槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立.docx

槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立
【摘要】 目的 为研究口腔黏膜下纤维化的修复机制，建立体外人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型。方法 体外培养口腔黏膜成纤维细胞，并用波形蛋白、角蛋白免疫细胞化学方法鉴定；分别用０、５、５０、１００、１５０、２００ μｇ／ｍＬ浓度的槟榔提取液对培养的成纤维细胞诱导，ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果 波形蛋白表达阳性，而角蛋白表达阴性；５０、１００ μｇ／ｍＬ槟榔提取物促进口腔黏膜成纤维细胞增殖。结论 培养的细胞为纯化的成纤维细胞，槟榔提取物诱导口腔黏膜成纤维细胞增殖的最佳浓度为５０～１００ μｇ／ｍＬ。该模型可为进一步的研究提供实验基础。
【关键词】 槟榔提取物；口腔黏膜；成纤维细胞；增殖
〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｎ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｖｉｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ ｋｉｅｒａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ　ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭＴＴ ａｓｓａｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｍｅｎｔｉｎ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｎｄ ＡＮＥ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０ μｇ／ｍＬ ａｎｄ １００ μｇ／ｍＬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡＮＥ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｒｅ ５０ μｇ／ｍＬ－１００ μｇ／ｍＬ． Ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ ｃａｎ ｂｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ; ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ 口腔黏膜下纤维化是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性、隐匿性疾病。大量的流行病学调查表明ＯＳＦ与咀嚼槟榔有密切的关系。成纤维细胞是ＯＳＦ发病中的主要细胞，是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源，其异常增殖在纤维化疾病形成过程中起非常重要的作用［１］，本实验拟建立槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜ＦＢ增殖模型，旨在为口腔黏膜下纤维化修复机制的研究提供实验基础。现将实验方法及结果报道如下。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 药物 槟榔提取物按文献［２］制备，溶于无血清ＤＭＥＭ培养液，母液浓度１０ ｍｇ／ｍＬ，０．２２ uｍ滤器过滤除菌，４ ℃保存。
１．１．２ 试剂 ＤＭＥＭ ，无支原体胎牛血清；胰蛋白酶；噻唑蓝；二甲基亚砜；ｓｉｇｍａ产品，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、广谱鼠抗人角蛋白单克隆抗体、ＳＰ免疫组化染色试剂盒。
１．１．３ 仪器 二氧化碳培养箱；超净工作台；倒置相差显微镜；ＭＫ３酶标仪；多管架自动平衡离心机。
１．２ 方法
１．２．１ 口腔黏膜组织块处理 来源于湖南中医药大学第一附属医院口腔颌面外科手术病人的颊部，要求病人无全身系统性疾病及近期用药史，颊黏膜正常无角化，标本取下后立即放入装有ＤＭＥＭ培养液的无菌玻璃瓶内备用，２ ｈ内处理组织。
１．２．２ ＦＢ的原代培养 采用组织块培养法。新鲜黏膜用含双抗的ＰＢＳ充分漂洗３次，去除血迹及坏死组织，将组织剪成约１ ｍｍ３大小的组织块，用数滴小牛血清湿润培养瓶底后，用牙科探针将组织块均匀置于瓶底，轻轻翻转培养瓶，使组织块处于悬浮状态，将培养瓶底朝上放置在３７ ℃，５％ ＣＯ２培养箱内。放置４～６ ｈ，待组织块贴附后，在瓶内加入１．５ ｍＬ ２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养２４ ｈ后，再往瓶中补加适量培养液。以后每３～４ ｄ换液１次，４～７ ｄ可见ＦＢ爬出组织块，１５～２０ ｄ进行第一次传代。
１．２．３ 口腔黏膜ＦＢ的传代及鉴定 待细胞融合面积达８０％～９０％进行第一次传代。０．２５％的胰蛋白酶消化２～３ ｍｉｎ，加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液终止消化，消化液１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液，分装于培养瓶后加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，按１∶２比例传代， ３～５ ｄ传代１次。将第３代ＦＢ接种于６孔板中，内置预先经明胶处理过的玻片，待细胞融合后，４％多聚甲醛室温固定细胞３０ ｍｉｎ，ＳＰ法进行细胞免疫化学染色，一抗为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，鼠抗人广谱角蛋白抗体作为阴性对照，实验步骤按ＳＰ免疫组化染色试剂盒进行，ＤＡＢ显色，常规脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。【摘要】 目的 为研究口腔黏膜下纤维化的修复机制，建立体外人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型。方法 体外培养口腔黏膜成纤维细胞，并用波形蛋白、角蛋白免疫细胞化学方法鉴定；分别用０、５、５０、１００、１５０、２００ μｇ／ｍＬ浓度的槟榔提取液对培养的成纤维细胞诱导，ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果 波形蛋白表达阳性，而角蛋白表达阴性；５０、１００ μｇ／ｍＬ槟榔提取物促进口腔黏膜成纤维细胞增殖。结论 培养的细胞为纯化的成纤维细胞，槟榔提取物诱导口腔黏膜成纤维细胞增殖的最佳浓度为５０～１００ μｇ／ｍＬ。该模型可为进一步的研究提供实验基础。
【关键词】 槟榔提取物；口腔黏膜；成纤维细胞；增殖
〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｎ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｖｉｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ ｋｉｅｒａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ　ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭＴＴ ａｓｓａｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｍｅｎｔｉｎ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｎｄ ＡＮＥ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０ μｇ／ｍＬ ａｎｄ １００ μｇ／ｍＬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡＮＥ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｒｅ ５０ μｇ／ｍＬ－１００ μｇ／ｍＬ． Ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ ｃａｎ ｂｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ; ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ 口腔黏膜下纤维化是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性、隐匿性疾病。大量的流行病学调查表明ＯＳＦ与咀嚼槟榔有密切的关系。成纤维细胞是ＯＳＦ发病中的主要细胞，是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源，其异常增殖在纤维化疾病形成过程中起非常重要的作用［１］，本实验拟建立槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜ＦＢ增殖模型，旨在为口腔黏膜下纤维化修复机制的研究提供实验基础。现将实验方法及结果报道如下。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 药物 槟榔提取物按文献［２］制备，溶于无血清ＤＭＥＭ培养液，母液浓度１０ ｍｇ／ｍＬ，０．２２ uｍ滤器过滤除菌，４ ℃保存。
１．１．２ 试剂 ＤＭＥＭ ，无支原体胎牛血清；胰蛋白酶；噻唑蓝；二甲基亚砜；ｓｉｇｍａ产品，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、广谱鼠抗人角蛋白单克隆抗体、ＳＰ免疫组化染色试剂盒。
１．１．３ 仪器 二氧化碳培养箱；超净工作台；倒置相差显微镜；ＭＫ３酶标仪；多管架自动平衡离心机。
１．２ 方法
１．２．１ 口腔黏膜组织块处理 来源于湖南中医药大学第一附属医院口腔颌面外科手术病人的颊部，要求病人无全身系统性疾病及近期用药史，颊黏膜正常无角化，标本取下后立即放入装有ＤＭＥＭ培养液的无菌玻璃瓶内备用，２ ｈ内处理组织。
１．２．２ ＦＢ的原代培养 采用组织块培养法。新鲜黏膜用含双抗的ＰＢＳ充分漂洗３次，去除血迹及坏死组织，将组织剪成约１ ｍｍ３大小的组织块，用数滴小牛血清湿润培养瓶底后，用牙科探针将组织块均匀置于瓶底，轻轻翻转培养瓶，使组织块处于悬浮状态，将培养瓶底朝上放置在３７ ℃，５％ ＣＯ２培养箱内。放置４～６ ｈ，待组织块贴附后，在瓶内加入１．５ ｍＬ ２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养２４ ｈ后，再往瓶中补加适量培养液。以后每３～４ ｄ换液１次，４～７ ｄ可见ＦＢ爬出组织块，１５～２０ ｄ进行第一次传代。
１．２．３ 口腔黏膜ＦＢ的传代及鉴定 待细胞融合面积达８０％～９０％进行第一次传代。０．２５％的胰蛋白酶消化２～３ ｍｉｎ，加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液终止消化，消化液１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液，分装于培养瓶后加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，按１∶２比例传代， ３～５ ｄ传代１次。将第３代ＦＢ接种于６孔板中，内置预先经明胶处理过的玻片，待细胞融合后，４％多聚甲醛室温固定细胞３０ ｍｉｎ，ＳＰ法进行细胞免疫化学染色，一抗为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，鼠抗人广谱角蛋白抗体作为阴性对照，实验步骤按ＳＰ免疫组化染色试剂盒进行，ＤＡＢ显色，常规脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。