微生物的显微计数和大小测量.pdf

微生物学实验三微生物的显微计数和大小测量生02孙禹2010012376微生物的显微计数和大小测量微生物的显微计数和大小测量生命科学学院生 02孙禹2010012376实验日期：2012-3-19同组姓名：张宇成一、实验目的一、实验目的1、了解血球计数板的构造和使用方法，并掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法2、学习用显微测微尺测量酵母细胞的大小，使大家对微生物大小有一种直观的认识3、学习灭菌技术及注意事项二、实验原理二、实验原理1、微生物的显微计数原理本实验利用血球计数板进行微生物计数操作和大小测量工作，其结构示意如下图(图一)图一血球计数板和血细胞计数室血球计数板(如图一，左)是一块比普通载玻片厚得多的玻璃片，其上由四条平行槽构成的三个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，即为此计数板的计数室(如图一，右)。计数室的长宽各为 1mm，中间平台下陷 0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。计数室有两种规格。一种是 1625 型，共有 16 个大格，每个大格又分为 25 个小格。另一种是 2516 型，共有 25 个大格，每个大格又分成 16 个小格。应用血球计数板在显微镜下直接计数微生物细胞的数量，就是先测定若干个方格中的微生物细胞的数量。再换算成每 ml 菌液中微生物细胞数量。2、微生物的大小测定原理微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具测微尺（包括目镜测微尺和镜台测微尺）完成，示意图见图二。目镜测微尺目镜测微尺：它是一块可以放入目镜中的圆形玻片。在玻片中央把 5mm 长度刻成 50 等分，或把10mm 长度刻成 100 等分。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。实验中即可根据目镜测微尺的格数，计算细胞的实际大小。微生物学实验三微生物的显微计数和大小测量生02孙禹2010012376镜台测微尺镜台测微尺：它是目镜测微尺的校正工具。通常的镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 1mm 等分为 100 小格，每格长 0.01 mm(10m)。目镜测微尺和镜台测微尺校正时与游标卡尺的使用类似。镜台测微尺使用时放在载物台上，它指示的也就是视野内物体的真实大小。校正时在视野内使得两尺在某一刻度区域内重合。在已知镜台测微尺每格刻度(10m)后，即可利用公式计算目镜测微尺每格代表的实际长度：格数两重合线间目镜测微尺格数两重合线间镜台测微尺目镜测微尺每格长度10)(=m图二目镜测微尺和镜台测微尺示意图三、实验仪器、材料和用具三、实验仪器、材料和用具实验用具：载玻片、盖玻片、接种环、滴管、镜油、擦镜纸、擦镜液、蒸馏水、酒精灯、打火机、镊子实验仪器：普通光学显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器所用菌种：酿酒酵母四、实验步骤四、实验步骤1 1 1 1、微生物计数、微生物计数稀释稀释：将啤酒酵母在 28，200r/min 恒温培养箱中培养 24h。使用前稀释 20 倍(稀释倍数依培养时间和情况而定，且由助教统一完成)。镜检计数室镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检若有污物，则需清洗后才能进行计数。清洗清洗：若计数室有污物，应先用酒精棉球擦洗，再用擦镜纸轻轻擦拭，干燥使用。上样上样：在清洁干燥的血球计数板上盖上盖玻片。轻轻震荡盛有啤酒酵母菌液使其混合均匀。用滴管吸取菌液，随后轻挤滴头，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，让计数室刚好充满菌液。微生物学实验三微生物的显微计数和大小测量生02孙禹2010012376注意：每次吸液前都要震荡均匀，并且要避免产生气泡。显微镜计数显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜(40)观察。注意调节载物台保持水平后，静置 1 分钟后进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。计数操作计数操作：样品稀释度要求每中格内有 1020 个菌体为宜。计数时，本实验使用1625 规格的计数板，中格排列为 44 形式，因此需要分别对左上、左下、右上、右下以及中间任意中格进行计数。重复操作重复操作：重复 10 次实验过程，取其平均值。计数公式计数公式：本实验使用 2516 血球计数板，并且每次对 5 个中格进行计数，稀释倍数为 20，公式应为：20104008080/4=个小格内酵母细胞数酵母细胞数ml清洗清洗：使用完毕后，马上将血球计数板用洗瓶冲洗，可用棉花擦洗，切勿用硬试管刷洗刷，洗完后用蒸馏水冲洗一遍，斜置自行晾干或用滤纸沾干，最后用擦镜纸揩干净。2 2 2 2、微生物大小测量、微生物大小测量稀释稀释：将啤酒酵母在 28，200r/min 恒温培养箱中培养 24h。使用前稀释 20 倍(稀释倍数依培养时间和情况而定，且由助教统一完成)。校正目镜测微尺校正目镜测微尺：将装有目镜测微尺的目镜装上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，利用镜台移动器使两尺在某一区域内两线完全重合，计数两重合刻度之间两尺的格数。用同样方法换成高倍镜进行校正。由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度：格数两重合线间目镜测微尺格数两重合线间镜台测微尺目镜测微尺每格长度10)(=m测定酵母细胞大小测定酵母细胞大小：点燃酒精灯，用灼烧过的接种环取少量菌液接种在载玻片上，再次灼烧接种环灭菌。盖上盖玻片观察酵母细胞，先用低倍镜，最后换用油镜计数。测量酵母长轴和短轴的长度，最后将测量值换算为实际长度，得出酵母细胞大小。注意随机选取 20 个各种大小菌体，不能只挑大的细胞测量。测定完毕测定完毕：取出目镜测微尺镜头，换上原目镜，再将目镜测微尺和物镜测微尺擦拭干净包好归还。由于实验中使用油镜，影响用擦镜纸将油擦去，再用擦镜液轻轻擦洗油镜。注：本此实验还进行了泡菜的制作、葡萄酒酿制准备以及培养基配制，具体操作将写入相应实验报告中。五、五、实验结果与分析实验结果与分析1 1 1 1、微生物计数、微生物计数结果结果微生物学实验三微生物的显微计数和大小测量生02孙禹2010012376表一微生物计数结果计算过程计算过程：841007.12010400803.107)ml/(=个n2 2 2 2、目镜测微尺校正结果目镜测微尺校正结果表二目镜测微尺校正结果3 3 3 3、酵母细胞大小测量结果、酵母细胞大小测量结果所有计数结果均以目镜测微尺小格计算，列表如下：表三酵母细胞大小测量结果酵母长轴平均值(m)：7.911.20酵母短轴平均值(m)：6.610.88实验次数各格中的菌数总菌数稀释倍数平均值菌数个/ml左上左下右上右下中1481824251613120107.31.071082292658103515833024242114113436142232151195161919151887616171713770719222028998822152724281169193419201911110121210201670物镜倍数（目镜 10）目镜测微尺格数（小格）镜台测微尺格数（小格）目镜测微尺每格长度（m）4070192.711001011.00菌号12345678910目镜测微尺格数（长轴）10.28.98.18.57.09.08.85.58.88.0目镜测微尺格数（短轴）7.57.67.08.06.57.57.95.36.57.0菌号11121314151617181920目镜测微尺格数（长轴）6.16.29.08.58.77.06.05.59.19.2目镜测微尺格数（短轴）5.56.07.26.06.25.05.25.17.18.1微生物学实验三微生物的显微计数和大小测量生02孙禹2010012376六、实验小结与感想六、实验小结与感想本次试验内容并不复杂，主要学习血球计数板和显微测量的相关操作。实验中最先遇到的问题是血球计数板上的格子在显微镜下不容易看清。这就需要调节光强和焦距，并在稍暗的视野中观察。计数过程是相对繁琐的，但如果能够找到方法，按照合理的顺序进行计数，这一操作也会比较顺利。计数过程中发现不同方格内酵母菌数量差异有时可能很大，因此要重复多次实验才能得到较为可靠的结果。而进行酵母细胞大小测量时，最重要的是校正好目镜测微尺。实验中，1000条件下目镜测微尺的 1 小格恰好是 1m，这也使得数据处理相对简单。在数据处理中，一个很重要的问题便是公式的使用。要明确实验中采用的是 2516 血球计数板，而计数时采用对五个中格进行计数的方式。因此应选择正确的公式进行计算，即根据计数平均值、计数格数、总格数以及体积、稀释倍数求出酵母菌液的平均浓度。尽管这一计数方法比较原始，但这一亲自体验的过程中过程不仅锻炼了动手操作的能力，还培养了分析、处理数据的技能与习惯，因此给我留下了很深的印象。最后感谢陈老师从容不迫的讲解以及麻老师、各位助教的指导与帮助。七、七、思考题思考题1、根据你的实验体会，说明血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？答：首先，样品是否均匀混合直接影响计数的误差。如果由于酵母菌液静置后会自然沉降，每次取样前必须充分摇匀，否则会导致样品内酵母菌浓度过低，或者浓度分布不均。另外，由于人工计数的缘故，对一些压线的酵母菌判断有时不一定准确，因此需要保证只数左和上边的压线酵母菌。另外，酵母有出芽现象，要通过判断芽体的大小以估计是否记为新酵母菌。2、显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到测量结果吗？答：理论上只要刻度尺上的刻度准确、操作规范，都不会造成影响。但我认为实际实验中如果刻度非常小，则很容易在校正、读数等操作中造成误差，这些误差可能会间接性地影响测量结果的准确性。3、假设酵母菌是标准的椭球体，根据实验结果，试推算酵母菌培养液中酵母菌的体积含量。答：根据公式，abcV34=估算酵母菌体积，其中 a=b 为半短轴，c 为半长轴。故计算可知：3106261081.121091.721061.614.33434cmabcV=由计数可知培养液中酵母浓度为 c=1.07108个/ml，因此酵母体积含量：0194.0)1007.1()1081.1(810=cVv即没 1ml 培养液中含有酵母菌体积为 0.0194ml，体积含量 1.94%八、参考资料八、参考资料微生物学实验三微生物的显微计数和大小测量生02孙禹2010012376微生物学实验指导，陈金春，陈国强主编，清华大学出版社，2005 年 8 月第一版。