槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立.docx

槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立【摘要】 目的 为研究口腔黏膜下纤维化的修复机制，建立体外人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型。方法 体外培养口腔黏膜成纤维细胞，并用波形蛋白、角蛋白免疫细胞化学方法鉴定；分别用、 浓度的槟榔提取液对培养的成纤维细胞诱导，法检测细胞增殖。结果 波形蛋白表达阳性，而角蛋白表达阴性；、 槟榔提取物促进口腔黏膜成纤维细胞增殖。结论 培养的细胞为纯化的成纤维细胞，槟榔提取物诱导口腔黏膜成纤维细胞增殖的最佳浓度为 。该模型可为进一步的研究提供实验基础。【关键词】 槟榔提取物；口腔黏膜；成纤维细胞；增殖 ， ， ; 口腔黏膜下纤维化是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性、隐匿性疾病。大量的流行病学调查表明与咀嚼槟榔有密切的关系。成纤维细胞是发病中的主要细胞，是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源，其异常增殖在纤维化疾病形成过程中起非常重要的作用，本实验拟建立槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜增殖模型，旨在为口腔黏膜下纤维化修复机制的研究提供实验基础。现将实验方法及结果报道如下。 材料与方法 材料 药物 槟榔提取物按文献制备，溶于无血清培养液，母液浓度 ， u滤器过滤除菌， 保存。 试剂 ，无支原体胎牛血清；胰蛋白酶；噻唑蓝；二甲基亚砜；产品，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、广谱鼠抗人角蛋白单克隆抗体、免疫组化染色试剂盒。 仪器 二氧化碳培养箱；超净工作台；倒置相差显微镜；酶标仪；多管架自动平衡离心机。 方法 口腔黏膜组织块处理 来源于湖南中医药大学第一附属医院口腔颌面外科手术病人的颊部，要求病人无全身系统性疾病及近期用药史，颊黏膜正常无角化，标本取下后立即放入装有培养液的无菌玻璃瓶内备用， 内处理组织。 的原代培养 采用组织块培养法。新鲜黏膜用含双抗的充分漂洗次，去除血迹及坏死组织，将组织剪成约 大小的组织块，用数滴小牛血清湿润培养瓶底后，用牙科探针将组织块均匀置于瓶底，轻轻翻转培养瓶，使组织块处于悬浮状态，将培养瓶底朝上放置在 ， 培养箱内。放置 ，待组织块贴附后，在瓶内加入 胎牛血清的培养液，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养 后，再往瓶中补加适量培养液。以后每 换液次， 可见爬出组织块， 进行第一次传代。 口腔黏膜的传代及鉴定 待细胞融合面积达进行第一次传代。的胰蛋白酶消化 ，加入含胎牛血清的培养液终止消化，消化液 离心 ，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液，分装于培养瓶后加入含胎牛血清的培养液，按比例传代， 传代次。将第代接种于孔板中，内置预先经明胶处理过的玻片，待细胞融合后，多聚甲醛室温固定细胞 ，法进行细胞免疫化学染色，一抗为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，鼠抗人广谱角蛋白抗体作为阴性对照，实验步骤按免疫组化染色试剂盒进行，显色，常规脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。【摘要】 目的 为研究口腔黏膜下纤维化的修复机制，建立体外人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型。方法 体外培养口腔黏膜成纤维细胞，并用波形蛋白、角蛋白免疫细胞化学方法鉴定；分别用、 浓度的槟榔提取液对培养的成纤维细胞诱导，法检测细胞增殖。结果 波形蛋白表达阳性，而角蛋白表达阴性；、 槟榔提取物促进口腔黏膜成纤维细胞增殖。结论 培养的细胞为纯化的成纤维细胞，槟榔提取物诱导口腔黏膜成纤维细胞增殖的最佳浓度为 。该模型可为进一步的研究提供实验基础。 【关键词】 槟榔提取物；口腔黏膜；成纤维细胞；增殖 ， ， ; 口腔黏膜下纤维化是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性、隐匿性疾病。大量的流行病学调查表明与咀嚼槟榔有密切的关系。成纤维细胞是发病中的主要细胞，是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源，其异常增殖在纤维化疾病形成过程中起非常重要的作用，本实验拟建立槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜增殖模型，旨在为口腔黏膜下纤维化修复机制的研究提供实验基础。现将实验方法及结果报道如下。 材料与方法 材料 药物 槟榔提取物按文献制备，溶于无血清培养液，母液浓度 ， u滤器过滤除菌， 保存。 试剂 ，无支原体胎牛血清；胰蛋白酶；噻唑蓝；二甲基亚砜；产品，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、广谱鼠抗人角蛋白单克隆抗体、免疫组化染色试剂盒。 仪器 二氧化碳培养箱；超净工作台；倒置相差显微镜；酶标仪；多管架自动平衡离心机。 方法 口腔黏膜组织块处理 来源于湖南中医药大学第一附属医院口腔颌面外科手术病人的颊部，要求病人无全身系统性疾病及近期用药史，颊黏膜正常无角化，标本取下后立即放入装有培养液的无菌玻璃瓶内备用， 内处理组织。 的原代培养 采用组织块培养法。新鲜黏膜用含双抗的充分漂洗次，去除血迹及坏死组织，将组织剪成约 大小的组织块，用数滴小牛血清湿润培养瓶底后，用牙科探针将组织块均匀置于瓶底，轻轻翻转培养瓶，使组织块处于悬浮状态，将培养瓶底朝上放置在 ， 培养箱内。放置 ，待组织块贴附后，在瓶内加入 胎牛血清的培养液，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养 后，再往瓶中补加适量培养液。以后每 换液次， 可见爬出组织块， 进行第一次传代。 口腔黏膜的传代及鉴定 待细胞融合面积达进行第一次传代。的胰蛋白酶消化 ，加入含胎牛血清的培养液终止消化，消化液 离心 ，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液，分装于培养瓶后加入含胎牛血清的培养液，按比例传代， 传代次。将第代接种于孔板中，内置预先经明胶处理过的玻片，待细胞融合后，多聚甲醛室温固定细胞 ，法进行细胞免疫化学染色，一抗为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，鼠抗人广谱角蛋白抗体作为阴性对照，实验步骤按免疫组化染色试剂盒进行，显色，常规脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。