生物技术毕业论文-人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究.doc

生物技术毕业论文-人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究中国药科大学本科生毕业论文（设计）中国药科大学本 科 毕 业 论 文论文题目 人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究 英文题目 Research on Preparation of Human Parathyroid Hormone Fragment Analogue 专 业 生物技术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 姓 名 指导教师 课 题完成场所 中国药科大学酶工程实验室 论文工作时间： 年 月 至 年 月人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究目录摘要1前言2第一章 实验原理31.131.23第二章 试剂与仪器42.1 试剂42.2 仪器4第三章 实验方法53.1 XXXXXXXX53.2 XXXXXX5第四章 实验结果64.1 XXXXX64.2 XXXXXXX64.3 XXXXXXXXX6第五章 讨论参考文献7致谢9人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究摘要：目的 提高人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-Arg11hPTH(1-34)-Pro-Pro的分离纯化效率。方法 通过均匀设计法寻求目的融合蛋白的酸水解条件（温度、时间、蛋白含量，盐酸浓度）；进行二次酸水解。使用核酸蛋白检测仪及紫外可见分光光度计检测210nm，280nm处吸收峰，收集样品峰，对比含量及纯度差异，确定最佳检测波长。结果 酸水解最佳条件没有得到改进；检测波长设在210nm比设在280nm更灵敏、更可靠。结论 二次酸水解可提高水解效率；检测波长设在210nm处可提高分离纯化效率。关键词：人甲状旁腺素，活性片段前体物；骨质疏松；纯化；酸水解；柱层析 Research on preparation of human parathyroidHormone fragment analogueAbstract：Objective To improve the separation and purification rate of human parathyroid hormone fragment analogue Pro-Pro-Arg11hPTH(1-34)-Pro-Pro. Methods To seek the conditions for acid hydrolysis of target fusion protein through uniform design；to carry out acid hydrolysis for a second time. To detect the assimilation peak and the sample collecting peak at 210nm and 280nm with the nucleic acid protein surveymeter and the ultraviolet visible light photometer， and to contrast the differences in contents and purity to make sure the best wavelength. Results No progress was made in seeking the best conditions of acid hydrolysis; Set up the detecting wavelength at 210nm was more sensitive and credible then at 280nm. Conclusions Carrying out acid hydrolysis for a second time can improve the efficiency of hydrolysis; Setting up the detecting wavelength at 210nm can improve the separation and purification rate.Keywords： human parathyroid hormone; active fragment analogue; osteoporosis; purification; hydrochloric acid; column chromatography 前言一、骨质疏松症以及研究开发甲状旁腺激素相关肽的重大意义骨质疏松是一个涉及多学科的公众健康问题。它是指每个单位内骨组织数量减少。分为继发性骨质疏松和原发性骨质疏松，前者最常见有类固醇性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松等，后者主要包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。原发性骨质疏松是以骨质减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。判断骨质疏松症的依据为：骨量减少；骨微结构蜕变；骨的脆性增高、骨力学强度下降、骨折危险性增加，对载荷承受力降低而易于发生微细骨折或完全骨折。造成骨质疏松的原因有：绝经后和老年性骨质疏松；遗传性骨质疏松；内分泌疾患所致骨质疏松；与饮食有关的骨质疏松；药物所致骨质疏松；废用性骨质疏松；其它疾病所致骨质疏松；特发性骨质疏松1。现今骨质疏松症已成为严重威胁老年人身心健康的常见疾病，根据中国老年学学会骨质疏松学会统计，目前骨质疏松症患者人数在我国已达到8千万，已经构成一个严重的公众健康问题。随着人均寿命的延长，老年性骨质疏松症发病率逐年增加。同时骨质疏松症也特别“垂青”女性，在胎儿期，孩子从母体不断地吸收大量钙质，以保障骨骼的正常发育。授乳期，孩子通过母亲的乳汁得到赖以生长的钙。这时期的孕妇或授乳期母亲必须有意识地多摄取一些钙质，才能满足孩子和自身的需求。否则，不足部分便会有母亲的骨组织中溶出。在绝经期，妇女也受到骨质疏松的困扰。对于正常人，性激素对骨组织合成的促进作用和肾上腺皮质激素对骨形成的拮抗作用处于动态平衡。当性激素水平下降，而肾上腺功能并无相应程度降低，结果造成糖皮质激素相对增多，产生类似柯兴氏综合症的表现，使骨吸收大于骨形成。雌激素具有刺激成骨细胞活性促进骨基质合成的作用。雌激素缺乏不仅影响妇女的生活，更可能引发两种由于雌激素缺乏造成的疾患：心血管疾病和骨质疏松。骨质疏松造成妇女在一生中发生髋骨骨折的危险性高于其患乳腺癌、宫颈癌、子宫癌和卵巢癌危险的总和。据调查显示，60岁以上的女性骨质疏松率高达40%，而且随年龄段增加，比例也在上升。因此，抗骨质疏松药物的研制是世界制药工业的一个热点。在目前应用的经典抗骨质疏松药物中，绝大部分为抑制破骨细胞活性的药物，如雌激素、降钙素、双膦酸盐等，但缺乏刺激成骨细胞活性或既刺激成骨又抑制破骨的作用，因而不能使骨组织恢复到正常的强度和密度2。甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是生物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素，由84个氨基酸组成。他是哺乳动物体内重要的钙、磷调节因子3，而PTH的分泌也受到血钙水平的反馈调节。实验表明：PTH（1-27）仍保持有一定体外活性，而PTH（1-26）则完全丧失体内外活性。hPTH(1-34)在体内外保持有完整PTH的几乎全部生物活性4。而合成的牛甲状旁腺素片段（bovine parathyroid hormone fragment(1-34)， bPTH-(1-34)）比天然激素bPTH（1-34）的活性更高。大量的临床研究表明，PTH及其片段的小剂量多次给药具有明显的成骨作用。由于PTH及其相关肽不但能防止骨裂解，而且能促进骨生长，对疏松骨具有恢复作用，因此被认为是治疗骨质疏松症的第二代首选药物。二、PTH的生物合成过程及作用机制人甲状旁腺激素是由甲状旁腺分泌的84个氨基酸组成的多肽，最初的转译产物是前甲状旁腺激素原（ProhPTH），由115个氨基酸残基构成，在分泌过程中首先在粗面内质网膜周质腔被信号肽切除端25个氨基酸的信号肽部分成为甲状旁腺激素原（prohPTH），然后在高尔基体中切掉6个氨基酸的前体部分成为84肽成熟激素。而84肽在体内可降解成端（1-34）肽等活性片段1。在哺乳动物中，PTH主要生理作用是维持血钙平衡，PTH的合成和分泌很大程度上受到甲状旁腺敏感受体介导的胞外钙浓度的调节：低血钙时，PTH分泌到血循环系统，结合于肾和骨靶细胞上的型PTH受体（PTH1R，此受体被PTH及PTHrP共同分享），通过对靶细胞直接或间接的作用帮助血钙维持在一定范围。而血钙升高又抑制其分泌，但无论血钙浓度多高，均不能完全抑制其分泌。在肾脏中，PTH直接刺激肾近区小管对钙的重吸收以及刺激1-羟化酶的活性，增加肠内1，25二羟基维生素D3介导的钙吸收；在骨骼中，PTH能诱导钙从基质中快速释放，增加破骨细胞的数目及活力，促进骨吸收，同时增加成骨细胞的数目，促进成骨细胞释放骨生长因子加速骨形成。另外，PTH还可能通过抑制肾近区小管和远区小管对磷的重吸收十血磷浓度维持在正常范围。三、PTH结构与生理功能的关系1978年Keutmann等报道了人PTH的一级结构。认为hPTH是由84个氨基酸残基组成的一条多肽链分子，分子中不含半胱氨酸，故分子中不含二硫键6。Tregear等用实验证明PTH发挥钙磷调节作用仅需氨基端1-34个氨基酸残基7。园二色谱研究结果表明在水溶液中PTH分子是伸展的无固定的高级结构。而且不论是整个分子还是氨基片段都显示了一些pH依赖性，即随pH的变化观察到的结构也有所不同，肽链中增加了少量的二级结构。荧光研究也显示了相似的结果8。利用1H-NMR人们发现在第20-24氨基酸残基的地方有少量的规则结构，但在水溶液中仍难以观察到PTH的二级或三级结构。进一步用NMR研究表明，hPTH1-34在Ser3到Gly12及Ser17到Lys26两处有一螺旋结构。着两个结构紧密的区域由一段无规卷曲或螺旋结构相连19。由于PTH缺乏二硫键，因此在水溶液中无典型的结构。只有在非记性类膜环境中才能形成二级或三级结构，大部分多肽均形成两性螺旋结构，这样的螺旋结构在与受体结合时发挥重要作用。研究发现，人甲状旁腺素N端-螺旋和C端-螺旋被结构随环境而改变的连接区相连。N端-螺旋的N末端及C端-螺旋的C末端为柔性区。N端是负责生理活性的片段，C端是负责受体结合的片段。将N末端的NH3+置于受体的信号传导部位是hPTH（1-34）发挥生理活性所绝对必要的，N末端三肽一定的柔性以及连接区的柔性也许可协助将N末端的NH3+引入受体中正确的部位这一相配过程。此外，hPTH（1-34）的Ser1，Gly12，Lys13，Arg20等氨基酸在hPTH（1-34）发挥生理活性时起着更特殊的作用4。四、上市情况：重组人甲状旁腺激素作为主要应用于低血钙导致的骨质疏松症治疗药物10，11，目前成为国内外研究开发热点之一。在国外，2002年美国食品与药物管理局批准使用重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症。这类药物被称为骨合成药。美国Allelix公司的重组hPTH（1-84）已进入期临床，美国Lilly公司的重组hPTH（1-34）（商品名Forteo）已完成临床试验并已于2002年11月获FDA批准上市；美国NPS医药公司的rhPTH（1-34），商品名PREOS（原加拿大Allelix公司的Alix-11）于2003年9月完成期临床研究；加拿大ZelosOstabolin-C(TM)，鼻腔喷雾制剂已完成期临床研究。目前，国内已有多个厂家及科研机构从事重组rh-PTH（1-34）产品的研究和开发工作，由于大1量化学合成PTH有困难，PTH及其类似物的基因工程生产成为研究主要方向。第一章 实验原理1.1 表达菌体来源本实验室已成功构建表达菌体。此菌体以大肠杆菌BL-21为宿主菌，pET-28a为表达载体，天门冬酰酶切除信号肽的C末端片段为融合伙伴，在融合伙伴和目的肽结合处引入-Asp-Pro-酸敏感位点及二肽酶IV识别的C端和N端Pro-Pro-位点，并突变11位的亮氨酸为精氨酸。后经乳糖诱导T7启动子高效表达。表达的核苷酸酸序列为：(共38个)Cca ccg tcc gtt tcc gaa atc caa ctg atg cat aat cgt ggt aaa cat ctg aac tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aag aaa ctg cag gat gta cat aac ttc ccg ccg可编码具有下术序列所示的蛋白质：Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met 10His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met 20Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 30Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro 381.2 均匀设计法的选择在酸水解过程中，温度，水解时间，所用盐酸浓度以及蛋白质含量多少对酸水解得率都有着不同程度的影响。王春晓在两种新型人甲状旁腺素活性片段类似物研究中使用均匀设计法对重组人甲状旁腺素类似物Pro-Pro-hPTH(1-34)进行了影响因素的研究。断定48、30h，50mmol/L，5%状态下为最佳酸水解条件。均匀设计法区别于正交实验设计法的主要特点是：实验次数少，每个因素每个水平只做一次试验；试验结果数据利用电子计算机处理，方便、快速、准确，可以定量地确定各因素对实验结果的影响，定量地预报优化条件及优化结果的区间估计。在本实验中，使用此法对目的小肽Pro-Pro-Arg11hPTH(1-34)-Pro-Pro的最佳酸水解条件进行确定。1.3 检测波长的选择 在倪国华的凝胶过滤分离鸡肉蛋白酶解物时紫外检测波长的选择12一文中，叙述了在小肽的分子结构中能产生紫外吸收的实际上只有肽键和氨基酸的侧链基团。当肽键在200-300nm波长范围内的吸收峰已经确定的条件下，分析不同氨基酸的侧链结构在200-300nm范围内的吸收情况，分析结果表明：在小肽的分子结构中，200-220nm处的吸收峰主要是由肽键产生的，270-290nm范围内的吸收主要是由芳香氨基酸侧链的大键产生的.当洗脱液在200-220nm无吸收时，检测波长设在200nm-220nm比设在250nm-300nm更灵敏、更可靠。第二章 试剂与仪器2.1 试剂2.1.1 试剂来源抗生素 硫酸卡那霉素（Kan） AMRESCo分装小肽电泳用试剂丙烯酰胺 Sigma公司甲叉双丙烯酰胺 Sigma公司Tricine AMRESCo公司甘油 （Glycerol） 南京化学试剂有限公司 拷马斯亮蓝R-250 Fluka公司过硫酸铵 上海前进试剂厂四甲基乙二胺 上海前进试剂厂三（羟甲基）胺基甲烷（Tris） Genebase Gene-Tech Co.Ltd十二烷基硫酸钠（SDS） Genebase Gene-Tech Co.Ltd-巯基乙醇 SERVA公司发酵用试剂乳糖 北京益理精细化学有限公司泡敌 上海华联制药酸水解及分离纯化用试剂浓盐酸 南京化学试剂有限公司氢氧化钠 南京化学试剂有限公司氨水 南京化学试剂有限公司CM52离子纤维素树脂 Whatman 公司（No.4037050）Sephadex G-25 Pharmacia公司醋酸铵 南京化学试剂有限公司冰醋酸 南京化学试剂有限公司2.1.2 培养基LB培养基Trypton 上海生工生物工程有限公司Yeast extractOXOIDNaCl 南京化学试剂有限公司Agar Genebase Gene-Tech Co.Ltd玉米浆培养基牛肉浸膏 上海化学试剂厂玉米浆 常州生化厂味精（谷氨酸钠含量99%） 河南莲花味精股份有限公司 2.1.3 培养基配方LB培养基Yeast extract 0.5%(OXOID)，Tryptone 1.0%(OXOID)和NaCl 1%，加蒸馏水配制，高压灭菌，加卡那霉素（50g/ml）备用。玉米浆培养基玉米浆 25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L，高压灭菌后，加卡那霉素使用。2.1.4 缓冲液&溶液小肽电泳：阳极缓冲液：Tris 0.2M，pH8.9阴极缓冲液：Tris 0.1M，Tricine 0.1M，SDS 0.1%染色液：R-250(w/v) 0.25%，乙醇:乙酸:水（45:10:45）脱色液：乙醇:乙酸:水（40:4:56） SDS-PAGE凝胶电泳1*Tris-Gly电极缓冲液：Tris 25mM，Glycine 250 mM，SDS 0.1%考马斯亮蓝染色液：甲醇:水:冰乙酸（45:45:10），溶液中含0.25%（w/v）考马斯亮蓝R-250考马斯亮蓝脱色液：甲醇:水:冰乙酸（45:45:10）2*SDS-PAGE加样缓冲液：Tris-HCl(pH6.8) 100mmol/L-巯基乙醇 10%SDS 4%菌体裂解缓冲液：Lysozyme(溶菌酶) 0.02%Triton X-100 0.5%(v/v)Tris-HCl pH8.07 50mmol/L包涵体洗涤液： Triton X-100 0.2%Tris-HCl pH8.07 50mmol/L包涵体裂解缓冲液：尿素 4mol/LTris-HCl(pH8.0) 100mmol/L2.2 仪器1. GL20A全自动高速冷冻离心机 湘西仪器仪表总厂机械仪器厂2. TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造3. 立式万用电炉 上海圣欣科学仪器有限公司4. 马头牌架盘药物天平 上海医疗器械八厂5. HL-1B数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂6. 磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司7. TH-500梯度混合器 上海沪西分析仪器厂 8. HDJ-2B核酸蛋白检测仪 南京大学9. HD-A电脑采集器 南京大学10. D-1型自动蒸汽灭菌锅 北京发恩科贸有限公司11. GKC R112可控硅控温水浴锅 上海跃进医疗器械厂12. Galanz WP750中型机械微波炉 13. SW-CJ-1B标准净化工作台 苏州净化设备厂14. 电子天平 上海精密科学仪器有限公司15. TY-80S脱色摇床 南京大学16. DY602V稳流稳压电泳仪 南京大学生物化学系17. 752紫外光栅分光光度仪 上海第三分析仪器厂18. BS-100A自动部分收集器 上海市沪西仪器厂19. BIOSTAT C20-3型自动发酵罐 B.Braun Biotech International，Germany 第三章 实验方法3.1 发酵与表达3.1.1 培养基的选择 将菌体置于LB培养基中培养，在0h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h检测OD600及pH变化。 将同批次菌体置于玉米浆培养基中培养，在0h，1h，2h，3h，4h，5h，6.5h，7h，8h，9h，10h检测其OD600及pH变化。3.1.2 玉米浆中乳糖诱导表达量的确定 按4.1.1中流程处理发酵，加入乳糖后，分别在 0h，1h，2h，3h，4h， 4.5h，5h，6h， 6.5h，7h取样，SDS-PAGE电泳后扫描胶体，分析，确定表达量。3.1.3 菌体发酵诱导前生长时间的确定 在发酵罐中培养菌体，在0h，1h，2h，2.75h，3h，3.33h，3.5h取样，测定OD600值，描绘曲线，确定最佳生长时间。4.1.4 菌体诱导最佳时间的确定 在发酵罐中，加入乳糖后，分别诱导0h，1h，2h，3h，4h， 4.5h，5h，6h，6.5h后取样，测定OD600值，描绘曲线，确定最佳诱导时间。 3.2 分离纯化3.2.1 细菌的裂解发酵后，8000rpm离心5min收集菌体。将离心收集得到的菌体按4ml/g加入菌体裂解缓冲液中混匀，37摇床中过夜直至溶液不粘，12000rpm离心20min去上清。加等体积包涵体洗涤缓冲液混匀，室温下搅拌洗涤2-3小时，12000rpm离心20min去上清。3.2.2 包涵体的分离和溶解 用等体积蒸馏水室温下搅拌洗涤上面的沉淀一次，溶液混匀后，12000rpm离心20min去上清。再用等体积2M尿素同样洗涤一次，得包涵体。每克包涵体按照8ml/g加入包涵体裂解缓冲液混匀，室温下连续震荡20h至包涵体溶解，12000rpm离心20min，收集上清。3.2.3 乙醇分级沉淀粗提物用0.68V预冷乙醇边搅拌边缓慢加入包涵体裂解液中沉淀杂蛋白，-20静置20min后，12000rpm离心20min收集上清，同样再用终体积为3.5V乙醇沉淀其中的融合蛋白。3.2.4 融合蛋白的酸水解3.2.4.1 考察是否可以进行二次酸水解 用50mMHCl溶解融合蛋白（含量为5%）后，48下水浴下水解30h。将水解产物调至融合伙伴的等电点pH=4.86处，离心，去沉淀。对沉淀进行电泳分析，考察沉淀的总量及其中存在的目的小肽的含量，进行分析，决定是否有进行二次酸水解的必要。3.2.4.2 酸水解条件的摸索方法按均匀设计对酸水解条件进行考察。按下述因素安排表设置条件进行酸水解，不同时间采样，采用均匀设计软件进行分析。同时，比较水解时间，水解温度，盐酸浓度以及蛋白浓度的不同组合所产生的水解效果。GroupFactorTime，hrTemp，HCl，mMFusionpro.Percentage120435510.5225531008.533063406.543538854.554048252.564558700.57506811512.5制胶方法：a. 制分离胶Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.) 1.5mLTris-Cl(8.45) 1.5mLddH2O 0.9mLGlycerol 0.6mL10%AP 10LTEMED 7Lb. 制间隙胶 Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.) 0.3mL Tris-Cl(8.45) 0.5mL ddH2O 0.7mL10%AP 10LTEMED 4Lc. 制浓缩胶 Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.) 0.2mL Tris-Cl(8.45) 0.62mL ddH2O 1.68mL10%AP 10LTEMED 4Ld. 上样将各组条件下的样品溶于上样缓冲液中，根据浓度不同在各个样孔加入不同的量。e. 电泳阳极液为0.2M Tris.HCl(8.9)，阴极液为0.1M Tricine(pH8.25)，0.1%SDS.110V恒压电泳。3.2.5 CM52层析柱 将水解产物调节至等电点离心除沉淀后，将上清再调节至与洗脱液基本一致的pH值，透析或稀释至原水解液体积的十倍左右，流动上样于用0.09M乙酸铵平衡好的CM52离子交换柱，将0.09M乙酸铵（500mL）对0.28M乙酸铵（500mL）进行梯度洗脱，收集样品峰。之前，实验室一般采用核酸蛋白检测仪在280nm检测波长处检测并收集样品峰。现探索是否能使用210nm处作为检测波长。 检测波长先选在280nm处， 将处理好的上清液进行离子交换，用核酸蛋白检测仪检测，并收集样品峰。再将检测波长选在210nm处，将收集的样品进行离子交换处理，用BS-100A自动部分收集器收集，再用紫外可见分光光度仪对每管进行吸光度检测，绘制出210nm吸光度图谱。对两波长下收集的样品峰的总量和纯度进行比较。确定最佳检测波长。3.2.6 透析用蒸馏水进行，约3-4次，历时两天左右。3.2.7 浓缩、除菌、过滤。3.2.8 制半成品原液浓缩到小肽含量为1mg/ml后，加入稳定剂，除菌过滤后得半成品。3.2.9 冻干，纯度检测成品-20保存。第四章 实验结果4.1 表达与发酵4.1.1 培养基的选择结果Fig 1 Fig 2Fig 3时间，hpH0pH6.4-6.71pH6.4-6.72pH6.4-6.73pH6.4-6.74pH6.4-6.75pH6.4-6.76.5pH6.4-6.77pH6.4-6.78pH6.4-6.79pH6.4-6.710pH6.4-6.7table 2 pH-time under using corn liquid 从诱导时间上看，在Fig 1中可以看出，菌体在LB中生长很好，OD600值迅速冲上0.5-0.6这个最佳诱导范围。在Fig 3中可以看出，菌体在玉米浆中生长，3小时就可处在OD6000.5-0.6诱导范围；从价格上看，LB培养基价格较贵，玉米浆较便宜；从pH值方面考虑，比较Fig 2 和table 1可以看出，菌体在LB中pH主要在6.9-7.7之间变化，菌体在玉米浆中pH主要在6.4-6.7之间变化，菌体在玉米浆中pH环境更稳定，更适合发酵过程中pH的控制。综合考虑，可采用如下流程处理发酵过程：配制LB培养基加入1卡那和1.5菌液37培养过夜 净化台操作倒入 配制玉米浆培养基-加入0.5卡那与其他未加入菌液的玉米浆培养基共同加入到自动发酵罐中发酵预处理发酵收菌。4.1.2玉米浆中乳糖诱导表达量的确定 0 1 2 3 4 4.5 5 6 6.5 7 （h）Fig4. SDS-PAGE analysis of the AnsB-C-hPTH（1-34）fusion protein stained with Coomassie Blue under reducing condition.Samples of total cell protein were prepared by dissloving cells in Laemimli sample buffer and boiling in the presence of -mercaptoethanol for 5 min，and analyzed on a 15% gel.lane 1，total cell protein of BL21，con