基因工程大题模板.doc

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2基因工程操作的基本步骤是什么?
① 施工材料的准备, 即目的基因、 载体、 工具酶和受体细胞( 宿主) 的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA 和载体分子切开。( 切) ② 目的基因与载体 DNA 的体外重组, 形成重组DNA 分子。( 接) ③ 把重组的 DNA 分子引入受体细胞, 并建立起无性繁殖系。( 转和扩④ 筛选出所需要的无性繁殖系, 并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、 正确表示。( 检)
3如何理解基因工程的两个特点?
答: 基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表示。分子水平的操作包括DNA 分离、 切割和连接( 还有其它一些DNA 的修饰等) 。由于体外重组DNA 的最终目的是要改变生物的遗传性, 因此分子水平的操作和细胞水平的表示是基因工程的两个最基本的特点。
4基因克隆是如何使含有单个基因的DNA 片段得到纯化的?
答: 大分子质量的DNA 会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点, 因此用一种限制 酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的DNA 片段, 每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时( 如图所示) , 每个片段将插入一个不同的载体分子(如一个质粒)。同样地, 当用这些质粒转化宿主细胞时, 每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA 分子, 而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体DNA 片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了, 此重组DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。
5比较遗传工程、 基因工程和生物技术。
答: 遗传工程是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想, 在离体条件下, 对生物细胞、 细胞器、 染色体或DNA 分子进行按图施工的遗传操作, 以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。狭义的遗传工程就是指基因工程。基因工程( gene engineering) 又称基因操作( gene manipulation) 、 重组DNA( recombinant DNA) 。基因工程是以分子遗传学理论为基础, 以分子生物学和微生物学的现代方法手段, 将不同来源的基因(DNA 分子), 按预先设计的蓝图, 在体外构建杂种DNA 分子, 然后导入活细胞, 以改变生物原有的遗传特性, 获得新品种, 生产新产品, 或是研究基因的结构和功能。生物技术又称生物工艺学, 生物工程学。是根据生物学、 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、 动植物细胞及其亚细胞组分, 进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、 蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括基因工程、 细胞工程、 酶工程和发酵工程等。
6说明Sanger DNA 测序法的原理。
答: Sanger DNA 测序法建立在两个基本原理之上: ①核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合; ②可延伸的引物必须能提供游离的3’羟基末端, 双脱氧核苷酸由于缺少游离的3’羟基末端, 因此会终止聚合反应的进行。如果分别用四种双脱氧核苷酸终止反应, 则会获得四组长度不同的DNA 片段。经过比较所有DNA 片段的长度能够得知核苷酸的序列。

11当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时, 若要进行双酶切, 应采取什么措施? 为什么?
答: 注意星号活性; 先低盐, 后高盐; 先低温酶, 后高温酶; 而且能够直接在换酶前将第一种酶失活, 再加第二种酶, 否则, 易产生星号活性, 或使用通用缓冲液。
12．何谓限制性物理图谱?
答: 限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restriction mapping)。简单地说就是DNA 分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位, 即DNA 分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。标明限制酶在DNA 分子上的限制性位点的数目、 限制性片段大小及其线性排列的顺序。
13什么是细菌的限制—修饰系统 (Restriction ModificationSystem, R-M system)?
答: 细菌中有作用于同一DNA 的两种酶, 即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且, 这两种酶作用于同一DNA 的相同部位, 把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。
14细菌的限制—修饰系统有什么意义?
答: 不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是经过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修饰, 由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰, 限制酶就不能进行切割。而外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化, 宿主的限制酶经过对该位点的识别来分辨敌我, 并将入侵的外来DNA 分子降解掉。因此DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。
15说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答: 基本原则: 属名+种名+株名十序号。
①首字母: 取属名的第一个字母, 且斜体大写。第二个字母: 取种名的第一个字母, 斜体小写。第三个字母: 取种名的第二个字母, 斜体小写。第四个字母: 若有株名, 株名则作为第四个字母, 用正体。②顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶, 则按先后顺序冠以I、 II、 III 等, 用正体。③所有的限制酶, 前面还应带有系统的名称,如限制性核酸内切酶 R. Hind III。修饰酶则在前面加上甲基转移酶M, 如甲基转移酶M. Hind III。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方, R 可被省去。
16何谓限制性内切核酸酶的切割频率?
答: 切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA 分子中预测的切点数。由于DNA 是由四种类型的单核苷酸组成, 假定DNA 的碱基组成是均一的, 而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的, 那么对于任何一种限制酶的切割频率, 理论上应为1／4n, n 表示该限制酶识别的碱基数。如识别4 个碱基的限制酶, 其切割频率应为每256 个碱基有一个识别序列和切点( 1／44 = 1／256) , 识别5 个碱基的限制性内切核酸酶, 其切割频率应为每1024 个碱基有一个识别序列和切点, 余类推。
18双酶消化法( double digest) 绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理是什么?
答: 双酶消化法是绘制DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA 分子的基础上, 再用这两个酶同时或先后消化DNA, 根据它们的结果构建物理图谱。
17什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素的影响?
答: II 类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性, 可是这种特异性受特定条件的限制, 即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件发生改变, 限制酶的特异性就会松动, 识别的序列和切割都有一些改变。改变后的活性一般称第二活性, 而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示, 因此第二活性又称为星号活性。诱发星号活性的因素有如下几种: ①高甘油含量(＞5％, v／v); ②限制性内切核酸酶用量过高(＞100U／gDNA); ③低离子强度(＜25mmol／L); ④高pH(8．0 以上); ⑤含有有机溶剂, 如DMSO、 乙醇等; ⑥有非Mg2+的二价阳离子存在( 如Mn2+、 Cu2+、 Co2+、 Zn2+等) 。
19什么是DNA 多态性 (DNA polymorphism)?
答: 在正常人群中, 各个体DNA 分子的某些位点能够发生中性改变, 这些改变虽然会使DNA 一级结构产生一定变化, 但不影响基因的表示, 如果这种中性突变在人群中的频率不低于1％, 这一现象被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体DNA 中核苷酸数目或排列顺序的个体差异, 这些差异多数为中性突变, 不引起表型改变。
20什么是限制性片段长度多态性 (restriction fragment lengt hpolymorphism, RFLP)?
答: 当DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时, 或当DNA 片段的插入、 缺失或
重复导致基因组DNA 经限制性内切核酸酶酶解后, 其片段长度的改变能够经凝胶电泳区分时, DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析, 这种多态性称为限制性片段长度多态性(RFLP)。
22何为回文序列?
答: 回文序列( palindromic sequence) 是一段自我互补的序列, 即同其互补链一样的序列( 两者的阅读方向都是从5’→3, )。根据回文序列的结构可分为: 完全的回文序列、 不完全的回文序列和间断的回文序列。完全回文序列( 如GAATTC) , 一般是限制性内切核酸酶的识别序列; 不完全的回文序( TACCTCCAT,CGTGATA) , 常是其它蛋白质的结合位点(如阻抑蛋白), 在基因表示调控中有重要作用; 间断的回文序列( 如GGTTXXXAACC, 有一段是颠倒的重复) , 它可使单链的核苷酸有可能在tRNA 中所见到的一样, 形成发夹环的结构。
23DNA 连接酶的连接机理是什么?
答: DNA 连接酶是利用ATP 或NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA 双链间的缺口形成磷酸二酯键。在连接反应中, 首先ATP (NAD+)与DNA 连接酶反应, 同连接酶生成一种共价结合的酶-AMP 复合物。其中AMP(腺苷一磷酸)经过一种磷酸酰胺键同DNA 连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连。同时释放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸( NMN) 。AMP 激活DNA 一条链的5’-末端磷酸基团, 并转移到磷酸基团上, 形成DNA-腺苷一磷酸复合物。最后, 3’-OH 对激活的磷原子作亲核攻击, 形成磷酸二酯键, 同时释放出AMP。连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时, 焦磷酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP作为能源的连接酶中, 一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷酸键。
29列举质粒载体必须具有的基本条件。
答: (1)能独立复制; (2)具有选择标记;
(3)有独特的酶切位点; (4)能转化但不扩散。

24DNA 连接酶的作用特点有哪些?
① 连接反应需要在一条DNA 链的3’末端具有一个游离的-OH, 而另一条DNA 链的5’ 末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下, 才能发挥其连接DNA 分子的功能作用, 而在末端带有5’-羟基和3’-羟基; 5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA 片段之间不起连接作用。② 连接反应中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活因子; ③ DNA 连接酶不能够连接两条单链的DNA 分子, 被连接的DNA 链必须是双螺旋的一部分。④ DNA 连接酶只封闭双螺旋DNA 骨架上的缺口 (Nick), 即在双链DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂, 而不能封闭双链DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口
25影响DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些?
答: 1) 反应温度: 最佳反应温度37℃, 但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定, 连接黏性末端的最佳温度, 一般认为4～20℃比较合适。2) DNA 片段末端: 不但要考虑反应体系中DNA 末端的总浓度, 还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA 分子的末端有较高的几率与另一 DNA 分子连接, 减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段 3: 1 ~ 1: 3。3) 连接酶浓度: 平末端DNA 分子的连接反应, 最适酶量大约是1～2 单位; 而黏末端DNA 片段间的连接, 在同样的条件下, 仅为 0.1 单位时, 便能得到最佳连接效率。
28切口平移法制备DNA 探针的原理是什么?
答: 在Mg 离子存在时, 用低浓度的DNA 酶I( DNase I) 处理双链DNA, 使之随机产生单链断裂。然后用DNA 聚合酶I 的 5'→ 3'外切酶活性能够从断裂处的 5' 端除去一个核苷酸, 而其聚合酶活性则将一个单核苷酸添加到断裂处的 3' 端。随着反应的进行, 即5' 端核苷酸不断去除, 而 3' 端核苷酸同时掺入, 导致断裂形成的切口沿着DNA 链按合成的方向移动, 这种现象称为切口平移。如果在反应体系中加入放射性同位素标记的核苷酸, 则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基, 产生带标记的DNA 分子, 用作DNA 分子杂交探针。
27碱性磷酸酯酶主要有两种, 细菌碱性磷酸酯酶( BIP) 和小牛肠碱性磷酸酯酶( CIP) , 二者有什么不同? 在基因工程中有什么用途?
答: 主要差别是CIP 在68℃时失活, 而BAP 在68℃稳定, 且耐酚抽提。应用: ①dsDNA 的5’端脱磷酸, 防止DNA 的自身连接。可是用CIP 处理后, 最好将CIP 除去, 再进行连接反应。②DNA 和RNA 脱磷酸, 然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。
30举例说明什么是穿梭载体?
答: 穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA 片段的杂种质粒, 有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记, 因此, 很容易从一宿主转到另一个宿主 (来回穿梭)。
38．质粒制备的基本原理?
答: 带有质粒的细菌细胞在SDS 作用下裂解, 并在碱性条件下使DNA 变性。调节pH 值至中性时,
质粒DNA 首先复性, 而细菌基因组DNA 不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体, 能够被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA 分子可被酒精沉淀或其它方法沉淀纯化出来。

26什么是Klenow 酶? 有哪些活性? 在基因工程中有什么作用?
答: Klenow 酶是1974 年Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解DNA 聚合酶I, 得到的两个片段。其中大片段的分子质量为75kDa, 它具有5’→3’聚合酶和3’ →5’外切核酸酶的活性, 小片段具有5’→3’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶I 中会降解5’引物的5’→3’外切核酸酶活性, 因此在基因工程中更有用。
Klenow 酶主要有下列用途: (1) 修复反应, 制备平末端。可用Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其它方法产生的5’或3’突出端, 制备平末端, 这样能够使原来具有不相容的黏性末端的DNA 片段经过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸, 用这种末端填补的方法能够制备3’端标记的探针。用Klenow 酶修复5’突出端的反应主要是利用了Klenow 酶的DNA 聚合酶活性, 是填补反应; 而修复3’突出端则是用Klenow 酶的3’ →5’外切核酸酶的活性, 是切割反应。用Klenow 酶的切割反应来修复3’突出端是不理想的, 改用T4 DNA聚合酶或其它的酶是更好的选择。(2) 标记DNA 3’突出端 (protruding end)。该反应分两步进行: 先用3’ →5’的外切核酸酶活性除去3’突出端, 产生3’隐含末端, 然后在高浓度的标记底物 (32P-dNTP) 存在下, 使降解3’ →5’) 作用与聚合 (5’→3’) 作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应 (exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4 DNA 聚合酶的效果更好, 因它的3’ →5’的外切核酸酶活性较强。(3)其它的一些用途。包括用双脱氧末端终止法进行DNA 序列分析、 用于cDNA 第二链的合成、 在定点突变中用于合成第二链、 用引物延伸法 (primer extension) 制备单链DNA 探针等。
31YAC 载体具有什么样的? 为什么在克隆大片段时, YAC 具有优越性?
答: ( 1) 功能性DNA 序列:①来自于酵母的125bp DNA 片段的着丝点序列 (CEN4)。②来自酵母的自主复制序列 (ARS1), 起始在酵母中的DNA 复制。③来自酵母的端粒序列, 它是 (5-TGTGGGTGTGGTG-3) 的多拷贝重复, 它对染色体的复制和维持是必须的。④在酵母中进行选择的标记基因, URA3( 尿嘧啶生物合成基因) 和TRP1( 色氨酸合成基因) 。寄主是这些基因的营养缺陷性, 只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活
⑤具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC 载体一般含有ColE1 的ori 和氨苄青霉素抗性标记基因, 能够在大肠杆菌中复制和繁殖, 因此它也是一种穿梭载体。
( 2) 优越性: YAC 能够容纳长达上千kb 的外源DNA, 这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因, 在染色体步移中每次允许更大的步移距离, 同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
40为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体?
答: (1) 噬菌体DNA 没有容载能力, 因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的, 不能大于
基因组的105％, 因此要将λ噬菌体改造成载体, 必须削减本身的分子大小; (2) 野生型的λDNA 对于一些常见的酶都有多个识别和切割位点, 不便于克隆; (3) 没有可供选择的标记;
(4) 野生型的λ噬菌体具有感染性, 因此不够安全。

33什么是YAC? YAC 克隆载体常出现哪些问题?
答: YAC 即酵母人工染色体( Yeast Artificial Chromosome) 的缩写, 是人工构建的染色体样大容
量克隆载体, 基本组成有着丝点、 能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA 克隆片段可达到 kb。
问题有: (1) YAC 有嵌合现象, 一个YAC 中克隆的DNA 片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中, 嵌合体占克隆总数的10％～60％。(2) YAC 内部有重组现象, 插入的DNA 较大, 序列发生重排, 导致和原来染色体的序列不一致, 重组很难检出。(3) YAC 还有缺失现象, 影响YAC 文库的代表性。(4) YAC 结构和酵母天然染色体结构相似, 使用常规方法不易将YAC 和酵母天然染色体分开。(5) 构建好的YAC 转化原生质化的酵母菌, 转化效率低。(6) 建好库后保存方便, 但要筛选某个基因时工作量大
32由于基因工程是人为改变遗传信息的操作, 因此必须注意被操作基因的安全。进行严格地监控对质粒载体的安全是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?
答: (1) 非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说, 都不希望载体能够进行自主传递, 也不希望被带动转移。(2) 具有条件致死突变, 如温度敏感质粒pJC307 (ColE1 的衍生质粒) 在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力, 可防止克隆基因扩散, 只存在于限定的宿主细胞中。(3) 一般情况下不希望与宿主染色体发生重组, 因为重组后有可能给宿主带来突变。
(4) 有较小的宿主范围。
34什么是 BAC? BAC 载体的组成与优缺点有哪些?
① 细菌人工染色体( BAC) 是从大肠杆菌F 因子改造构建而来的, 能够携带大约300kb 的DNA 插入片段。② 载体具有 F 因子的复制起始点( oriS) , 可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。③ 载体包括有 4 个维持DNA 复制和拷贝数目的基因, repE, parA, parB and parC。④ 具有一个抗生素选择标记基因, 和 lacZ’基因。在lacZ’基因中组装有一多克隆位点, 便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。⑤ 插入的 DNA 片段非常稳定, 能够在大肠杆菌细胞中维持数百代, 而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。⑥ 主要缺点是每个细胞中的拷贝数少( 1~2 个) , 使得分离和筛选较为困难。
35利用pBR322 质粒插入失活分离带有外源DNA 片段的重组克隆的原理是什么?
① 外源 DNA 片段插入在pBR322 质粒tetr 基因的编码序列内( BamHI) 位点, 使该基因失活;
② 体外重组反应混合物转化大肠杆菌 ampstets 菌株, 并涂布在amp 琼脂平板上, 凡获得了pBR322质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落; ③ 将 amp 琼脂上的菌落原位影印在tet 琼脂平板上生长, 对比这两个平板的菌落生长情况, 凡在amp平板上能够生长而在tet 平板上不能生长的菌落, 便是属于带有重组体质粒的转化子克隆; 挑出这样的阳性克隆, 扩增分离带有外源DNA 插入片段的重组体质粒。
46分离DNA 时, 为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA 和蔗糖?
答: ① EDTA 是螯合剂, 可同Mg2+螯合, 使核酸酶失去了作用的辅助因子, 而被抑制活性。
② 蔗糖增加缓冲液的黏度, 保护DNA 不易断裂。
36pUC 质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么?
答: pUC 系列质粒载体是在pBR322 质粒载体基础上改造来的, 它用lacZ’ 基因取代了pBR322质粒载体上的tetr 基因。lacZ’ 基因编码β-半乳糖苷酶的N 末端1-63 个氨基酸(α-肽链)的DNA 片段, 在lacZ’ 基因内组入了一个多克隆位点( MCS) , 但不影响lacZ’基因的功能。 pUC 载体的宿主( E. coli) 携带一个编码β-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它们本身用这个基因片段产生的β-半乳糖苷酶片段是无活性的, 但它们能够经过α-互补作用在体内相互弥补, 即两部分产物能够结合形成有活性的β-半乳糖苷酶。当pUC 质粒引入大肠杆菌中, 在含有指示剂X-gal 和 IPTG 的诱导培养基上培养时, 菌落成蓝色。如果在MCS 插入外源DNA 片段( 基因) , 破坏了lacZ’ 基因的功能( 插入失活) , 不再产生α-肽链, 不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶, 形成的菌落是无(白)色的。因此, 根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应, 便能够检测出含有外源DNA 插入序列的重组体克隆。
37自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多, 即使是ColE1 和pSCl01 这两个自然质粒也不尽如人意, 一般需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容?
答: 基本内容包括: (1) 删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段; 削减载体的分子质量, 使载体具有更大的容纳外源片段的能力。(2) 加上易于选择或检测的标记。(3) 限制性内切核酸酶的酶切位点的改造, 便于外源基因插入到载体中的特定位置。(4) 加上一些调控元件, 有利于克隆基因的表示。(5) 安全性改造, 限定载体的宿主范围。
42λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
答: 优点: (1) λ基因组中有1／3 的非必须区能够被置换。改造成载体后, 克隆的片段较大(可 达20kb), 而质粒载体的克隆片段只有几个kb; (2) 用噬菌体λDNA 作为载体, 即使不进行体外包装, 转染的频率也比质粒转化的效率高, 包装后的效率就更高了; (3) λ可经过溶原化反应整合到寄主染色体上, 当不需要外源基因大量表示时, 可让 它以溶原性存在, 若要表示, 可经过诱导即可进入裂解途径, 释放出大量的噬菌体, 得到的重组DNA 的拷贝数就会很多。缺点: (1) 包装比较麻烦, 包装率不稳定, 购买包装蛋白的费用高; (2) 没有质粒的用途广泛。
43以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时, 为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体?
答: 改造的置换型噬菌体载体, 重组入外源片段之后, 总体积不能超过入基因组的105％, 不能小于又基因组的75％。以置换型λ噬菌体DNA 作为载体, 首先要分离左、 右两臂同外源DNA 重组。如果没有外源片段, 仅是两臂连接, 长度短于久基因组的75％, 不能被包λ噬菌体颗粒, 就不能感染寄主, 也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后, 总长度超过λ基因组105％后, 也不能包入噬菌体颗粒, 自然也不能形成噬菌斑。

44M13 系列载体具有哪些优缺点?
答: M13 克隆系统具有很多优点:
(1) 克隆的片段大: M13 噬菌体的DNA 在包装时不受体积的限制, 因此容载能力大。有报道, 有些噬菌体颗粒能够包装比野生型丝状噬菌体DNA 长6～7 倍的 DNA(插入片段可达40kb)。(2)可直接产生单链DNA, 这对于DNA 测序、 DNA 诱变、 制备特异的单链DNA 探针都是十分有用的。(3) 单链DNA 和双链DNA 都能够转染宿主, 并可根据人工加上的选择标记进行筛选。
M13 克隆系列的不足: (1) 较大的外源片段插入后, 在扩增过程中往往不够稳定。一般说, 克隆的片段越大, 发生丢失的概率越大。(2) 单链载体分子感染的细胞中, 往往是单链和双链混杂, 分离双链比较麻烦。
45黏粒载体具有哪些特点与不足?
答: 主要特点有: ① 柯斯质粒是含有λ噬菌体 COS 位点的质粒载体。柯斯质粒具有质粒的复制子, 进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制, 而且能够被氯霉素扩增。② 具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。③ 插入片段的消化、 连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。④ 具有λ噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同, 重组体像λ 载体一样, 需体外包装后转染细菌。⑤ 包装后形成的 λ 颗粒用来感染大肠杆菌, 重组DNA 像λ DNA 一样注入细菌细胞, 并以COS位点环化。由于缺乏λ 的其它DNA 序列, 环化DNA 在细菌体内以质粒一样维持。⑥ 简化了筛选。载体体积小, 承载外源 DNA 片段大。如果载体的分子质量在5kb 的话, 得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性, 因为要被成功包装, 至少要7 个分子的载体自连。尽管如此, 也是不能被包装的, 因为COS 位点太多了。重组体只有达到32-45kb 才能有效包装体外包装, 这就提供了对重组体的正向选择。⑦ 对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。⑧ 感染后形成菌落, 而不是噬菌斑。
黏粒载体也有如下不足: ① 如果两个黏粒之间有同源序列, 可能会发生重组, 结果会使被克隆的片段重排或丢失。
② 含不同重组 DNA 片段的菌落生长速度不同, 会造成同一个平板上菌落大小不一。另外由于不
同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同, 会造成文库扩增量的比例失调。
③ 包装过程复杂, 包装效率不稳定, 代价高。

47分离DNA 用酚抽提蛋白质时, 离心后, 为什么蛋白质总是停留在水相和酚相之间?
答: 酚使蛋白质分子间脱水而变性, 变性蛋白的密度比水大, 但比酚小, 因此停留在中间层。
39λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件? 为什么? 答: ①两个cos 位点; ②线性DNA; ③分子大小在λ噬菌体基因组的75%～105%。
48为什么从细胞中分离DNA 时往往会断裂?
答: (1) 胞内存在很高的核酸酶活性, DNA 裸露后, 很容易遭到核酸酶的降解。(2) 在分离DNA 的过程中, 要用到一些酸碱等化学试剂, 也会使DNA 断裂。(3) 在DNA 的分离过程中要经过多次离心、 吸取、 转移等, 产生的机械张力剪切会使DNA 断裂。

49在DNA 分离过程中, 酚一般与氯仿联合使用, 即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次, 为什么?
答: 原因是酚和水有一定程度的互溶, 因此单独使用酚抽提DNA, 最终不能除去酚, 残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白质变性剂, 它不与水互溶, 可是能够同苯酚互溶。这样, 酚和氯仿联合使用, 就能够带走残留的酚。
50何谓简并引物 (degenerate primer)?
答: 所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列), 并充分考虑密码子的简并性而设计的、
用于PCR 扩增的混合引物群体, 这种混合引物之间具有不同的碱基组成, 但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性, 在这种混合引物中必定有一种引物是能够和该基因的DNA 序列精确互补。
51简并引物设计的一般原则是什么?
答: (1) 选择保守区设计简并引物。(2) 选择简并性低的氨基酸密码区设计引物。(3) 注意密码的偏爱性。(4) 使用尽可能短的引物, 以降低简并性, 最短可用15～20 个碱基。(5) 由于Taq DNA 聚合酶在PCR 扩增时容易掺入错误碱基, 因此设计的引物, 其3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸。
52如何用PCR 制备突变DNA 分子?
答: 可用PCR 进行定点突变 (Site Directed Mutagenesis), 即在特定位点引入点突变。该突变能够是碱基替代、 插入或者缺失。为了在靶基因特定位点导入突变, 在PCR 引物设计时, 将一条引物设计成与靶序列互补但在预期位点作碱基替换或缺失。在引物中的诱发突变序列应该位于引物的5’端或在引物中间部位, 但绝不能位于3’端。诱变引物的3’区域(至少6～10 个碱基)必须与靶DNA 完全互补以使引物与模板的退火完全而且Taq 酶能延伸引物。PCR 反应先在低特异性环境下反应5～10 个循环以使错配得以发生(即在松弛的温度下), 一旦少量的突变模板产生, 就能够作为靶序列与引物完全互补。扩增反应的终产物即是所需的含有突变的扩增DNA 分子, 然后经过克隆和序列分析进行确证。
53 用PCR 技术扩增目的DNA 片段时, 需要一对特意合成的引物来限定目的片段的扩增区域, 试说明引物序列合成应遵循什么样原则。
答: 1) 引物长度一般为15～30 个核苷酸。2) 引物的碱基尽可能随机, G+C 含量一般占45％~55％。Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)
3) 引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。
4) 两个引物之间不应存在互补序列, 特别应避免3’端的互补重叠。5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％, 引物3’末端连续8 个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列, 否则易导致非特异性扩增。6) 引物3’端碱基是引发延伸的起点, 因此一定要与模板DNA 配对。7) 引物与模板结合时, 引物的5’端最多能够游离十几个碱基而不影响PCR 反应的进行。8) 引物的5’端能够修饰, 如附加限制酶位点, 引入突变位点等。
56怎样将一个平末端的DNA 片段插入到EcoR I 的限制位点中去?
答: 能够化学合成一个连接子( linker) , 即一段长为lObp 含有EcoR I 识别位点的短的DNA 片段, 然后与待克隆片段两端连接起来, 如果用EcoR I 切割这种连接片段, 就会产生EcoR I 的单链末端。这种片段就能够插入到任何EcoR I 的限制性核酸内切酶位
55TaqMan 定量 PCR 扩增的原理是什么?
答: TaqMan 定量 PCR 使用3 个引物, 或两个引物和一个特异性探针。两个引物接合到目的DNA上下游, 以进行目的DNA 的合成。第三个引物, 或称探针, 是特异合成的一段短的DNA 片段, 可特异性第接合到一条DNA 链中间。探针带有两个修饰基团, 5’端荧光报告基团( R) 和3’端的荧光淬灭基团( Q) , 这两个基团由于距离靠近会发生荧光淬灭而检测不到荧光。随着PCR 的进行, TaqMan探针接合到目的DNA 序列上, 而且被具有外切酶活性的Taq DNA 酶逐个切除而降解。被切下来的荧光基团( R) 解除了荧光淬灭的束缚, 会在激发光下发出荧光, 因此所产生的荧光强度直接反应了扩增靶DNA 的总量。
54PCR 技术体外扩增DNA 分子的基本原理是什么?
答: PCR 是在试管中进行的DNA 复制反应, 基本原理是依据细胞内DNA 半保留复制的机理, 以及体外DNA 分子于不同温度下双链和单链能够互相转变的性质, 人为地控制体外合成系统的温度, 以促使双链DNA 变成单链, 单链DNA 与人工合成的引物退火, 然后耐热DNA 聚合酶以dNTP 为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR 全过程每一步的转换是经过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA 模板解链、 引物与模板DNA 结合、 DNA 聚合酶催化新生DNA 的合成, 即高温变性、 低温退火、 中温延伸３个步骤构成PCR 反应的一个循环, 此循环的重复进行, 就可使目的DNA 得以迅速扩增。DNA 模板变性: 模板双链DNA®单链DNA, 94℃。退火: 引物＋单链DNA®杂交链, 引物的Tm 值。引物的延伸: 温度至70 ℃左右, Taq DNA 聚合酶以４种dNTP 为原料, 以目的DNA 为模板, 催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA 链延伸反应, 形成新生DNA 链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR, 就是如此重复循环, 使目的DNA 得到高效快速扩增。
57构建基因组文库时为什么要对基因组DNA 进行部分酶切? ( 列举至少两条理由)
答: ①部分酶切可获得长度适宜的片段( 如获得中等长度的酶切片段) ; ②部分酶切可保证切出的DNA 片段内部依然保留了部分限制酶位点, 便于后续的克隆分析。
58什么是基因组文库(genomic library)? 它同遗传学上的基因库有什么不同?
答: 基因组文库是用基因工程的方法, 人工构建的含有某一生物基因组DNA 的各种片段的克隆群。包括下列过程: 高分子质量染色体DNA 的制备; 体外重组连接; 将重组DNA 导入寄主细胞并扩增; 筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene poo1)是指在进行有性生殖的某一群体中, 能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中, 由于使用的载体不同, 分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、 YAC 文库、 BAC 文库等。
61如何使用甲基化酶对克隆DNA 进行保护? 有什么意义?
答: 在构建基因文库时, 可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA 先进行甲基化修饰, 将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。意义: 用这种方法, 不但保护了插入片段的大小不会改变, 又有利于插入片段的回收, 因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来, 重组后能够用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。
59什么是cDNA 文库? 同基因组文库有何差别?
答: 同mRNA 互补的DNA 称为cDNA。cDNA 文库是以某一生物的总mRNA 为模板, 在无细胞系统中, 在反转录酶的作用下, 首先合成一互补的DNA, 即第一链, 破坏RNA 模板后, 再以第一链为模板合成第二链, 得到的双链DNA 称为cDNA。选用适合的载体, 将合成的cDNA 重组导入寄主细胞, 经筛选得到的cDNA 克隆群称为cDNA 文库。由于cDNA 技术合成的是不含内含子的功能基因, 因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表示的时间上并非是统一的, 具有发育的阶段性和时间性, 有些则需要特殊的环境条件。因此, cDNA 文库是不可能构建得十分完全的, 也就是说, 任何一个cDNA 文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。cDNA 文库与基因组文库的主要差别是: (1) 基因组文库克隆的是任何基因, 包括未知功能的DNA 序列; cDNA 文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因, 包括调节基因。(2) 基因组文库克隆的是全部遗传信息, 不受时空影响; cDNA 文库克隆的是不完全 的编码DNA 序列, 因