 个完全衍生峰面积大，随着衍生时间延长、温度升高，完全衍生峰（第3 个峰）面积增大，且高于其余两个峰；在 70、5 min 和 110、30 min 时，第 3 个峰与第 2 个峰面积比相当，但是在 110条件下衍生峰的绝对面积大，说明衍生效率更高。由于GC-FID 用的载气为氮气，因此分离效果不如氦气，两种方法比较，GC-MS 的响应值更高一些。GC-MS 是一种简单有效的定性、定量手段，采用 MTBSTFA 作为衍生试剂对茶叶中游离氨基酸进行检测，其方法简便灵敏，前处理方法简单，线性范围较宽，且线性良好，适用于茶叶中游离氨基酸的定量分析。且这种方法可用于测定氨基酸中氮素同位素标记丰度，因此可为茶树同位素标记氮素吸收、氨基酸代谢452 茶 叶 科 学 30 卷 的研究提供研究方法。参考文献：1 倪君,须海荣.茶叶氨基酸检测方法的研究进展J.茶叶,2007,33(2):63-66.2 Sasaoka K,Kilo M.Studies on the biosynthesis of theanine in tea seedlings synthesis of theanine by the homogenate of tea seedlings J.Agric Biol Chem,1963,27(6):467-468.3 Sasaoka K,Kilo M,Onishi Y.Some 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