基因工程的基本操作程序-学案.doc

基因工程的基本操作程序 学案(完整资料）
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课题 １．2 基因工程的基本操作程序
学习目标:简述基因工程的原理和技术。
　 理解基因操作的工具和基本程序及应用。
学习重点和难点:
重点:提取目的基因的方法。
难点:目的基因导入受体细胞的途径.
自学测评：
基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：①目的基因的;
②的构建；
③将目的基因;
④目的基因的.
一、目的基因的获取：
１、目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的.
２。获取目的基因的方法
(1)从基因文库中获取目的基因
① 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多,导人受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组文库:含有一种生物的基因
② 种类
cDNA文库:含有一种生物的基因
③　目的基因的获取
根据基因的有关信息:基因的序列、基因在上的位置、基因的产物mRNＡ、基因的产物蛋白质等特性获取目的基因。
（2）利用PＣR技术扩增目的基因.
①　ＰCR:是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术.
② 过程：目的基因DＮA受热形成，与结合，然后在ﻩ＿＿＿_的作用下进行延伸形成DＮA。
③方式：指数扩增= (n为扩增循环的次数）
(3）化学方法人工合成：基因较,核苷酸序列。
二、基因表达载体的构建
1、表达载体的组成:目的基因+++标记基因+。
2、启动子:位于基因的，它是结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。
3、终止子:位于基因的，终止。
４、标记基因:受体细胞是否含有目的基因。
5、表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且给下一代；使目的基因 ﻩ_＿__和发挥作用。
6、不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法，基因表达载体的构建上也会有所差别。
三、将目的基因导入受体细胞
(一）转化:目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和的过程。
(二)方法
１、将目的基因导入植物细胞
(1）农杆菌转化法
①　农杆菌特点：易感染植物和裸子植物，对______＿____植物没有感染力；Ti质粒的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
② 转化：目的基因插人农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达.
（２）基因枪法：是植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
（３)花粉管通道法
２.将目的基因导入动物细胞
(1）方法：。
（２)操作程序：目的基因表达载体→取→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到____性动物的 _＿______＿内发育→新性状动物。
3。将目的基因导人微生物细胞
(1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
（２）转化：处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→　_＿＿细胞吸收ＤNA分子。
四、目的基因的检测与鉴定
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
水平检测
第一步
目的基因是否进入受体细胞

是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRＮA

是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质

是否成功显示出杂交带

水平鉴定

合作探究、精讲点拨:
探究一目的基因的获取
１、基因文库

文库文库2.原核细胞和真核细胞的基因结构 
（1)原核细胞的基因结构

（2）真核细胞的基因结构

3.PCR技术
　 原理:
前提：一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成
条件:、、、、
过程：
a．变性（℃）：目的基因DNＡ受热变性后接连为单链
ｂ．退火(℃）：与单链相应互补序列结合
c．延伸（℃）：在的作用下进行延伸
Taq酶的特点是.
PCR扩增技术与DNA复制的比较

PCR技术
DNＡ复制
相同点
原理
DＮA复制(碱基互补配对）
不
同
点
解旋方式
DNA在条件下变性解旋
催化
场所
复制（ＰCR扩增仪）
主要在内
酶
酶
细胞内含有的
能量

结果
在短时间内形成大量的
形成整个
 探究二 基因表达载体的构建
用一定的_＿_＿＿___＿切割质粒，使其出现一个切口,露出__＿______＿＿_.用__＿__＿_______切断目的基因，使其产生_＿______＿_____＿＿。将切下的目的基因片段插入质粒的__＿_＿_处,再加入适量__＿_＿_＿_＿__，形成了一个重组DNA分子（重组质粒)

探究三 目的基因导入受体细胞－--转化
细胞类型
常用方法
转化过程
植物细胞

将目的基因插入Ti质粒的T—DNＡ上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNＡ上→表达
动物细胞

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物
微生物

用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 →感受态细胞吸收DNA分子

探究四 目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
问题１: 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？

问题2．试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？

拓展提高、达标测评：
1.下列正确表示基因操作“四部曲”的是　 　 　 　　 　 （ 　）
A.提取目的基因→目的基因导入受体细胞→基因表达载体的构建→目的基因的检测和鉴定
Ｂ。目的基因的检测和鉴定→提取目的基因→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞
C.提取目的基因→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
D．基因表达载体的构建→提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
２．下列不属于获得目的基因的方法的是 　 　　 　　　 (　 ）
A．利用DNA连接酶复制目的基因 　 Ｂ．利用ＤNA聚合酶复制目的基因
C．从基因文库中获取目的基因 　 　　 D．利用PＣＲ技术扩增目的基因
３。ＰCＲ技术扩增DＮA，需要的条件是 　 　 　 　 　（ )
①目的基因 　②高温 ③四种脱氧核苷酸　 ④DＮA聚合酶等 　⑤mRNＡ 　⑥核糖体
A．①②③④ 　　B．②③④⑤ C.①③④⑤　　　 Ｄ。①②③⑥
4．根据mRＮＡ的信息推出获取目的基因的方法是 　 　 　　 　 （　 )
A．用DNA探针测出目的基因　 　 B．用mRNA探针测出目的基因
C．用mRNＡ反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mＲNA
5．在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（ 　 ）
A.用mRNＡ为模板逆转录合成DNＡ
B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
C。由蛋白质的氨基酸序列推测ｍRNＡ　
D.将供体ＤNＡ片段转入受体细胞中，再进一步筛选
６、在基因工程中,把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是４6０个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ )
A.540个 B.８10０个ﻩ 　C．1728０个 D.７56０个
7.下列不属于目的基因与运载体结合过程的是 　　 　 　 （ )
A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端
B。用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端
C.将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处
D.将重组ＤNＡ导入受体细胞中进行扩增
８．下列哪项不是基因表达载体的组成成分 　　 　 　　　　 　　 　 （ ）
A.启动子　　　 B.终止密码子 　 C．标记基因 　Ｄ。复制原点
9.在基因表达载体的构建中，所需要的酶是 　　 　 　 ( 　 )
①限制酶 ②DNA连接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶
A．①② 　　 　B．①②③　　 　 Ｃ。①②④　 　 Ｄ．①②③④
1０．植物学家在培育抗虫棉时，对目的基因作适当修饰，使目的基因在棉花植株的整个生长发育期都表达,以防止害虫侵害，这种对目的基因所作的修饰发生在（）
A．终止子 　 B．引物 C.标记基因 D。启动子
11。下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 　 　　　 （ 　 ）
A．基因枪法 B．显微注射法 Ｃ.农杆菌转化法　 Ｄ．花粉管通道法
1２．在基因工程操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的是 　 　　 （　 　 ）
Ａ．人工合成目的基因 　 　 B．目的基因与载体结合
Ｃ。将目的基因导入受体细胞 Ｄ．目的基因的检测与鉴定
13。将目的基因导入微生物细胞之前,要用Cａ2+处理细胞,处理过的细胞叫（　 　）
Ａ.感受态细胞 Ｂ．敏感性细胞 C.吸收性细胞 D.接受细胞
14。农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞，目的基因的最终位置是 　 （ 　 ）
A．Ti质粒上　 B。受体细胞染色体上　 C。裸露细胞核中 Ｄ．存在细胞质中
15.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 　 （ 　　 )
①检测受体细胞是否有目的基因 　②检测受体细胞是否有致病基因 
③检测目的基因是否转录mRＮA   ④检测目的基因是否翻译蛋白质
   　A。①②③    B.②③④    Ｃ．①③④     Ｄ.①②④
１6．要检测目的基因是否成功地插入了受体ＤNＡ中，需要用基因探针，基因探针是指 　 　 　　 ( 　）
A.用于检测疾病的医疗器械
B。用放射性同位素或荧光分子等标记的目的基因
Ｃ.合成β—球蛋白的DＮA
D。合成苯丙羟化酶的DNA片段
17.（多选）用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质.下列叙述正确的是（ 　 ）
A．常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒
B.DNＡ连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必须的工具酶
C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达
1８.（多选）我国科学家运用基因工程技术将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达,培育出了抗虫棉。下列叙述正确的是 　 　 　 （　 ）
Ａ．基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少
B.重组DNA分子中增加一个碱基对，可能导致毒蛋白的毒性丧失
Ｃ.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染
D。转基因棉花是否具有抗虫特性是可以通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
19。（多选）科学家通过基因工程的方法,能使马铃薯块茎内含有人奶主要蛋白。以下有关该基因工程的叙述，正确的是 　 　 　 　 　 　 　 　 ( 　　)　
A.采用反转录的方法得到目的基因有内含子
B．基因非编码区对于目的基因在块茎中表达是不可缺少的
C．马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞
D.用同一种限制性内切酶，分别处理质粒和含目的基因的ＤNA,可产生黏性末端而形成重组DＮA分子
2０．人体受到病毒刺激后可以产生干扰素。干扰素分为α．β．γ三类。１９80年生物学家成功地破译了α干扰素的全部遗传信息.并运用插入质粒的方法．用大肠杆菌生产。得到的干扰素可以用于治疗肝炎和肿瘤．回答下列问题:
（1)上述材料中涉及到的现代生物技术有.
（2)人体中能合成干扰素的细胞是,合成的场所是细胞中的。　（3）在利用大肠杆菌生产干扰素过程中，目的基因是，所用的运载体是
(4)目的基因在大肠杆菌中表达时必须经过和过程。

21．资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DＮA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图)，在很短的时间内，将DNＡ扩增几百万倍甚至几十亿倍,使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：

(1)加热至9４℃的目的是使DNA样品中的_＿___＿_键断裂，该过程在生物体细胞内是通过__＿＿＿_____酶的作用完成的。分析可知新合成DＮＡ分子中Ａ＝T，C＝G，这说明DNA分子的合成遵循_＿_＿____＿___________＿＿.
（2）与细胞内ＤNＡ复制相比,PCR技术所需要的ＤＮＡ聚合酶的最适温度比较__＿____＿__＿＿(高、低）.
（3）通过PＣR技术使ＤNA分子大量复制时,若将一个用15N标记的模板DNA分子(第一代)放入试管中，以1４Ｎ标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DＮA总单链数的比例为。
（４）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（　 ）
Ａ．白细胞DNA B.病毒蛋白质　　 C。血浆抗体 D。病毒核酸
２2.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，请回答下列问题:

（1）一个图1所示的质粒经SmaⅠ切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。
(2）若对图中质粒进行改造，插入的ＳｍaⅠ酶切位点越多，其热稳定性越。
（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmａⅠ切割,原因是
。
（4)与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Ｈｉnd　Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源ＤNA的优点在于可以防止。
（5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。
（6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了.
（7）为了从ｃDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体,然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
1.1基因工程的基本工具练习题
一、选择题
1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( 　 )
　Ａ、将目的基因从染色体上切割出来 Ｂ、识别并切割特定的DＮA核苷酸序列
Ｃ、将目的基因与运载体结合D、将目的基因导入受体细胞
2、下列四条ＤＮA分子,彼此间具有粘性末端的一组是　( 　 )
T A G G
C C A T
T A C C

G G T A

①②

③④

A．①② 　　Ｂ．②③　　 C。③④　　　Ｄ．②④
3、基因工程是DNA分子水平的操作,下列有关基因工程的叙述中,错误的是（ 　 　）
　A、限制酶只用于切割获取目的基因、载体与目的基因必须用同一种限制酶处理
C、基因工程所用的工具酶是限制酶,DNA连接酶
D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测
４、下列有关基因工程的叙述,正确的是：（ )
A．ＤNA连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来
B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变
C.目的基因与运载体结合的过程发生在细胞外
Ｄ．常使用的运载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等
5、下列关于ＤＮA连接酶的叙述中,正确的是 （　　 ）
Ａ.　DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
B. DＮA连接酶连接的是黏性末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖
C。 ＤNA连接酶连接的是黏性末端两条链主链上的磷酸和核糖
D。 同一种DNA连接酶可以切出不同的黏性末端
６、实施基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来,这要利用限制性内切酶。从大肠杆菌中提取的一种限制性内切酶EcｏｒI，能识别DNA分子中的GAATＴＣ序列,切点在G与A之间.这是应用了酶的 　　 　 　 　　 （　　 ）
Ａ.高效性 　B.专一性 Ｃ.多样性 　 Ｄ。催化活性受外界条件影响
7、下列有关质粒的叙述，正确的是　　 　 　 　 　 　 （ 　　)
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B．质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DＮＡ分子
Ｃ．质粒只有在侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
8、右图所示为限制酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是 　 A.ＣTTAAG,切点在C和T之间 　 B。CTTＡAG，切点在G和Ａ之间　 　C.GAAＴTＣ,切点在G和Ａ之间 D。GＡAＴＴC，切点在C和Ｔ之间

９、关于右图DNA分子片段的说法正确的是( 　 ）
①
G
C
A
T
A
T
G
C
A
T
A
T
15N
14N
②
③
…
…
…
…
…
A。限制性内切酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位
Ｂ。②处的碱基缺失导致染色体结构的变异
Ｃ.把此DNＡ放在含15N的培养液中复
制2代,子代中含15Ｎ的ＤNA占3/4
Ｄ.该DNA的特异性表现在碱基种类和(A+T）/(G+C)的比例上
１0、下列关于各种酶作用的叙述，不正确的是
Ａ．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
Ｂ。RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
Ｃ.一种DNA限制酶能识别多种核苷酸序列，切割出多种目的基因
Ｄ．胰蛋白酶能作用于离体的动物组织,使其分散成单个细胞
11、与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是：（　）
Ａ．反转录酶        B.ＲNＡ聚合酶        　C．DNＡ连接酶      D.解旋酶
12、除下列哪一项外，转基因工程的运载体必须具备的条件是：( )
A。能在宿主细胞中复制并保存         B。具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
Ｃ.具有标记基因，便于进行筛选       D。是环状形态的DＮA分子
1３、下列黏性未端属于同一限制酶切割而成的是

Ａ．①②B。①③C。①④D．②③
１4、基因工程中可用作载体的是

①质粒②噬菌体③病毒④动物细胞核
A．①②③Ｂ.①②④C．②③④D.①③④
１５.关于限制酶的说法中，正确的是
A。限制酶是一种酶，只识别ＧAＡTＴC碱基序列
Ｂ.EcoRI切割的是G—Ａ之间的氢键
C．限制酶一般不切割自身的DＮA分子，只切割外源ＤＮA
D．限制酶只存在于原核生物中
16．限制酶是一种核酸切割酶,可辨识并切割DNＡ分子上特定的核苷酸碱基序列.下图为四种限制酶BamHI，EcoRＩ，ＨiｎdⅢ以及ＢglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何?

A．BaｍHI和EcoＲＩ;末端互补序列—AATT—
B.ＢａmHＩ和HiｎdⅢ；末端互补序列—GATC-
C.EcｏRI和HindⅢ;末端互补序列-ＡATT—
D．BamHI和BglII；末端互补序列—GATC-
　 １7．镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变.检测这种碱基序列改变必须使用的酶是（）
A。解旋酶B。ＤＮA连接酶C.限制性内切酶D.RＮA聚合酶
1８.DNA连接酶催化的反应是
Ａ.DNA复制时母链与子链之间形成氢键Ｂ。黏性末端碱基之间形成氢键
C。两个DＮA片段黏性末端之间的缝隙的连接 Ｄ.A、B、C都不正确
19．在受体细胞中能检测出目的基因是因为
A．目的基因上有标记Ｂ．质粒具有某些标记基因
C．重组质粒能够复制D。以上都不正确
20．关于质粒的叙述正确的是
A.质粒是能够自我复制的环状DNA分子 B.质粒是唯一的载体
C.重组质粒是目的基因Ｄ。质粒可在宿主外单独复制
二、非选择题
２１.下图为DNＡ分子的切割和连接过程。
（1)EcoRI是一种     酶，它识别的序列
是          ，切割位点是     
与      之间的              键。
切割结果产生的DNA片段末端形式为        .
（2）不同来源ＤNＡ片段结合，在这里需要的酶应
是        酶,此酶的作用是在       
与        之间形成       键。
有一种能连接平末端的ＤNA连接酶是   。
22.番茄在运输和贮藏过程中，由于过早成熟而易腐烂。
应用基因工程技术，通过抑制某种促进果实成熟激素的
合成，可使番茄贮藏时间延长，培育成耐贮藏的番茄新品
种.这种转基因番茄已于19９3年在美国上市,请回答：　　
(１）促进果实成熟的重要激素是    。
（２）在培育转基因番茄的操作中，所用的基因的“剪刀”是　,基因的“针线”是,基因的“运输工具”是。
（3）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是、
23。下图是利用基因工程办法生产人白细胞干扰素的基本过程图，据图回答:

(1）①过程需要__＿_______＿_＿__酶的参与。
(２)②物质是从大肠杆菌分离出的＿＿＿＿__＿____＿_____。其化学本质是____＿____＿_＿_＿＿_,它必须能在宿主细胞中______＿＿＿＿＿______＿____＿___.
（３）③过程表明目的基因＿_______＿______＿_________。

答案:１-５ＢＤＡCB 　 　 ６—-１0BBCAC 　　　１1－——15 ＣDBAC

　 １６-－20DCDBA

2１、(１）限制酶   GAAＴTC  鸟嘌呤脱氧核苷酸  腺嘌呤脱氧核苷酸  磷酸二酯  黏性末端 

（2）DNA连接 鸟嘌呤脱氧核苷酸  腺嘌呤脱氧核苷酸   磷酸二酯 　Ｔ4ＤＮA连接酶

22、 (１)乙烯　 　（2）限制酶 DNA连接酶　 运载体 　(３)定向改变生物的遗传性状 　　克服远缘杂交不亲和的障碍

2３.（8分)（１）限制性内切酶(2分)　 （２）质粒（1分)DＮA（１分)复制并

稳定地保存（2分) 　 (３）在大肠杆菌内表达(2分)

基因工程基本过程
基因工程（genetic ｅngiｎeering）,也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖(称之为＂克隆”)和行使正常功能(称之为＂表达”）,从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来,基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的ＤNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制,继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子,或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物.
常用的工具酶
限制性内切酶—主要用于DＮＡ分子的特异切割　
ＤNA甲基化酶-用于DNＡ分子的甲基化
核酸连接酶-用于DNＡ和RNＡ的连接
核酸聚合酶—用于DＮA和RNＡ的合成
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割　
核酸末端修饰酶-用于DNA和RNA的末端修饰　
其它酶类——用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
主要过程有为四步：
一． 获得目的基因
有多种方法可获得目得基因
1. 构建cDＮＡ文库分离目的基因
过程：
（1） 从真核细胞中提取mRNＡ，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cＤNＡ的第一条链。
（2） 以第一条链为模板,以反转录酶或DＮA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。
（3） 在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4） 接头或衔接子连接。
（5） 凝胶过滤分离cDNA。
（6） 通过核酸探针法或免疫反应法从cＤNA文库中分离特异cDNＡ克隆。
2.人工化学合成法
　　适于已知的核苷酸序列且校小的DNＡ片断合成,常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。
过程：先用以上方法合成基因ＤＮA不同部位的两条链的寡核苷短片段,再退火成为两端形成粘性末端的DNＡ双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的DＮA片段,再用连接酶连接成完整的基因.
3.利用PCR技术直接扩增目的基因
PCＲ（Polｙmerａse Ｃｈaiｎ Reaｃtiｏn）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,已知待扩增目的基因或DNＡ片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程,用PＣR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。
二．载体的选择与制备
1．载体的选择（以质粒为例）
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记,便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点(MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
(6) 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNＡ聚合酶所识别
(7) 应具有阻遏子，使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。
(8) 应具有很强的终止子,以便使RNＡ聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNＡ较为稳定。
(9) 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
2. 制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等.
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DＮＡ分开及除去蛋白质和RNA。
在pH值12．0～1２．5范围内时,线性的ＤNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性,线性染色体形成网状结构,而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有ｃccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒ＤNA.
三。构建基因表达载体
1. 用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。
2. 用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端.
3. 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量ＤNA连接酶，形成了一个重组DＮA分子(重组质粒）.
四．目的基因导入受体细胞
1. 将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法
2. 将目的基因导入动物细胞－显微注射法
3. 将目的基因导入微生物细胞(以大肠杆菌为例）
（1）用Cａ2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞.
（2）将重组表达载体DNＡ分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DＮＡ分子，完成转化过程.
（3)目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因.
五.目的基因的检测与鉴定
1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DＮA上
检测方法：采用ＤNA分子杂交技术
2．检测目的基因是否转录了mRＮＡ
检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测方法:提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品.
　　　　 　基因工程制药实例及意义
抗生素类
传统的抗生素生产,主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低,生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群.而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造,得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料６AＰA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因PＢR3２2的质粒克隆化所形成的菌株,其酶活力比原株提高５０倍.从而提高6ＡPA生产能力.我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量.

基因工程的基本操作程序习题
一、选择题（每小题3分，共３９分）
１.下列关于基因工程的叙述,错误的是( ）
A.目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物
Ｂ.限制性核酸内切酶和DNＡ连接酶是两类常用的工具酶
Ｃ．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是（　 ).　　　
A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
B．限制性核酸内切酶的活性受温度影响
Ｃ．限制性核酸内切酶能识别和切割RＮA
Ｄ．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取
3．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Psｔ Ⅰ、SmａⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是(　 ）。

A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶 SmａⅠ
Ｃ。抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
４.下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是（　 )

A．过程①获取的目的基因,可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C。过程②构成的重组质粒缺乏标记基因,需要转入农杆菌才能进行筛选
D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
5．下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、ＤNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（ 　）

A。①②③④B.①②④③C．①④②③D。①④③②
6．下列关于基因工程的叙述，不正确的是(多选)（　 )
A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因
Ｂ。细菌质粒是基因工程常用的运载体
C．通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA,用另一种处理运载体DNA
D。为培育成抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
7．天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因Ｂ。现用基因工程技术培育蓝玫瑰,下列操作正确的是（　 ）
A.提取矮牵牛蓝色花的mRＮA，经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因Ｂ
Ｂ。利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C。利用DNA聚合酶将基因Ｂ与质粒连接后导入玫瑰细胞
D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
9。将ada(腺苷酸脫氨酶基因）通过质粒pET28ｂ导人大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是(　）
A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C。每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子　　　
1０．下列叙述符合基因工程概念的是（　 )。
Ａ。B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNＡ发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D。自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DＮＡ整合到细菌DNA上
11。在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中,下列操作错误的是（　　）。
A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸
B．用DＮA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DＮA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
13．下列关于基因工程的叙述，错误的是(　　）。
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和ＤNＡ连接酶是两类常用的工具酶
Ｃ．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DＮＡ的细胞和促进目的基因的表达
二、填空题（共５1分)
1。科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的ＤNA分子重组,并且在大肠杆菌体内表达成功。请根据图回答问题：

(１)此图表示的是采取合成基因的方法获取基因的过程。
(２）图中①DNA是以为模板,形成单链DNＡ，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。
(3）图中③代表DNＡ，含基因。
（4）图中④表示 .
2.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题.

（１)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—,限制酶Ⅱ识别序列和切点是—G↓ＧAＴＣC—，那么在①过程中,应用限制酶_＿__＿_＿_切割质粒，用限制酶__＿__＿＿_切割抗虫基因.
（2)将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有＿_＿_＿_＿＿的培养基上,若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入.
（3)要确定抗虫基因导入后,是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：________。经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子.理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的____＿_＿_.
（４)⑤过程所用的现代生物技术称为___＿__＿＿，从遗传学角度来看，据细胞通过⑤过程,能形成棉植株的根本原因是细胞具有___＿____＿___＿__＿____。
3。干扰素是病毒侵入人体后由淋巴细胞产生的一种免疫活性物质，它具有广谱抗病毒的作用。利用现代生物技术生产干扰素的流程如下：

（1）过程①产生的物质A是_____＿,ｃＤNＡ文库_____＿(大于／小于)人的基因组文库。
（２)过程④用到的工具酶是______________，过程⑤需先用＿_＿__＿＿____＿_____＿__处理受体细胞，过程⑥通常采用_＿＿＿____技术。
(3）过程⑧和⑨的关键技术分别是___＿____、_＿_____＿。
（4)基因工程的核心步骤是图中的__＿___＿__＿__＿＿＿_（填标号)。
4.(2011·安徽理综31)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
(1）进行转基因操作前,需用___＿__＿_酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞.
（2）为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cＤNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的__＿___＿_和_＿_＿＿＿＿＿之间。
(３)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细