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开口箭提取物细胞毒活性研究【摘要】 目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭提取物的细胞毒活性，为进行深层次研究提供依据。方法采用四甲基偶氮唑盐比色法。结果开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60和Caski细胞的抑制作用显着，与阴性对照相比,对HL-60细胞的抑制率达到%，%，%，%，其IC50为， g/ml。对Caski细胞的抑制率达到%，%，%，%，其IC50为， g/ml。结论开口箭提取物对HL-60和Caski细胞具有明显的抑制作用。【关键词】 开口箭； 皂苷； MTT法； 细胞毒活性Abstract：ObjectiveTo observe the cytotoxicities of the extracts of Tupistra chinensis Bak. with in vitro cell culture technology, and provide evidence for the furthercytotoxicities were assayed by MTT methods on HL-60 and Caski tumor cells. ResultsThe inhibition effect of the extracts of Tupistra chinensis Bak., total saponins, 30% total saponins and 70% total saponins on HL-60 and Caski cells were all prominent, compared with the negative model group (). Their inhibition ratios on HL-60 tumor cells were as follows: %,%, % and %，and their IC50 were , ,and g/ml. Their inhibition ratios on Caski cells were %, %, % and %，and their IC50 were , g/ml. Conclusion The extracts of Tupistra chinensis Bak. have significant cytotoxicity on HL-60 and Caski tumor cells.Key words：Tupistra chinensis Bak.； Saponin； MTT method； Cytotoxicity 开口箭系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，为着名的传统中药，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用1，2。 本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高3。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性4，5。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭提取物对HL-60和Caski细胞的细胞毒活性,现报告如下。1 材料细胞株人急性淋巴细胞性白血病细胞、人宫颈鳞状上皮癌细胞(Caski)均由三峡大学免疫教研室提供。药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；丝裂霉素 (MMC，浙江海正药液股份有限公司，批号：051211)；酶联免疫检测仪(GENIOS TECAN)；CO2培养箱；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Cornning公司)。 开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室。药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，浓缩后经石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭四部分皂苷。 分别取开口箭甲醇提取物、开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷4个样品，用含10%灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配制成所需浓度，依次为,125,250,500,1 000,2 000 g/ml。丝裂霉素(MMC)用含10%灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配置为250 g/ml。所有受试样品均用 m微孔滤膜过滤除菌。2 方法细胞培养HL-60 和Caski细胞用RPMI-1640培养液，于CO2孵箱中37，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用含%EDTA的%胰蛋白酶消化传代。MTT比色法6按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种180 l，转板6 h后加20 l受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白凋零组和阳性对照组，每组均设6个复孔，培养48 h后加MTT(5 mg/ml)15 l,继续培养4 h后,弃去上清液，加DMSO 100 l,用全自动酶联免疫检测仪于492 nm波长处测定吸光度(OD)值7,求出IC50。抑制率=1-/(对照组OD均值-空白组OD均值）100%。统计学处理 实验数据以s表示，数据分析采用统计软件进行。用Origin软件，通过半对数拟合直线求IC50值。3 结果开口箭总提取物和总皂苷对HL-60细胞的影响结果见表1。表1 总提取物和总皂苷对HL-60细胞的抑制作用与阴性对照组比较，*，*；n=6 由表1可知开口箭总提取物和总皂苷对HL-60细胞的抑制作用显着，与阴性对照组相比有显着性差异，且呈良好的量效关系,总皂苷的抑制作用强于总提取物。开口箭30%总皂苷和开口箭70%总皂苷对HL-60细胞的影响结果见表2。表2 30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用与阴性对照组比较，* ，*；n=6 由表2可知开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用显着，与阴性对照组比有显着性差异。30%总皂苷最佳浓度为25 g/ml，其抑制率达%，70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用虽药物浓度的增加而增大，量效关系明显。开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞的影响结果见表3。表3 开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞的抑制作用与阴性对照组比较，* ，*；n=6 由表3可知开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞抑制作用明显，与阴性对照组比有显着性差异,呈良好的量效关系，总皂苷的抑制作用强于总提取物。开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞的影响结果见表4。表4 30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞的抑制作用与阴性对照组比较，*；n=6 由表4可知，开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞抑制作用显着，与阴性对照组比有显着性差异,呈现一定的量效关系。4 讨论 以上结果表明，开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%皂苷和70%皂苷对体外培养的HL-60和Caski细胞株的抑制作用显着，与阴性对照组比均有显着性差异，其细胞毒作用呈现较明显的剂量依赖性。其中30%开口箭皂苷在25 g/ml时与同浓度下丝裂霉素作用于HL-60细胞的效果相当，70%开口箭皂苷在50 g/ml与丝裂霉素在25 g/ml浓度下作用于HL-60细胞的效果相当。药理实验显示开口箭毒副作用小，因此开发其细胞毒作用有潜在价值。 开口箭总皂苷上大孔树脂柱所得95%开口箭皂苷部分量较少，目前正在研究之中。至于不同的开口箭部位细胞毒活性存在差异，应与它们所含不同皂苷成分有关，还需要对其进行深入研究。 从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道开口箭对HepG2和S180细胞株亦有明显的抑制作用8,本实验室发现开口箭对HL-60和Caski细胞有较强的细胞毒作用，可见开口箭具有广谱抗肿瘤作用，此外开口箭还有祛痰抗炎等作用。因此对开口箭的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。【参考文献】 1 杨春艳,邹 坤,杨兴海,等.开口箭祛痰、抗炎和抑菌实验研究J.中国民族民间医药杂志,2005，2:103. 2 汤子春,邹 坤,汪鋆植,等.开口箭与筒鞘蛇菰提取物的醒酒作用的实验研究J.时珍国医国药,2006,17(11):2163.3 黄 丽,廖全斌,邹 坤,等.开口箭中甾体皂苷元含量的测定J.三峡大学学报自然科学版,2003,25(6):562.4 沈 平，王三龙,杨崇仁,等.弯蕊开口箭中的多羟基甾体皂甙元J.植物学报,2003,45(5):626.5 Pan W b,Chang FR, Wei LM, et al. New flavans, spirostanol sapogenins, and a pregname genin from Tupistra chinensis and their cytotoxicityJ. J. Nat. Prod.,2003,66(2):161.6 司徒镇强,吴军正.细胞培养,第1版M.西安:世界图书出版公司,2004:199.7 徐叔云.药理实验方法学,第3版M.北京:人民卫生出版社,2002：1762.8 朱正光,余传林,蔡 晶,等.开口箭提取物的抗肿瘤作用研究J.中药材,2006,29(3):277.