发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程.pdf

第 28 卷第 19 期农 业 工 程 学 报Vol.28No.192482012 年10 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringOct.2012发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程宋江峰，李大婧，刘春泉（江苏省农业科学院农产品加工所/国家农业科技华东(江苏)创新中心-农产品加工工程技术研究中心，南京 210014）摘要：为了充分提取和利用高生物活性的天然左旋多巴（L-DOPA），研究了超声波强化提取发芽蚕豆 L-DOPA的工艺条件，并初步探讨了超声浸提动力学过程。基于单因素试验，以超声功率、液固比、萃取时间为考察因素，采用 Box-Behnken 试验设计进行了工艺参数优化，结果表明，超声功率对发芽蚕豆 L-DOPA 得率的影响较大；原料用量 2.0 g，采用含 30%乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液为提取溶剂，其较佳提取工艺条件为：超声功率 257 W、液固比 31 mL/g、萃取时间为 37.4 min。在此条件下，发芽蚕豆 L-DOPA 的平均得率为 1.47%，较未发芽蚕豆增加0.58 倍，略高于传统提取法，且超声强化提取显著缩短了浸提时间。对最优提取条件下 L-DOPA 得率随时间变化的动力学分别用 Film 模型、非稳态扩散理论和 Ponomaryov 经验方程进行拟合，其中 Film 理论模型的拟合度较好，其决定系数 R2值最大，为 0.9928。研究结果为天然 L-DOPA 制备提供了参考。关键词：提取，优化，动力学，L-DOPA，发芽蚕豆doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.19.033中图分类号：TS201文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-19-0248-07宋江峰，李大婧，刘春泉.发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程J.农业工程学报，2012，28(19)：248254.Song Jiangfeng,Li Dajing,Liu Chunquan.Optimization and kinetics for ultrasonic-assisted extraction of L-dopa fromfava bean(Vicia faba L.)sproutsJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of theCSAE),2012,28(19):248254.(in Chinese with English abstract)0引言左旋多巴（L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA）是神经递质多巴胺的直接前体，广泛存在于蚕豆、猫豆等豆科植物中1-2。在植物体内，L-DOPA 主要通过苯丙氨酸途径产生副产物酪氨酸，再经酪氨酸羟化酶作用形成2。近年来，蚕豆(Vicia faba L.)作为一种粮食、蔬菜兼用的食用豆类作物，已越来越多地被用作治疗帕金森症、高血压、肾功能衰竭和肝硬化的膳食补充剂。帕金森病（Parkinson sdisease，PD）是一种由中脑部分多巴胺和乙酰胆碱失衡引起的部分神经退行性变疾病，迄今为止，治疗帕金森病的“金标准”仍是 L-DOPA，它能穿过血脑屏障后再脱羧转化为多巴胺发挥药理作用3-5。此外，研究还显示，L-DOPA 能阻止 H2O2诱导的细胞 DNA 氧化损伤6，在体外显示较强的抗氧化活性及自由基清除能力7。收稿日期：2012-03-23修订日期：2012-09-22基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目CX(11)2067作者简介：宋江峰（1981），男，湖北应城人，研究方向为果蔬资源综合利用。南京 江苏省农业科学院农产品加工研究所，210014。Email:通信作者：刘春泉（1959），男，江苏如东人，研究员，主要研究方向为农产品精深加工及产业化。南京 江苏省农业科学院农产品加工研究所，210014。Email:由于化学合成和微生物酶转化制得的左旋多巴伴随许多杂质，给工业化分离纯化带来困难，此外，化学合成 L-DOPA 具有一定的负面效应和毒副作用，因此从植物中提取分离天然 L-DOPA 成为各国科学家研究的热点8-9。1913 年 Guggenheim10第一次从蚕豆中分离出天然 L-DOPA。国内于 1972 年利用 30%乙醇 和 0.1%醋酸从藜豆 种子中提取L-DOPA 获得成功11。嗣后，采用溶剂提取的方法多有报道9,12-13。由于 L-DOPA 性质不稳定，易受氧、热条件影响，传统方法浸提时间长、效率低，对 L-DOPA 提取不利，而超声强化提取能在较短时间内通过空化效应提高 L-DOPA 浸出速度，从而有效避免 L-DOPA 的降解而影响其生物活性。早期研究表明，蚕豆种子中 L-DOPA 含量相对较低，而豆苗中 L-DOPA 含量较种子高近 20 倍；通过发芽处理技术手段能诱导 L-DOPA 的显著富集，从而提高其医疗保健价值14-17。因此，本研究拟在常规溶剂提取工艺基础上，采用超声波强化提取法，并结合响应面分析，优化发芽蚕豆中L-DOPA的提取工艺，研究各提取因素对 L-DOPA 的影响情况，同时于最优提取条件下找到一个适合实际应用的提取过程动力学模型，为实验室制备及工业化生产提供技术参考，也为后续进一步研究其功能活性，开发具有一定保健功能特性的食品和药品提供理论依据。第 19 期宋江峰等：发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程2491材料与方法1.1材料干蚕豆种子（含水率为 1.72%）购于江苏省南京市孝陵卫农贸市场。1.2试剂与仪器L-DOPA 标准品（纯度99%），购于美国西格玛试剂公司。甲醇为色谱纯，购于德国默克公司。乙醇和醋酸为分析纯（南京化学试剂有限公司），其他试剂均为国产分析纯，去离子水为实验室自制。KQ-300D 型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），美国 Agilent 1200 高效液相色谱仪及其配套化学工作站，检测器为二极管阵列检测器（DAD）（美 国 安 捷 伦 科 技 有 限 公 司），HPX-160BSH-III 恒温恒湿培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），FD-1A-50 真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司），FW100 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），BS224S 电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器公司），TG16-WS 台式高速离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司），RE-52A 真空旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1.3试验方法1.3.1样品处理选择成熟、无病虫害的蚕豆种子为原料，经清洗去除杂质后放入 55水浸泡 8 h。双层纱布平铺于培养皿底部，将蚕豆种子均匀摊开，喷适量去离子水，在 25恒温恒湿培养箱中避光培养 2 d，取发芽的蚕豆经真空冷冻干燥至含水率 1.5%以下，并粉碎过 60 目筛，贮藏于 4冰箱备用。1.3.2超声波强化提取取 2.0 g 干发芽蚕豆粉，脱脂后加入一定量提取溶剂，浸泡 35 min，待溶剂完全渗入植物材料中，将其置于超声清洗仪，按照 1.3.4 设定条件进行提取，提取结束后，样品液经过滤、3 000 r/min 离心10 min，收集上清液待测。传统溶剂浸提采用巫世红等人12方法进行。发芽蚕豆粉加入 0.1 mol/L 醋酸溶液振摇后冷浸 24 h，过滤后离心，并定容用于高效液相色谱（HPLC）分析。1.3.3L-DOPA 的 HPLC 测定及得率计算色谱条件：安捷伦 Zorbax 300SB-C18 色谱柱(250 mm 4.6 mm,5 m)，流动相为 0.1 mol/L 醋酸溶液：甲醇（955，体积比)，流速 0.8 mL/min，检测波长 280 nm，柱温 25 C。根据峰面积大小，由所绘制的标准曲线，即峰面积 A 与 L-DOPA 浓度C（mg/mL）的线性回归方程 A=19180C+93.537（R2=0.9996），计算 L-DOPA 含量。L-DOPA 得率(%)=L-DOPA 质量(mg)/发芽蚕豆粉质量(mg)100%（1）1.3.4单因素及响应面试验设计通过预实验和前人的相关试验报导18-19，确定影响 L-DOPA 提取的主要因素为提取溶剂、超声功率、液固比和萃取时间，据此，在室温（25）条件下采用含乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液为提取溶剂，超声波频率为 20kHz，分别以不同的乙醇体积分数、超声功率、液固比及萃取时间进行单因素试验，分析各单因素对发芽蚕豆 L-DOPA 得率的影响。综合单因素试验结果，进行 Box-Benhnken 中心组合试验设计（Box-Benhnken Design,BBD）和响应面分析。1.3.5动力学模型从天然植物中提取生物活性成分的动力学过程满足非稳态扩散理论模型，Film 理论及 Ponomaryov经验方程，如表 1 所示。3 个模型均基于两相萃取机制：洗涤过程，在提取刚开始活性物质在提取液中的浓度迅速增加；慢萃取阶段，提取物浓度增加缓慢20-22。表 1从植物材料中提取生物活性成分的动力学模型Table 1Kinetic models of bioactive substances extractionfrom plant materials by solvent模型动力学方程线性转换Film 理论1(1)ktscb ec ln(1)ln(1)scbktc非稳态扩散理论0(1)k tqb eq（0ln()ln(1)qbk tqPonomaryov 经验方程tkbqq 10注：b,b和 b分别为 3 种理论模型的洗涤因子，1；c 为提取过程中提取液中活性成分的质量浓度，g/L；cs为 25下活性成分溶于提取溶剂的最大质量浓度，g/L；k 为 Film 模型慢萃取因子，min-1；k为非稳态扩散模型慢萃取因子，min-1；k为 Ponomaryov 经验模型缓慢萃取下的比速率，即 1 q/q0与时间 t 线性关系的斜率，min-1；q 为提取过程中从植物材料中提取出的活性成分质量分数，g/100g；q0为植物材料中活性成分的理论质量分数，g/100g；t 为萃取时间，min。1.4数据分析所有试验均重复 3 次，试验数据的处理采用Office Excel 2003及Design Expert 7.1.3 软件进行分析。2结果与分析2.1萃取参数对 L-DOPA 得率的影响2.1.1提取溶剂对 L-DOPA 得率的影响提取溶剂的选择是进行工艺优化的关键步骤，不同溶剂对 L-DOPA 得率影响很大。由于 L-DOPA结构分子中含有 2 个羟基基团，具有较高的亲水性和亲稀醇溶液特性。选择乙醇具有其他溶剂不能比拟的优点，如高萃取速率，环境友好及低毒性，此农业工程学报2012 年250外，添加一定量酸，可以起到双重作用，一是提高了 L-DOPA 的溶解度和稳定性，二是增强了细胞壁的通透性，故可促进 L-DOPA 溶解与扩散，但是太低的 pH 值能破坏 L-DOPA 结构，因此本文拟选择含一定体积分数乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液作为提取溶剂。2.1.2乙醇体积分数对 L-DOPA 得率的影响固定超声功率 240W，液固比 30 mL/g，萃取时间 40min，考察不同乙醇体积分数对 L-DOPA 得率的影响。由图 1a 看出，不同体积分数乙醇显著影响萃取得率。当乙醇体积分数从 0 增加至 30%时，L-DOPA 得率增加；浓度超过 30%，开始逐渐降低。因此最佳乙醇体积分数为 30%，说明 L-DOPA 更易溶于稀醇-酸溶液中。随着乙醇体积分数的增大，一方面 L-DOPA 溶解度降低，导致得率下降，另一方面，醇溶性杂质、亲脂性强的成分大量溶出，也阻碍了 L-DOPA 分子向溶剂中的扩散。2.1.3超声功率对 L-DOPA 得率的影响固定提取溶剂为含 30%乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液，液固比 30 mL/g，萃取时间 40min，考察不同超声功率对 L-DOPA 得率的影响。图 1b 显示，发芽蚕豆 L-DOPA 得率在超声功率为 240 W 时，有最大值 1.35%。超声功率在 120180 W 之间，L-DOPA 得率变化不大，主要由于功率相对较低，对 L-DOPA 的辅助浸出作用有限，但是当超声功率超过 180 W 时，L-DOPA 得率明显增加，说明对细胞壁的破碎作用逐渐增强，因而有利于 L-DOPA 的溶出。当超声波功率超过 240 W 后，L-DOPA 的得率变化很小。可能是由于超声波换能器附近的液中产生过于密集的空穴形成一道屏障，阻碍了超声波的传递23。2.1.4液固比对 L-DOPA 得率的影响固定提取溶剂为含 30%乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液，超声功率 240W，萃取时间 40min，考察不同液固比对 L-DOPA 得率的影响。通常讲，较大的溶剂用量能促进目标成分的有效溶出。由图 1c 可知，当液固比增加至 2030 mL/g 之间，L-DOPA得率提高。但当液固比超过 30 mL/g，L-DOPA 得率减少，原因可能是溶剂用量过大，使得其他成分的溶出对 L-DOPA 造成影响；也会因超声负荷增大造成有限时间内对物料的提取不完全。2.1.5萃取时间对 L-DOPA 得率的影响固定提取溶剂为含 30%乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液，超声功率 240W，液固比 30 mL/g，考察不同萃取时间对 L-DOPA 得率的影响。由图 1d 中可见，当提取时间为40 min时，多糖得率达到最大，40 min以后得率呈下降趋势。从节省能源考虑，超声时间不应超过 40 min。注：提取溶剂为含 30%（体积分数）乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液，超声功率 240 W，液固比 30 mL/g,萃取时间 40 min。图 1乙醇体积分数、超声功率、液固比和萃取时间对发芽蚕豆 L-DOPA 得率的影响Fig.1Extracting parameters on yield of L-DOPAfrom germinated faba bean sprouts第 19 期宋江峰等：发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程2512.2BBD 试验设计优化根据单因素试验结果，以含 30%乙醇的 0.1mol/L 醋酸溶液为提取溶剂，选择选择超声功率（210270 W；X1），萃取时间（3060 min；X2）及液固比（2040 mL/g；X3）3 个因素，以发芽蚕豆 L-DOPA 得率为响应值，进行 BBD 试验设计及响应曲面法（Response Surface Methodology,RSM）RSM 优化24-25，设计三因素三水平试验方案，共计17 个试验点，用以确定 L-DOPA 提取的最优工艺组合。试验结果见表 2，根据多项式回归方程，计算出所拟合的回归方程的各项系数，并且建立得率对试验因子的二次多项式方程为Y=1.44+0.062X1 0.010X2+0.017X3 0.062X120.067X22 0.063X32 0.040X1X2 0.015X1X30.020X2X3（2）式中，X1超声功率，W，X2萃取时间，min，X3，液固比，mL/g。表 2发芽蚕豆 L-DOPA 超声提取工艺优化的响应面试验方案及结果Table 2Box-Behnken design matrix of three variables andexperimentally observed responsesL-DOPA 得率/%试验号X1超声功率/WX2萃取时间/minX3液固比/(mL g-1)实测值预测值121040201.211.22227040201.371.38321040401.291.29427040401.391.38521030301.221.22627030301.421.42721050301.281.28827050301.321.32924030201.291.301024030401.351.361124050201.311.301224050401.291.281324040301.421.441424040301.481.441524040301.461.441624040301.481.441724040301.361.44对该模型方程进行方差分析（表 3）可知，回归方程失拟性检验 F=0.064F0.05(3,4)差异不显著，则认为所选用的二次回归模型是适当的。决定系数R2值(0.9031)表明观测值与预测值具有高度的相关性，因此模型可用于发芽蚕豆 L-DOPA 超声强化提取实际情况预测。表 3 结果还表明，超声功率（X1）与发芽蚕豆 L-DOPA 得率呈极显著的正相关。从交互项看出，3 个因素彼此的交互项均对发芽蚕豆L-DOPA 得率呈不显著的正相关。3 个因素的二次项均与发芽蚕豆 L-DOPA 得率呈显著的正相关。说明在本试验条件下，超声功率在整个试验中对发芽蚕豆 L-DOPA 得率起着重要作用。采用一阶偏导求解法26，对数学回归模型取一阶偏导数等于 0，得到最优工艺方案为：超声功率257 W，提取时间 37.4 min，液固比 31 mL/g。对此方案进行试验验证得到 L-DOPA 得率为 1.47%0.12%(N=5)，与优化方案的理论值 1.46%相比，相对误差约为 0.7%。表 3L-DOPA 得率的响应面二次模型方差分析与显著性检验Table 3Analysis of variance and test of significance forresponse surface quadratic model for yield of L-dopa来源自由度平方和均方F 值P 值模型90.100.0117.250.0080X110.0310.03120.070.0029X210.00080.00080.510.4967X310.002450.002451.570.2500X1X210.00640.00644.110.0822X1X310.00090.00090.580.4719X2X310.00160.00161.030.3445X1210.0160.01610.560.0141X2210.0190.01912.320.0099X3210.0160.01610.260.0141失拟项30.00050.00016670.0640.9761纯误差40.0100.0026总和160.11R2=0.90312.3与传统溶剂浸提比较将超声强化提取L-DOPA最优工艺与传统溶剂提取的较佳工艺进行比较，结果如表 4。与传统溶剂浸提相比，超声强化提取L-DOPA得率略有提高，提取时间由 24 h 缩短为 0.6 h，因此非常适合于L-DOPA 的实验室制备与分析。同时，超声强化提取发芽蚕豆 L-DOPA 得率较蚕豆种子提高近58.1%。表 4超声法与常规溶剂提取法的比较Table 4Yield of L-DOPA using ultrasound assistedextraction and conventional solvent extraction method条件萃取方法液固比/(mL g-1)萃取时间/h发芽蚕豆L-DOPA得率/%蚕豆种子L-DOPA得率/%超声强化提取310.61.47 0.020.93 0.01传统溶剂浸提1125241.44 0.030.94 0.042.4浸提动力学模型分析为了描述超声强化提取发芽蚕豆L-DOPA得率的动力学变化过程，将 2.0 g 发芽蚕豆粉按照液固比 31 mL/g 加入含 30%乙醇的 0.1 mol/L 醋酸溶液中进行超声强化提取（超声功率 257 W），分别处农业工程学报2012 年252理 10、15、20、25、30、35、37 min，按照提取工艺得到 L-DOPA 并测定得率。获得的数据分别采用Film 理论模型、非稳态扩散模型和 Ponomaryov 经验方程进行拟合，拟合曲线和得到的各个模型的动力学参数分别如图 2 和表 5 所示。图 2 表示了各模型基本动力学方程的线性变换，可以看出，3 个方程在慢萃取阶段试验数据拟合良好。通过线性回归方法计算各模型动力学参数，如表 5 所示，决定系数 均 高 于0.98，Film 理 论 模 型 拟 合 较 好（R2=0.9928），能较为准确地模拟 L-DOPA 提取过程的动力学变化。在萃取溶剂类型和植物材料一定的情况下，动力学参数值仅与动力学模型有关，Film理论模型洗涤因子最大，而 Ponomaryov 经验方程模型洗涤因子最小（b=0.68）。图 2动力学方程线性转换Fig.2Linearized forms of kinetic equations表 5动力学参数值Table 5Values of kinetic parameters浸提动力学参数模型Bk/103.min-1决定系数 R2Film 理论3.132.10.9928非稳态扩散1.118.70.9892Ponomaryov 方程0.682.30.98923结论将超声波强化提取技术应用于发芽蚕豆L-DOPA 的提取与传统溶剂浸提相比能够提高得率，缩短提取时间，更好地保持 L-DOPA 的生物活性，主要是由于超声空化效应促使液-固之间发生分子的相互渗透，促进了 L-DOPA 的溶解，加快了有效成分进入介质。本研究基于单因素试验，并采用BBD 试验设计优化了发芽蚕豆 L-DOPA 超声辅助提取工艺方案，获得最优工艺为：原料用量 2.0 g时，超声功率 257 W，提取液为含 30%乙醇的0.1 mol/L 醋酸溶液，液固比 31 mL/g 及提取时间37.4 min，在此条件下 L-DOPA 实际得率为 1.47%。发芽蚕豆 L-DOPA 的超声提取很好地符合了 Film理论模型，说明Film模型适合于超声提取L-DOPA。参考文献1Ray H,Georges F.A genomic approach to nutritional,pharmacological and genetic issues of faba bean(Viciafaba):prospects for genetic modificationsJ.GM Crops,2010,1(2):99106.2Randhir R,Shetty P,Shetty K.L-DOPA and totalphenolic stimulation in dark germinated fava bean inresponsetopeptideandphytochemicalelicitorsJ.Process Biochemistry,2002,37(11):12471256.3German D C,Manaye K,Smith W K,et al.Midbraindopaminergic cell loss in Parkinsons disease:computervisualizationJ.Annals of Neurology,1989,26(4):507514.4Kitagawa M,Tashiro K.Low-dose levodopa therapy inJapanese patients with Parkinson s disease:a retrospectivestudyJ.Internal Medicine,2005,44(9):339943.第 19 期宋江峰等：发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程2535Schapira A H.Present and future drug treatment forParkinson s diseaseJ.Journal of Neurology,Neurosurgeryand Psychiatry,2005,76(11):14721478.6Shia Y L,Benzieb I F F,Buswell J A.L-Dopa oxidationproducts prevent H2O2-induced oxidative damage tocellular DNAJ.Life Science,2002,71(26):30473057.7G lcinİ.Comparisonof in vitroantioxidantandantiradical activities of L-tyrosine and L-DopaJ.AminoAcids,2007,32(3):431438.8Shetty P,Atallah M T,Shetty K.Effects of UVtreatment on the proline-linked pentose phosphatepathway for phenolics and L-DOPA synthesis indark germinated Vicia fabaJ.Process Biochemistry,2002,37(11):12851295.9李华钟，孙伟，陈坚.左旋多巴的合成与提取J.氨基酸和生物资源，2000，22(4)：3338.Li Huazhong,Sun Wei,Chen Jian.The synthesis and thepurification of L-DOPAJ.Amino Acids and BioticResources,2000,22(4):3338.(in Chinese with Englishabstract)10 GuggenheimM.Dioxyphenylalanin,eineneueAminosure aus Vicia fabaJ.Hoppe-Seylers Zeitschriftfur Physiologische Chemie,1913(88):276.11 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L-DOPA(Levo-dihydroxy phenylalanine),the present study was undertaken to explore the potential applicability of ultrasonic waves to isolate L-DOPAfrom germinated sprouts,extraction kinetics were also preliminarily studied.Based