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126例急性白血病异常免疫表型分析 作者：贺景娟,李耀华,孙雪静,万岁桂,徐娟,苏力,田丁【摘要】 白血病细胞异常免疫表型是区别于正常造血细胞的重要特征之一，也是流式细胞术检测微小残留病的基础。为了了解急性白血病的异常免疫表型特征，本研究采用四色流式细胞术CD45/SSC双参数散点图设门技术对126例急性白血病患者的异常免疫表型进行分析，并初步探讨其在微小残留病检测中的意义。结果显示：约76的患者可以检测到明确的异常抗原表达，白血病异常免疫表型可分为以下四类：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达，其阳性率分别为39、46、21和29。约11的患者仅发生了单一的表型异常，其余患者则可以检测到两类或 急性白血病 Aberrant Immunophenotypes in 126 Patients with Acute Leukemia Abstract The existence of leukemia aberrant immunophenotypes (LAIP) has been suggested to be a valuable tool for the detection of minimal residual disease (MRD), as they could distinguish leukemic cells from normal hematopoietic progenitors. This study was purposed to analyze the characteristics of LAIP in acute leukemia and further explore the proportion of different types of LAIP in acute leukemia patients. Flow cytometry (FCM) with four color and CD45/SSC gating were used to detect the antigen expression in samples of bone marrow from 126 patients with acute leukemia. The results showed that definite LAIP could be detected in about 76% patients. The LAIP could be divided into four groups as crosslineage antigen expression, asynchronous antigen expression, antigen overexpression and antigen lack expression. The percentages of these LAIPs were 39%, 46%, 21% and 29% respectively. About 11% out of analyzed cases showed the existance of only one aberrant phenotype while two or more of aberrant phenotypes could be detected in majority cases. It is concluded that the LAIP with four subgroups can be detected in the majority of patients with acute leukemia and immunophenotyping based on LAIP is applicable for the detection of MRD. Key words acute leukemia; leukemia aberrant immunophenotype; minimal residual disease 急性白血病是一种克隆性恶性增殖的血液系统疾病，恶性细胞抗原的表达具有很大的异质性。异常表达的抗原不仅在初发的白血病细胞中可以检测到，而且在治疗后达到形态学完全缓解时，残存的白血病细胞仍保留其初发时的抗原异常表达1。白血病细胞的克隆性增殖特征为临床白血病免疫分型诊断及微小残留病检测提供了更准确依据。 白血病细胞上异常表达的抗原称为白血病异常免疫表型,LAIP是白血病细胞与正常造血细胞相区别的重要特征之一，也是流式细胞术免疫分型诊断及MRD检测的基础。综合文献报道2-6，LAIP主要包括以下4种类型：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达。本研究采用四色流式细胞术及CD45/SSC双参数散点图设门的方法对126例急性白血病患者进行了全面的异常免疫表型分析，以期对急性白血病的临床诊断及MRD的检测提供帮助。 材料和方法 病例资料 126例急性白血病患者来源于宣武医院血液科1999年11月-2006年06月期间的门诊或住院病人，其中男性71例，女性55例，中位年龄46岁。所有患者都经骨髓形态学、细胞化学及流式细胞术免疫分型诊断。FCM分型中髓系、淋系列抗原确定标准参照EGIL评分7, 形态学诊断及分型标准参见白血病的诊断及疗效标准8。FAB亚型诊断结果：M1/M2 78例，M4/M5 17例，M6/M7 5例，BALL 17例以及TALL 9例。由于多数急性早幼粒细胞白血病异常免疫表型不明显9，因此未将M3纳入研究范围。 实验材料 单克隆抗体 初发急性白血病患者FCM免疫分型检测所需抗体基本资料见表1。流式细胞仪 FACSCalibur型，功率为15 MW，激光光源采用氩离子气体激光器，波长为488 nm，进行PE、FITC、PerCP等荧光素的检测，另配有小功率半导体激光器，波长为635 nm，进行APC的检测。结合两个物理参数，前向散射光及侧向散射光，可进行4色6参数的综合分析。 实验方法 标本处理、单克隆抗体标记 骨髓液直接免疫荧光标记法。采集初发急性白血病患者的骨髓液3-5 ml，肝素抗凝，用PBS，pH值稀释后调节细胞浓度至107/ml，室温下进行单克隆抗体标记，详见荧光抗体标记说明书。每次检测各种荧光素均设定相应抗体的同型阴性对照。 初发患者免疫分型抗体组合 免疫分型抗体组合见表2。实验各管均加入CD45PerCP以进行CD45/SSC双参数散点图设门。 上机检测 每次细胞获取前先用FACScomp自动软件分析标准荧光微球以校准仪器。样本收集及结果分析均采用CellQuest软件进行。由于白血病样本通常存在异常的散射光特征及较强的自发荧光，部分患者样本在数据获取前须进行条件设置优化：作FSC/SSC二维散点图，调节FSC增益及SSC检测电压，使不同细胞群既能全部显示在散点图内，又可清楚区分，同时调节FSC阈值去除大部分碎片。初诊患者每管收集10 000个细胞。所有检测均采用CD45/SSC双参数散点图框定白血病细胞的位置，再对门内细胞进行各种荧光抗体的分析。设门内细胞大于相应阴性对照20确定为抗原阳性表达。 统计学分析 采用Epidata 软件两次输入数据并校准，应用STATA 软件包进行统计学分析，本研究中数据假设检验均采用双侧检验，以作为显着性检验的标准。 结 果 126例初发非M3患者免疫表型分析显示，96例存在明确LAIP，其中14例患者仅见单一的LAIP类型，其余患者均可见两类或更多的表型异常。各类异常表型的分布与FAB亚型无明显相关。 抗原跨系列表达 49例患者存在明确的抗原跨系列表达，在伴淋系抗原表达的AML病例中，CD7+ 24例、CD19+ 11例。伴髓系抗原表达的ALL病例中，CD13+、CD33+和CD117+的例数分别为6、4和2例。在图1上一行的AMLM2患者的流式细胞图中可见髓系幼稚细胞群表达CD33同时又跨系列表达CD7，而下一行的正常对照者图中无CD33/CD7共表达细胞群。 Figure 1. Crosslineage antigen expression (CD7+ AMLM2). 抗原跨阶段表达 58例患者可见抗原跨阶段表达,在AML病例以CD34+CD11b+共表达和CD34+CD56+共表达两种异常最多见，跨阶段异常在ALL较少见，仅2例见CD34+CD20+共阳性的异常表型。在图2上一行为AMLM1患者的流式细胞图中可见幼稚髓系细胞群同时表达CD34和CD11b，而下一行为健康对照者图中，无异常表达的细胞群。 Figure 2. Asynchronous antigen expression (AMLM1).抗原过度表达异常 27例患者可见抗原过度表达异常，在AML病例以CD34、CD11b、CD56及CD117的过度表达为主。CD10和CD7分别是BALL和TALL中最常见的过度表达抗原。在图3上一行TALL患者的流式细胞图中可见幼稚淋系细胞群过度表达CD7，而下一行健康对照者图中则无。 Figure 3. Antigen overexpression (TALL). 抗原的缺失表达异常 37例AML患者可以检测到抗原的缺失表达异常，以CD13、CD33及HLADR等抗原易见。9例 BALL患者可见的CD45表达缺失或明显减弱，1例TALL患者呈CD2表达缺失。图4的上一行为AMLM2患者流式细胞图中幼稚髓系细胞群HLADR表达缺失，而健康对照者图中可见HLADR表达。 讨 论 Foon等10于1986年首次在Blood杂志上报道了利用FCM免疫分型方法诊断白血病与淋巴瘤。1997年，Borowitz等11首次拟定了利用FCM免疫分型法诊断白血病的诊断标准。近年来，FCM已由当时代表科技潮流的高精仪器变为现在血液系统恶性疾患诊治中不可缺少的检测工具。 本组126例初发非M3急性白血病患者免疫分型结果显示，约76的患者初发时存在异常免疫表型，AML与ALL分别为69和88。AML异常表型的阳性率略高于Macedo等12的报道，可能与对某些异常表型确定标准的差异有关，例如，Macedo等未将CD117+CD15+的抗原组合列入异常表型范围，但我们的经验是，正常骨髓中CD117+CD15+双阳性细胞的比例%，可以作为一种异常的免疫表型与正常造血细胞相区别。早期报道关于AMLLAIP的数据明显较低，可能与对异常免疫表型的认识不足及标记的荧光抗体较少有关。 关于各类LAIP的报道存在很大差异。跨系列表达异常的发生率总体在5-60，本研究中，Ly+AML的阳性率在34左右，而MyALL则高达71，病例数较少和不同的人种特点可能是部分原因。AML中发生最多的淋系抗原是CD7，阳性率达到31，远高于CD19、CD2、CD22等淋系抗原，而且CD7在所有的AML亚型均有表达，后者则仅见于M2亚型，因此CD7在AMLMRD检测中应用的机会最大。同时也说明，在初发AML患者免疫分型标记的抗体谱中，CD7的标记较其它淋系抗原更有意义。在ALL中发生率最高的髓系抗原是CD13，其次分别为CD33和CD117，与相关报道14,15不完全一致，他们认为CD13较CD33更有髓系特异性，在My+ALL中CD33的表达 1Ward MS. The use of flow cytometry in the diagnosis and monitoring of malignant hematological disorders. Pathology， 1999; 31:382-392 2San Miguel JF, Vidriales MB, LopezBerges C, et al. Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identifies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratification. Blood， 2001; 98:1746-17513Campana D, CoustanSmith E. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytometry. Cytometry, 1999; 38:139-1474李建勇, 阮长耿, 郑列林等.219例成人急性白血病免疫表型特点. 中国实验血液学杂志, 1996；4：39-415孙秀丽, 方美云, 姜凤等. 免疫分型用于68例急性白血病的分型. 中国实验血液学杂志, 2006；14: 39-416王兴兵，姚军霞，郑金娥等，115例急性髓细胞白血病多参数流式细胞术免疫表型分析。中国实验血液学杂志，2005;13：250-2537Bene MC, Castoldi G, Knapp W, et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemia. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). 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