渗透压对黑曲霉菌丝形态和葡萄糖氧化酶活力的影响_任文强.pdf

食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES462023 Vol.49 No.5(Total 473)DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 034054引用格式:任文强，张镇松，李春震，等 渗透压对黑曲霉菌丝形态和葡萄糖氧化酶活力的影响 J 食品与发酵工业，2023，49(5):46 52 EN Wenqiang，ZHANG Zhensong，LI Chunzhen，et al Effect of osmotic pressure on filament morphology and glu-cose oxidase activity of Aspergillus niger J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):46 52渗透压对黑曲霉菌丝形态和葡萄糖氧化酶活力的影响任文强1，张镇松1，李春震2，李洁1，李红华1*1(中国科学院 生态环境研究中心，北京，100085)2(北京化工大学 生命科学与技术学院，北京，100029)摘要发酵培养基渗透压对黑曲霉菌丝生长形态和葡萄糖氧化酶活力产生巨大的影响。平板培养的图像表明，随着渗透压的增长，菌丝体形态呈现出了从菌丝缠绕的颗粒球状向发散菌丝团状的转变。通过吖啶橙荧光染色和光学显微镜观察的结果，确定了核糖核酸丰富的蛋白活性区域分布在丝状形态中和颗粒球团的外层上。对比了底物中添加葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、聚乙二醇和氯化钠所产生的渗透压对葡萄糖氧化酶活力的影响。在 200 g/L 葡萄糖培养基中产生的渗透压为 900 71 mOsmol/(kgH2O)，可以获得最高的葡萄糖氧化酶活力(11 23 U/mL)。渗透压影响的评估结果，为黑曲霉产葡萄糖氧化酶发酵工艺的优化提供了理论依据。关键词黑曲霉;渗透压;菌丝形态;葡萄糖氧化酶;生物量第一作者:硕士，工程师(李红华高级工程师为通信作者，E-mail:lhh rcees ac cn)基金项目:中国科学院技术支撑人才项目(2021)收稿日期:2022-10-21，改回日期:2022-11-23葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，EC 1134 GOD)是一种二聚体的蛋白酶，可以高度专一地催化-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸，同时生成过氧化氢 1 2。GOD最早在黑曲霉的无细胞培养液中被发现，并由MULLE 进行了报道3。在随后的研究中，多种微生物培养液都检测到 GOD，并且以曲霉属和青霉属为主，近年来基因工程技术的发展，也有助于高产GOD 菌株的培育4。20 世纪 70 年代，我国成立研究协作组，对 GOD 开展系统深入研究，内容涉及到菌种选育、发酵工艺优化、酶的分离纯化以及特性研究等5。GOD 在食品工业、畜禽养殖业和医药行业中有着广泛的应用6。多种动物、植物、昆虫、红藻和微生物的体内都有GOD 存在，而微生物(黑曲霉属和青霉菌属)具有生长繁殖快、成本低等优势，常被用作 GOD 发酵生产的主要菌种7。黑曲霉(Aspergillus niger)满足美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)在食品工业中的安全性要求5，并且我国农业部在 2013 年 12 月发布的饲料添加剂品种目录(2013)中，明确了饲料中的 GOD 可以使用青霉和黑曲霉进行工业生产8。在过去的几十年里，黑曲霉常被用于制酱、酿酒、制醋、抗生素、生产酶制剂和有机酸等有价值的生化产品的生产中9。黑曲霉丝状真菌是一种形态复杂的微生物，在整个生命周期中会表现出不同的生长形式:高度游离的菌丝、菌丝缠绕紧密的颗粒球和菌丝发散的菌丝团10。不同的菌丝形态有利于不同发酵产物的积累，如菌丝颗粒球形态适宜生产糖化酶，发散菌丝团适于生产柠檬酸11。除了菌体自身的特性之外，许多环境因素也会影响真菌的形态，比如孢子接种量和pH 的调整，会影响菌体的群体效应，有效控制黑曲霉的生长特征12;溶氧系数和搅拌条件的改变，可以控制菌丝球的结构，增加发酵效率13。这些培养条件的调整都会间接导致渗透压的改变，但是直接研究外部渗透压对真菌菌丝形态影响的报道还很少。因此，本文深入研究了培养基中不同种类的底物所产生的渗透压对菌丝体形态的影响，通过光学显微镜的图像分析，得到了渗透压和丝状真菌形态之间的关系，采用分光光度法测定了不同渗透压下葡萄糖氧化酶的活力。1材料与方法1 1菌株黑曲霉(Aspergillus niger)FF11-01，为实验室保藏菌种。1 2培养基成分与试剂合成培养基组成(g/L):葡萄糖 25，KCl 0.2，KH2PO40.15，MgSO4 7H2O 0.24，(NH4)2HPO40.6，酵母膏 3.0，蛋白胨 4.0，琼脂 20。吖啶橙染色研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)47剂、邻联茴香胺、辣根过氧化物酶、GOD 标准品，Sig-ma 公司。磷酸钠缓冲液、葡萄糖、盐酸(均为分析纯)，国药集团。1 3主要仪器设备SW-CJ 标准洁净工作台，苏净集团安泰空气技术有限公司;STY-1A 型渗透压测定仪，天大天发科技有限公司;SW-CJ-1F 回转式恒温调速摇瓶柜，上海欣蕊自动化设备有限公司;501 型恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司;7200 型分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司;DM-500 型光学显微镜，徕卡显微系统(上海)贸易有限公司。1 4发酵培养使用合成培养基在 30 下培养 72 h，以保证孢子悬浮液浓度达到 107孢子/mL。活化后的黑曲霉孢子液转移至盛有 100 mL 底液的 500 mL 三角瓶中继续培养，接种量 5%(体积分数)，温度 30，摇床转速 220 r/min，培养时间 48 h。菌体外部渗透压通过渗透压测定仪测定，并采用生理盐水作为对照组。1 5酶活力测定方法根据葡萄糖氧化酶的催化反应机制，酶活力的测定主要有以下 3 种方法:电化学法14、滴定法15 和分光光度法16。分光光度法样品处理简便，反应时间短，满足快速实验的要求，是目前最普遍使用的酶活力测定方法。利用邻联茴香胺作为显色供体，待测样品的吸光值可以反映 GOD 酶活力的大小，且该方法得到了众多科研工作者的认可16 18。1 单位量的 GOD 指的是在 25、pH 6 0 条件下每分钟氧化 1 mol 葡萄糖需要的酶量。反应液的体积为 300 L，其中包括 20 mmol/L 磷酸钠缓冲液(pH 6 0)、0 7 mmol/L 邻联茴香胺、100 mmol/L D-葡萄糖、20 g/L 辣根过氧化物酶和 20 L 待测样品。微体系在 25 下反应 10 min，用等体积的4 mol/L 盐酸溶液停止反应。反应结束后的上清液测定波长 540 nm 的吸光值，根据标准曲线换算得到葡萄糖氧化酶的活力16。1 6吖啶橙染色和菌丝形态观察将待测样品与96%的乙醇混合，80 条件下，混合液在显微镜的载玻片上固定 1 h，再用吖啶橙溶液染色19，蒸馏水清洗多余的染色剂，并在室温下干燥。使用 DM-500 型光学显微镜观察黑曲霉的菌丝形态，经吖啶橙染色后，核糖核酸(NA)丰富区和贫乏区，分别会表现出橘黄色和绿色20。2结果与讨论2 1渗透压对黑曲霉生长形态的影响能源物质在微生物发酵培养过程中起到了至关重要的作用，选取葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作为碳源21，NaCl 为对照，探讨了渗透压对黑曲霉生长形态的影响。以质量分数 0 9%的生理盐水模拟菌体内环境，产生的渗透压值 OS为 287 28 mOsmol/(kgH2O)。由于基质组分、温度等因素，渗透压测定值会出现一定范围内的波动，较难推算出准确的碳源浓度，因此以葡萄糖梯度增长的浓度值作为参考，对不同底物的渗透压(OT)进行了测定，结果见表 1。可以发现，对于每一种底物而言，渗透压与浓度都会呈现出明显的正相关性，并且同一浓度不同底物会表现出差异性的结果。因此，液体培养基的渗透压可以通过添加不同种类和剂量的底物来控制。表 1不同培养基底物引起的渗透压变化Table 1Osmotic pressures by different compounds in substrate底物质量浓度/(gL1)渗透压/mOsmol(kgH2O)1OT/OS底物质量浓度/(gL1)渗透压/mOsmol(kgH2O)1OT/OS葡萄糖20 0135 020471000483 051682000900 7131330001 333 284 6440001 874 0365250002 186 02761聚乙二醇20033932118500392021368004283314910005233418220008587229930001 26004439果糖20 0205 7407220001 281 7244650002 578 89898甘油200344711207008652030120002 48668866蔗糖20 0130 330452000930 3432450002 978 721037氯化钠18090633164501 664695809002 986031040食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES482023 Vol.49 No.5(Total 473)参考表1 中的渗透压，以葡萄糖作为底物碳源，黑曲霉生长过程中菌体呈现出了图 1-a 1-f 的多种形态。当培养基渗透压为 900 71 mOsmol/(kgH2O)时，黑曲霉菌丝团开始逐渐形成，继续增大渗透压菌丝会出现明显的扩散现象。此外，其他 5 种底物的培养过程呈现出了图 1-g x 的多种形态，可以发现无论在哪种底物实验中，黑曲霉在低浓度的剂量下都会呈现出菌丝缠绕的颗粒球状的生长形态，而随着浓度的增加，会向着发散的菌丝团状转变。除聚乙二醇(PEG)外，其他 5 种底物渗透压大于 2 000 mOsmol/(kgH2O)时，菌落数量明显下降，出现了畸形生长甚至死亡的现象。在 90 g/L NaCl 的平板培养基中(图 1-x)，未发现存活的菌株，而同样高渗透压(OT/OS=10 40)条件下，500 g/L 蔗糖平板中(图 1-l)，却有少量的丝状菌体生长，这可能是因为蔗糖可以作为碳源用于黑曲霉的生长，而 NaCl 却不能作为能源物质。这些结果说明黑曲霉在低渗透压和高渗透压下，会表现出菌丝缠绕的颗粒球状和发散的菌丝团状的形态差异，可能也会进一步影响到菌体的新陈代谢途径22，导致葡萄糖氧化酶活力的改变。a 20 g/L 葡萄糖;b 100 g/L 葡萄糖;c 200 g/L 葡萄糖;d 300 g/L 葡萄糖;e 400 g/L 葡萄糖;f 500 g/L 葡萄糖;g 20 g/L 果糖;h 200 g/L 果糖;i 500 g/L 果糖;j 20 g/L 蔗糖;k 200 g/L 蔗糖;l 500 g/L 蔗糖;m 20 g/L PEG;n 50 g/L PEG;o 80 g/L PEG;p 100 g/L PEG;q 200 g/L PEG;r 300 g/L PEG;s 20 g/L 甘油;t 70 g/L 甘油;u 200 g/L 甘油;v 18 g/L NaCl;w 45 g/l NaCl;x 90 g/L NaCl图 1渗透压变化对黑曲霉形态的影响Fig 1Effects of osmotic pressure changes on the morphology of Aspergillus niger2 2吖啶橙染色确定活性区域的分布吖啶橙染色剂与单链的 NA 和双链的 DNA 相互作用时，会发出橘黄色和绿色的荧光。GOD 等活性蛋白质主要由单链 NA 的翻译合成，而吖啶橙可以鉴别出真菌微生物 NA 的丰富区和贫乏区，因此可以确定出活性蛋白的分布区域。选取浓度 20 和 500 g/L 葡萄糖培养的黑曲霉菌体，经过吖啶橙染色可以明确区分菌体中的 NA 丰富区(橘黄色)和 NA 贫乏区(绿色)20。图 2 和图 3 分别展示了低渗透压作用下菌丝缠绕的颗粒球状和高渗透压作用下发散菌丝团状的染色结果。低渗透压作用下黄色荧光区域集中在球团的外部边缘，表明丝状区域主要用来分泌 GOD 等活性蛋白，而球心绿色区域证实了菌体繁殖产生大量 DNA 的分布。高渗透压作用下菌丝团发散体积明显膨胀，虽然活性区域仍然出现在丝状的表面，但是贫乏区却没有明显显示效果。此外，溶解在培养基中游离的菌丝体上(图 3-d)没有明显的 NA 丰富区和贫乏区的界限。由此可见，菌株形态的不同将会导致活性蛋白分布区域的不同，菌丝球芯越小，菌体的活性体积就越大。2 3葡萄糖调控渗透压对菌体形态参数和 GOD 活力的影响葡萄糖是黑曲霉培养的最佳碳源5，但是适宜的添加浓度以及相应的渗透压需要进一步验证。表 2 总结了不同浓度葡萄糖控制的渗透压导致菌体形态变化的参数。随着渗透压的增大，微球的直径减小，相应边缘部位的菌丝长度增加。同时，菌丝体微研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)49a 40，颗粒球状;b 100，颗粒球外层;c 200，颗粒球外层;d 200，颗粒球核心图 2在低渗透压下生长的颗粒球状形态活性区域检测Fig 2Morphologically active regions of pellets grown ofA niger under low osmotic pressurea 40，发散菌丝团状;b 100，丝状外层;c 200，丝状外层;d 200，培养基中游离菌丝图 3在高渗透压下生长的菌丝团状形态活性区域检测Fig 3Morphologically active regions of filamentous massgrown of A niger under high osmotic pressure表 2葡萄糖培养基控制的菌丝球团参数Table 2Summary of the key parameters of A niger pellets obtained by different glucose concentration in substrate(葡萄糖)/(gL1)球团数目/(L1)球团直径/mm球团边缘菌丝长度/mm总表面积/(mm2L1)总体积/(mm3L1)比表面积2043 733200549 29067183 0968930010046 9331 80477 48096143 2442933320052 8001 402424 42752113 18067375300100 00014061 256 00000418 66667300400476 00006114 319 509601 223 86105353500544 00005124 936 582401 398 69835353球的数量也有明显的增长。总表面积和总体积均呈现出了先下降后上升的趋势，最低点出现在了渗透压值 OT/OS=3 13(质量浓度为 200 g/L)的实验组中，而值得注意的是，比表面积最大值也出现在该组实验中。结合本文之前得到渗透压变化影响细胞形态的结论，可以进一步确认，渗透压的增大会引起黑曲霉菌丝体生长形貌由大球团状向发散网状的转变。图4 展示了与表2 相应梯度的葡萄糖浓度(相应的渗透压值列举在表 1 中)对黑曲霉生物量和 GOD活力的影响。经过 48 h 的发酵培养，最低的 GOD 活力3 82 U/mL 出现在渗透压值 OT/OS=0 47 实验组中，这可能是由于较低含量的葡萄糖不能为菌体生长和代谢提供充足的营养造成的。在渗透压值 OT/OS为 3 13 和 4 64 的实验组中，得到较高的 GOD 活力1123 和1101 U/mL，菌体生物量为432 和447 g/L，两组实验的结果无明显差异，为节约生产工艺的成本，选取 200 g/L 葡萄糖实验组数据作为后续实验的参考依据。当渗透压值超过 OT/OS=4.64 时，菌丝体的生物量和 GOD 活力均呈现出明显下降的趋势。因此，葡萄糖不仅可以作为 GOD 基因转录的主要诱导剂，而且可以通过改变菌体形态来决定 GOD 的活力23。图4不同渗透压葡萄糖培养基的 GOD 活力和菌体生物量Fig 4GOD activity and cell concentration of Aniger under different osmotic pressures regulatedby glucose concentration in initial substrate2 4渗透压对 GOD 活力影响采用 2 种方法评估了渗透压对 GOD 活力的影响，即不同浓度底物相似渗透压实验和相同浓度底物不同渗透压实验。食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES502023 Vol.49 No.5(Total 473)首先，确保渗透压的一致性，以 200 g/L 葡萄糖产生的渗透压 900 71 mOsmol/(kgH2O)为参考依据，底物中葡萄糖被果糖、蔗糖、甘油、PEG 和 NaCl 替代后，5 种替换底物的质量浓度依次为 100 0、200 0、70 0、200 0 和 18 0 g/L，相应的渗透压变化范围在850 950 mOsmol/(kgH2O)。通过分光光度法测定的 GOD 活力见图 5，果糖、蔗糖和甘油作为底物得到的 GOD 活力分别为 10 32、9 14 和 10 21 U/mL，与葡萄糖为底物的 GOD 活力最高值 11 23 U/mL 相比，大约下降了 10%20%，下降趋势并不明显，这也进一步说明了发酵液渗透压对菌丝体形态的影响是决定 GOD 活力的关键因素。然而，在 PEG 和 NaCl为底物的实验中，GOD 活力显著下降，仅为 3 29 和0 48 U/mL，与葡萄糖为底物的 GOD 活力相比，分别下降了 70 70%和 95 73%。这可能是因为 PEG 和NaCl 对黑曲霉的代谢起到了严重的抑制作用24，这也与本文前面描述的菌体不能在高浓度 NaCl 培养基上生存相一致。图 5不同底物相似渗透压培养的 GOD 活力Fig 5GOD activity by A niger under similar osmoticpressure maintained by different additions其次，选取木糖、果糖和葡萄糖为底物，评估相同底物浓度控制的不同渗透压对 GOD 活力的影响。底物中分别添加 200 g/L 的木糖、果糖和葡萄糖，得到渗 透 压 值 依 次 为 543.52、1 281.72 和 900.71mOsmol/(kgH2O)。如图 6 所示，在木糖和果糖的实验组，GOD 的活力仅为2.21 和3.09 U/mL，而添加葡萄糖的实验组则表现出了较强的酶活力10.91 U/mL，大约提升了 3 5 倍。同时菌丝体生物量在葡萄糖作用下可以达到 24.33 g/L，比木糖和果糖的实验组分别增加了 59.87%和 10.70%。这一现象与 HATZINI-KOLAOU 等23 报道的结果相一致，葡萄糖作为 GOD转录基因的主要诱导物可能是造成这种显著差异的主要原因。由此可见，培养基中的渗透压对 GOD 的活力起到非常关键的控制作用。图 6相同浓度底物不同渗透压培养的 GOD 活力Fig 6GOD activity by A niger using different carbonsources under different osmotic pressure2 5讨论黑曲霉自身生长特性与细菌和酵母不同，在液态发酵培育中传质和传氧与菌体生长呈负相关性25。有研究表明，真菌生命周期中的颗粒化会导致培养基黏度的降低，进而有助于底物混合效率和传质效果26，也有利于简化下游的固液分离工艺流程。但是在颗粒球状生长阶段，由于质量传递的局限性，微生物对溶解氧和营养物质的吸收受到抑制，会导致菌体内部的自溶27 29。相比之下，在微球嵌入到丝状真菌的网状结构的生长阶段，培养基的黏度会发生改变，菌丝吸收营养物质的接触面积将会增大30。丝状真菌在发酵培养过程中会呈现出菌丝球状、发散网状和游离丝状的多种形态，形态学分析手段为控制菌丝特性，发酵液流变特性和代谢产物的研究提供了良好的依据。很多学者在黑曲霉产葡萄糖氧化酶的研究中，关注于常见工艺参数的优化，如:培养基组成、pH、温度、溶解氧和二氧化碳等12，这些因素都会间接影响菌体生长环境的渗透压。本文通过直接控制渗透压的方法，研究了黑曲霉菌丝体生长形态和 GOD 活力的变化。在一定渗透压范围内，菌丝体呈现发散丝状的生长形态并分泌较高活力的 GOD。此项研究工作为 GOD 生产工艺放大和其他生物制品的发酵生产提供了参考依据。在今后的研究中，将以此为基础继续探究其他底物种类、pH、搅拌等引发的渗透压改变对菌丝体形态和 GOD 活力的影响。3结论培养基中的渗透压会严重影响黑曲霉的生长形态和 GOD 活力。随着渗透压的增长，菌丝体形态呈现出了从菌丝缠绕的颗粒球状向发散菌丝团状的转变。吖啶橙染色的结果表明，NA 丰富的蛋白活性区域分布在丝状形态中和颗粒球团的外层上。菌丝研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)51体生长形态的改变会导致内部代谢途径的改变，进而影响到 GOD 的活力。在 200 g/L 葡萄糖培养基中产生的渗透压为 900 71 mOsmol/(kgH2O)，可以获得最高的 GOD 活力(11 23 U/mL)。发酵工艺优化研究中渗透压参数通常被忽视，不同微生物对环境的适应能力也存在着差异，在大规模工业生产中，稳定适宜的渗透压环境可以提高目标物产量和增加经济效益。参考文献 1郭贺楠，杨勇智，董冰，等 葡萄糖氧化酶研究进展J 中国畜牧杂志，2018，54(4):10 14GUO H N，YANG Y Z，DONG B，et al esearch progress on glu-cose oxidaseJ Chinese Journal of Animal Science，2018，54(4):10 14 2惠瑶瑶，郑斐，王倩楠，等 一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法J 食品与发酵工业，2020，46(9):255 259HUI Y Y，ZHENG F，WANG Q N，et al An innovative iodine-starch spectrophotometry method for quantitative detection of glucoseoxidaseJ Food and Fermentation Industries，2020，46(9):255 259 3MULLE D Oxidation von glukose mit extrakten aus Aspegillus nigerJ Biochem Z，1928，199(1):136 170 4李蓉，张庆芳，迟乃玉 微生物葡萄糖氧化酶的研究进展J 中国酿造，2018，37(3):1 5LI，ZHANG Q F，CHI N Y esearch advance of glucose oxidasefrom microorganisms J China Brewing，2018，37(3):1 5 5廖兆民，蔡俊，林建国 微生物葡萄糖氧化酶的研究进展J 食品与发酵工业，2018，44(7):308 315LIAO Z M，CAI J，LIN J G esearch progress of microbial glucoseoxidaseJ Food and Fermentation Industries，2018，44(7):308 315 6杨久仙，曹靖 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