体外施用小分子RNA抑制稻...孢子发育及致病性的作用效果_喻晗晞.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：江苏省农业科技自主创新项目（）；国家自然科学基金项目（）作者简介：喻晗晞，硕士研究生。通信作者：赵弘巍，教授，主要从事水稻对稻瘟病抗性机制研究，：。喻晗晞，丁绍晨，陈盼，等 体外施用小分子 抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果 南京农业大学学报，（）：，（）：体外施用小分子 抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果喻晗晞，丁绍晨，陈盼，圣聪，李绚，徐乐，赵弘巍（南京农业大学植物保护学院 生物互作与作物健康重点实验室，江苏 南京）摘要：目目的的 本文旨在分析体外施加靶向细胞色素（）的小分子 对稻瘟病菌致病性的抑制作用。方方法法 将稻瘟病菌与双链小分子（）共同孵育，通过测定孢子萌发效率和形态，确定小分子 对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成有抑制作用。在分别施加溶剂（对照组）或（处理组）的情况下，使用稻瘟病菌菌株 侵染水稻日本晴，明确体外施加小分子 是否可以降低稻瘟病菌的致病能力。结结果果 与对照相比，与小分子 共同孵育的稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。甲基修饰（）和硫代甲氧基修饰（）能够延长小分子 的抑制效果。用 和 混合喷施的水稻病斑面积较对照组显著降低。结结论论 体外施加特异性靶向稻瘟病菌 的小分子 能够抑制稻瘟病菌的致病性，具有开发成为高效绿色环保 药剂的潜力和价值。关键词：细胞色素；稻瘟病；抗病性；喷雾诱导基因沉默；药剂中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（）（），.（）（）（），（）（）.，：；（）；水稻是世界上最重要的农作物之一。世界上超过 的人口以水稻为主食。由稻瘟病菌（）引起的稻瘟病是最具有毁灭性的水稻真菌病害之一。稻瘟病菌几乎在所有生长阶段都侵染植物，导致水稻产量降低，严重的时候甚至颗粒无收。自 世纪 年代开始，我国每年稻瘟病发生的面积均在 万 以上，水稻产量损失高达数亿千克。在农业生产上一般通过喷施化学农药和种植抗性品种来控制稻瘟病，常用的药剂有三环唑、稻瘟灵、咪鲜胺等，但化学农药施用不当不仅造成环境污染，还危害人类身体健康。由于稻瘟病菌的遗传变异速度非常快，并且抗性品种使用和布局不科学等因素，容易产生耐药菌株，导致抗病品种的抗病性不能持久。因此，迫切需要开发新型有效南 京 农 业 大 学 学 报第 卷的技术来控制这种病害，以确保粮食安全。小（，简称）是一类长度为 个核苷酸的非编码。可以根据其序列构成特异性识别靶基因并抑制其表达，这一现象被称为 介导的基因沉默（）。及其介导的基因沉默在寄主植物和病原生物之间的相互作用中发挥着多种重要的作用，是病害防控的理想环节。利用 来保护植物的方法是寄主诱导基因沉默（，），其原理是在寄主植物中表达特定针对病原菌关键基因的，然后通过植物与病原菌之间天然存在的 转运机制将其转移到病原生物细胞中，有效沉默病原菌的关键基因，使其无法侵染植物，从而保护寄主植物。最大的局限性是需要可以稳定表达的转基因植物。由于公众对转基因作物安全性的担忧，种植和使用转基因农作物目前还不现实，因此需要开发一种既不依赖转基因作物又不使用大量化学农药的新型植物病害控制技术。作为 的替代方案，喷雾诱导基因沉默（，）具有与 类似的功能，但不使用转基因作物。通过喷洒、淋涂等方式施用，这些 随后进入病原菌细胞并抑制病原菌的生长、发育和致病能力。有研究表明，使用双链（）和小干扰（，）均能实现沉默目标基因的效果。例如，对植物施用靶向禾谷镰刀菌细胞色素 的 后，真菌摄入的 被加工成 并实现特定真菌基因的表达沉默。该发现证明 和 具有同样的 功能。除了准确抑制目标基因的表达外，还具有其他常规化学农药所没有的巨大优势，例如更短的半衰期和施用后的残留量更低等，特别适合一些采摘后立即食用的果蔬类产品。因此，筛选最佳的沉默靶基因并制定理想的 方案具有重要的科学和实践意义。是由位于线粒体基因组中的细胞色素 基因编码。作为一种膜蛋白，细胞色素 是呼吸链中线粒体 复合物（复合物）的核心，因此是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的主要防治靶标。细胞色素电子转移抑制剂抗霉素 和黏噻唑菌醇通过抑制线粒体呼吸过程中细胞色素 的 和 电子转移位点来阻止电子转移，从而抑制真菌的呼吸作用。靶位点的点突变已被证明可以显著降低几种真菌对抑制 位点电子传递药物的敏感性。由于 参与线粒体的呼吸作用，对稻瘟病菌的生长发育有很大的影响，因此对 表达的早期干预可以抑制稻瘟病菌的生长发育。这将很大程度上抑制稻瘟病菌流行传播的发生。本研究对施用靶向 的 对稻瘟病菌的抑制效果进行了考察，并对接受了 甲基修饰（）和硫代甲氧基修饰（）等 种结构修饰的 的抑制效果进行比较和分析，为稻瘟病的防控提供新的可供选择的思路及技术储备，并为 杀菌剂在田间推广和应用奠定理论基础。材料与方法 植物材料和病原菌培养以水稻品种日本晴为材料，在 恒温箱催芽 ，将已发芽的种子移入土壤中，在 、光 暗培养时间为 的温室中培养。将稻瘟病菌菌株 接种于稻秆培养基（），于 恒温箱中培养。后在平板上将生长的菌丝刮除，然后黑光灯光照培养 ，收集 孢子。设计及合成根据稻瘟病菌 的基因序列，选择 个核苷酸序列设计并合成了小分子（单链的小分子 是小分子 的反义链，双链的小分子 由正义链和反义链共同退火得到），并将合成的小分子 的浓度稀释为 （），以备使用。小分子 引物列于表 中，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。的体外合成选择、和 这 个对稻瘟病菌生长、发育或致病性发挥重要作用的稻瘟病菌基因为靶标基因，选择各个基因序列中特异性最高的区域（约 ）为 体外转录模板序列，根据 （）使用说明合成并纯化。引物设计及载体构建根据 序列，选择上游 片段并设计引物（表）。用引物 和 结合 第 期喻晗晞，等：体外施用小分子 抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果高保真聚合酶（，）从 菌丝中提取的 中扩增 基因（）。扩增产物和载体 经 和 双酶切、琼脂糖凝胶电泳，目标片段回收（）等操作后，将得到的载体和目标序列用 连接酶（）连接，形成，转化到大肠杆菌（）。表 引物及 序列 引物 引物序列 （）目的 载体构建 载体构建 修饰 修饰 修饰 修饰 修饰 修饰 修饰 修饰 注：引物中“”代表对 进行甲氧基修饰；引物中“”代表对 进行硫代甲氧基修饰。下划线为酶切位点。：“”（）；“”（）的诱导表达在含有氨苄青霉素和四环素抗性（，）的 培养基中 、振荡表达 的大肠杆菌。以体积比为 将初步培养菌液加入含有同样氨苄青霉素和四环素抗性的 液体培养基中，以相同条件继续培养 至 值为。加入 溶液继续诱导 。取诱导后的菌液，提取大肠杆菌 的总 后，先用 于 处理，再用 于 处理 。孵育结束后在 的琼脂糖凝胶上进行电泳验证。荧光分析使用荧光标记（）的 检测其是否可以进入稻瘟病菌细胞。在疏水载玻片上滴加 、孢子或菌丝悬浮液（）和 无酶无菌水。载玻片放置在相对湿度大于的透明塑料容器内，在 培养箱中分别避光孵育、和 。用 缓冲液或 微球菌核酸酶（）处理，在倒置荧光显微镜（）观察荧光或捕获图像。处理稻瘟菌孢子根据 的序列合成 的双链小分子（）。在疏水玻片上滴加 孢子悬浮液（）、无酶无菌水和 （）（对照组中 替换为无酶无菌水）。载玻片放置在相对湿度大于 的透明塑料容器内，于 分别避光培养、和 ，在倒置显微镜下观察孢子形态或捕获图像。稻瘟病喷雾接种及 处理配制 与 的 孢子混合悬浮液（明胶终浓度 、），对 叶期水稻植株进行侵染（棵植物喷洒 悬浮液）。以孢子和 处理的样品作为 处理组，以同样体积的无酶无菌水与孢子的混合悬浮液作为对照组。于 侵染箱中避光侵染 ，然后置于 培养箱中继续培养，后取样观察表型，统计病斑面积。数据处理与分析采用 软件进行差异显著性分析，采用 法进行多重比较。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 结果与分析 荧光显微镜观察稻瘟病菌中荧光强度利用电子荧光显微镜观察并分析荧光在稻瘟病菌结构中的标记强度并拍照记录（图）。和 处理 后孢子内并没有观察到荧光，在共孵育 和 后均显示出明显的荧光信号（图），表明 需要 或更长的时间才可以在稻瘟菌的分生孢子内积累到肉眼可以观察到荧光量。菌丝处理 即可吸收，且 和 在进入稻瘟病菌菌丝内的能力没有差异（图）。这些结果证明，和 均能顺利进入稻瘟病菌孢子、芽管和菌丝。图 菌丝和孢子的荧光信号.与 共孵育的孢子；与 共孵育的菌丝。；图 与孢子共孵育.类型：正常芽管和附着胞；类型：无附着胞的正常芽管；类型：附着胞正常而芽管发育受抑制；类型：芽管和附着胞发育均受抑制；处理、和 后稻瘟病菌孢子不同类型数占视野内总数比例。：；：；：；：；，小分子 与稻瘟病菌孢子共孵育为了区分和准确量化抑制效果，将稻瘟病菌孢子萌发分为 种类型：类型，芽管和附着胞正常萌发；类型，芽管正常，未形成附着胞；类型，芽管发育受抑制，附着胞正常；类型，芽管和附着胞均受抑制（图）。从图 可见：萌发 后，未经 处理的对照分生孢子的正常萌发率约为（类型），剩余 第 期喻晗晞，等：体外施用小分子 抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果的孢子萌发均受到不同程度的抑制（不同类型比例分别为：类型，；类型，；类型，）。共孵育 后，处理的样品孢子正常萌发率约为 的（类型），剩余的孢子萌发均受到抑制（不同类型比例分别为：类型，；类型，；类型，）。萌发 后，对照组的大部分孢子发育正常（类型），而 处理的样品中孢子萌发类型分别为：类型，；类型，；类型，；类型，。共孵育 后，对照和 处理中约的孢子正常萌发，表明 不再抑制.生长。本研究结果表明，处理可以显著抑制稻瘟病菌孢子萌发长达 。小分子 结构修饰大多数 对稻瘟孢子萌发和附着胞形成的抑制作用维持在 左右。回收 的检测结果显示，随着时间的延长，的量急剧减少，可能是因为在处理过程中 降解。为了检测结构修饰是否能够增强 的稳定性并增强抑制效果，对 进行了 甲基修饰（）和硫代甲氧基修饰（），分别合成了 和。琼脂糖凝胶电泳结果显示，与 和 相比，持续到 没有明显的降解（图），表明结构修饰保护了 免受 酶的影响。图 结构修饰小分子.琼脂糖凝胶电泳检测小分子；用小分子 处理 后稻瘟病菌孢子生长的分类统计；用小分子 处理 后稻瘟病菌附着胞形成率。不同字母代表显著差异（）。下同。；.；.（）和 处理相比对照组显著抑制了孢子萌发。共孵育 后，对照和 处理中约 的孢子正常萌发，而 和 处理的孢子正常萌发大约。随着时间的推移，抑制作用逐渐下降。共孵育 后，和 处理分别有约 的孢子正常萌发（类型），而在对照组 的孢子发育正常（图）。这表明 的修饰显著增强 的稳定性，同时提高了对分生孢子发育的抑制效果。除孢子萌发外，附着胞形成也是稻瘟病菌致病的另一个关键因素。为检测 对附着胞形成是否有影响，统计了对照组和处理组的附着胞形成率（附着胞正常形成孢子数 总孢子数）。共孵育 后，对照组 附 着 胞 形 成 率 超 过，处 理 附 着 胞 形 成 率 为 ，和处理的附着胞形成率分别为 和。然而，共孵育 后，结构修饰的 对附着胞形成的抑制作用更明显，、和 处理附着胞形成率分别为、（图）。共孵育、和 后，对附着胞形成不再有抑制作用，南 京 农 业 大 学 学 报第 卷而 和 对附着胞形成仍然有抑制作用。上述结果表明，结构修饰通过增强 的稳定性，显著增强了 的抑制作用，且 作用效果更佳，进一步证明 处理抑制稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成。与 抑制效果比较分析为了更好地实现 介导的病害控制，寻找一种经济可行的方法替代合成 的。本研究通过体外转录合成一段 的针对稻瘟病菌 基因的双链长链（）。分别将等摩尔体外转录的 和 与稻瘟孢子共同孵育。结果表明，和对稻瘟孢子萌发和附着胞形成都具有相似的抑制作用（图）。为了筛选其他对孢子萌发和附着胞形成具有抑制作用稻瘟病菌基因位点，选择、和 在生长、发育或致病性中发挥重要作用的稻瘟病菌基因。选择各个基因序列中特异性最高的区域（约 ）为 体外转录模板并合成了。将 或 或无酶无菌水与稻瘟孢子在疏水玻片上培养相应的时间后在显微镜下观察孢子萌发和附着胞形成。共孵育 后，对照组约 的孢子正常萌发（类型），其余 的孢子发育受抑制；处理显著抑制孢子萌发。在 处理的样品中，类型 孢子占、类型 孢子占、类型 孢子占、类型 孢子占。共孵育 后，对照组大部分孢子发育正常（类型），其余 为类型 类型；处理中，类型 占，类型 占，类型 占，类型 占。共孵育 后，处理中，类型 占，类型 占，类型 占，类型 占。在共孵育 和 后，、和 处理对稻瘟病菌孢子萌发没有显著的抑制作用（图）。相反，处理对稻瘟病菌孢子萌发产生了明显的抑制作用。由图 可知：共孵育 后，对照组约的附着胞形态正常，而 处理组约的附着胞形态正常。共孵育 后，对照组约 的附着胞形态正常，而 处理组约 的附着胞形态正常。共孵育 后，对照组约 的附着胞形态正常，而 处理组约 的附着胞形态正常。在共孵育 和 后，、和 处理对稻瘟病菌附着胞形态没有显著的抑制作用。综上所述，处理显著抑制稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成。图 与 的抑制效果.和 处理、和 后的稻瘟病菌孢子生长分类统计；用 分别处理、和 的稻瘟病菌孢子生长的分类统计；用 处理、和 的稻瘟病菌附着胞形成率。.，；.，；.，回收率分析将 模板序列克隆到 载体上并在大肠杆菌 中表达。诱导后提取的总 经过 和 处理去除 和单链，在 的琼脂糖凝胶上电泳检测。用同样的办法诱导产生。结果表明，重组载体经优化的 诱导条件处理后可以产生较为单一的 第 期喻晗晞，等：体外施用小分子 抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果 产物（图），使用 进行灰度分析，生产率超过（表）。图 琼脂糖凝胶电泳检测.含有 和 的 细菌诱导表达（：添加；：不添加）。（：；：）表 细菌诱导 的生产率 基因名称总 浓度（）浓度（）生产率 用（）与稻瘟菌株 孢子悬浮液混合喷雾侵染水稻。病斑面积统计结果显示：与对照相比，处理的叶片病斑数量和面积显著减少，处理无显著变化（图）。与对照组相比，处理对稻瘟病菌致病能力没有影响，但 处理抑制稻瘟病菌致病能力，进一步证明体外施加 可以抑制稻瘟病菌的致病性。图 喷雾接种稻瘟病菌后叶片表型.在喷雾接种稻瘟病菌（孢子浓度）后叶片表型；病斑面积比例。.（）；讨论基于 原理开发的新型农药具有靶标特异性强，对非靶标生物绿色安全，无残留问题，且开发成本正在逐步降低等优点，符合当今社会对于农产品质量安全和生态安全的要求，因此是潜在的新型绿色植保产品。尽管当前使用化学杀菌剂仍然是控制真菌病害的有效方法，新的病害防控技术的增加有利于丰富商品农药品种，降低病原菌对化学药剂的抗性或者耐受性。此外，已证明小 可以在植物与真菌之间的跨界转运，沉默真菌靶基因的表达。因此筛选最优靶基因并探索实际操作具有重要价值。不仅可以在单个生物体的细胞和组织中转移，而且还可以在不同的真核生物中转移。为了进一步确认 能够进入稻瘟病菌细胞内，我们合成了 和，结果表明 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷的 在共孵育 后就进入了稻瘟孢子，确认了 通过 方法使用的可行性。是位于线粒体基因组中的细胞色素 的编码基因。作为一种膜蛋白，细胞色素 是呼吸链中线粒体 复合物（复合物）的核心，因此是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的主要防治靶标基因。由于 在线粒体的呼吸作用中十分重要，它对稻瘟病菌的生长发育有很大的影响，对 的早期干预可以抑制稻瘟病菌的生长发育，所以我们选择 靶标具有极大的科学性。对于实际应用，的稳定性是需要考虑的关键因素。在本试验中，甲基（）和硫代甲氧基（）修饰法可以增加 在体外的稳定性，但是在穿梭及细胞内的效果还没有报道。修饰可以显著提高 分子在体内的稳定性，增强对许多核酸酶降解单链寡核苷酸的耐受能力；修饰可以阻止或降低许多核酸酶降解磷酸二酯键的能力。试验结果显示，处理抑制效果更佳。技术在某些植物上应用显示在植物表面喷洒靶向病原生物基因的 或 可以抑制病原菌的毒性。外源应用的源自西葫芦黄色花叶病毒的致病相关基因的 可以在植物中长距离运输，并保护西瓜、黄瓜和西葫芦免受西葫芦黄色花叶病毒的侵害。由于 参与线粒体的呼吸作用，它对稻瘟病菌的生长发育有很大的影响，对 的早期干预可以抑制稻瘟病菌的生长发育。本研究发现与上述理论一致，外源施小分子 能延缓稻瘟病菌孢子的正常发育，抑制稻瘟病菌对水稻叶片的侵染力，并且 处理组对抑制稻瘟病侵染效果最好。由于本研究没有开展单独用 处理后的抗病相关基因表达的情况，也没有证明是哪条抗病信号途径参与，因此研究结果只能证明可能是由于稻瘟病菌的孢子发育进程受到影响，导致其在与植物互作的过程中丧失了最关键的侵染时期。对于本技术是否能够增强水稻对稻瘟病菌的抵抗力还有待进一步研究。本研究结果为筛选稻瘟病基因提供了理论基础，为通过喷雾诱导的基因沉默提供了新途径，为制定稻瘟病病害的防控策略提供了新方向。综上所述，体外施加靶向 的 能够抑制稻瘟病菌的致病性。细菌表达系统不仅提供了一种经济实用的 制备方法，而且还具有巨大的市场前景。在本试验条件下，的回收率占总 的，证明细菌诱导表达是一种有效的 方法。喷施、注射、缓释等 施用方法更符合大规模应用的场景，因此在将来的研究中我们将进一步寻找提高 稳定性的技术，例如结构修饰、使用 稳定剂，以及使用 酶抑制剂等佐剂。此外，纳米材料的应用也极大促进了 的稳定性和递送效率，也将是今后研究的热点。参考文献：，：穆常青，刘雪，陆庆光，等 枯草芽孢杆菌 菌株对稻瘟病的防治效果及定殖作用 植物保护学报，（）：，（）：（）王亚波，唐前君 水稻稻瘟病的发病症状与防治措施研究进展 湖南农业科学，（）：，（）：（）刘木星，刘昕宇，张海峰，等 稻瘟病菌侵染水稻早期作用机制的研究进展 南京农业大学学报，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，第 期喻晗晞，等：体外施用小分子 抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果 ，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：责任编辑：刘怡辰