急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2-3.docx

急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2，3【摘要】 为了探讨急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2，3-双加氧酶参与肿瘤免疫逃逸的机制，从23例急性髓性白血病患者获取骨髓细胞，采用免疫组织化学染色法和RT-PCR法检测白血病细胞IDO的表达；在有或无1-甲基色氨酸存在下，以白血病细胞为刺激细胞，外周T淋巴细胞为反应细胞建立单向混合淋巴细胞反应体系，利用MTT法检测T淋巴细胞增殖率，并以反相高效液相色谱法检测相应MLR体系上清液中的IDO活性。结果显示，在23例急性髓细胞白血病患者中17例患者的骨髓白血病细胞上有IDO的表达；白血病细胞上的IDO活性抑制MLR体系中T淋巴细胞的增殖。结论：白血病细胞表达的IDO活性能阻抑外周T淋巴细胞的增殖，它可能参与了肿瘤免疫逃逸。【关键词】 急性髓细胞性白血病Indoleamine 2，3-Dioxygenase Activity in Acute Myeloid Leukemia Cells Contributing to Tumor Immune EscapeAbstract This study was aimed to investigate the mechanism of indoleamine 2，3-dioxygenase (IDO) activity in acute myeloid leukemia cells contributing to tumor immune escape. Myeloid leukemia cells were isolated from bone marrow of 23 patients with acute myeloid leukemia (AML) and IDO expression was detected by immunochemistry and RT-PCR methods. Then mixed lymphocyte reaction (MLR) of one way was carried out，leukemia cells were used as stimulating cells and T-lymphocytes were used as reactive cells in culture with or without 1-MT. T-lymphocyte proliferation rate was determined by MTT assay and IDO activity in supernatant of MLR was detected by high-performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that IDO expression was found in 17 out of 23 cases of acute myeloid leukemia cells; IDO enzyme activity in leukemia cells inhibited T-lymphocyte proliferation in MLR cultures. It is concluded that IDO activity expressing in leukemia cells can suppress T-lymphocyte proliferation responses，which may be contributing to tumor immune escape.Key words acute myeloid leukemia; indoleamine 2，3-dioxygenase; T-lymphocyte; 1-methyltryptophan; immune escape肿瘤免疫逃逸指肿瘤细胞通过某种机制躲避免疫系统对其监视与杀伤，从而导致肿瘤的发生和复发的现象，迄今为止参与肿瘤的免疫逃逸的具体分子机制尚不清楚1。近年的研究发现，小鼠胎盘滋养层细胞吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)是防止母鼠异基因细胞对胎鼠的免疫排斥反应中的必要因素2。同时还发现，抗原呈递细胞如巨噬细胞、DC上IDO能通过抑止T淋巴细胞的增殖而在免疫系统的反应调控中发挥着重要的作用3。另有学者发现，人宫颈癌细胞系HeLa细胞与外周血淋巴细胞共培养后，外周血淋巴细胞在IL-2作用下的增殖能力明显被抑制4。基于以上的研究，我们获取急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者的骨髓细胞，观察IDO在白血病细胞上表达情况及表达的IDO活性与外周T淋巴细胞的免疫应答关系，以探讨IDO参与肿瘤免疫逃逸机制并为肿瘤免疫治疗提供一定的实验依据。材料和方法细胞准备病例资料23例急性髓细胞白血病骨髓标本均取自在本科住院的初发病人，患者的诊断均符合诊断标准，其中男性13例，女性10例，中位年龄29(19-54)岁。根据MIC分类标准，23例AML中：M2a 4例，M2b 3例，M3 5例，M4a 5例，M5a 3例，M5b 3例。10例正常人作为对照。骨髓白血病细胞的分离经过肝素抗凝的骨髓，用D-Hank液倍比稀释后，以淋巴细胞分离液(Ficoll， g/ml)梯度离心(400g，20分钟)，吸取中间单个核细胞层以用于下一步实验。外周血单个核细胞的分离取经肝素抗凝健康人的外周血，采用淋巴细胞分离液(Ficoll， g/ml)行密度梯度离心分离法分离PBMNC，台盼蓝染色计数细胞存活率95%。用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1109/L备用。刺激细胞的制备取分离的骨髓白血病细胞，加入终浓度为25 mg/L的丝裂霉素C，37水浴，孵育30分钟，用完全培养液洗3次，去除残余的丝裂霉素后用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1109/L备用。反应T淋巴细胞的分离培养取分离的PBMNC，注入T 细胞尼龙毛柱，37孵育1小时，用RPMI 1640培养液冲洗出非黏附细胞即主要为T淋巴细胞，洗涤后重悬于10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度为1109/L备用。白血病细胞IDO蛋白表达的免疫组织化学检测应用SP9000链酶卵白素过氧化物酶试剂盒进行组织化学检测骨髓细胞IDO蛋白表达。具体方法 含3 22的甲醇溶液封闭10分钟，以消除内源性过氧化物酶。山羊血清工作液室温孵育15分钟，去血清后加入抗IDO单克隆抗体，置于湿盒中4过夜，用PBS洗3次，加生物素标记的二抗(羊抗鼠IgGBio)工作液，37孵育15分钟，再与辣根酶标记链酶卵白素工作液 (S-A/HRP)在37下作用15分钟，用DAB试剂盒显色10分钟。阴性对照用PBS代替IDO单克隆抗体，实验对照用正常人骨髓细胞甩片，进行免疫组织化学染色。骨髓细胞IDO mRNA表达的RT-PCR检测细胞总RNA的提取 TRIZOL一步法提取细胞总RNA，操作按说明书进行。紫外分光光度仪测定RNA的A260/A280值。cDNA第一链的合成逆转录反应体系为20 l，其中5逆转录缓冲液4 l，核糖核酸酶抑制剂1 l，10 mmol/L dNTP 2 l，寡聚T引物1 l，细胞总RNA 5 g，M-MLV1 l ，用DEPC-双蒸水补充至20 l。反应条件为42水浴1小时，然后70水浴10分钟以灭活逆转录酶。PCR 引物的设计根据GenBank库中IDO的cDNA序列进行3。IDO上游引物： 5-GCAAATGCAAGAACGGGACAC-3；下游引物: 5-TCAGGGAGACCAGAGCTTTCACAC-3；扩增片段463 bp。内参照为GAPDH，其上游引物：5- TATGATGACATCAAGAAGGTGG -3；下游引物：5- CACCACCCTGTTGCTGTA-3，扩增片段213 bp。反应体系50 l，其中10PCR缓冲液5 l，cDNA 2 l，Taq DNA聚合酶1 l，2 mmol/L dNTP 5 l， mol/L上游及下游引物各1 l， mol/L内参照上游及下游引物各1 l，25 mol/L MgCl2溶液4 l。扩增条件：首次94预变性3分钟，然后94变性45秒钟，62退火45秒钟，72延伸1分钟，循环30次，最后72延伸4分钟。取扩增产物5 l，用2%的琼脂糖凝胶电泳，以100 bp为分子量标准，在300 nm紫外光下摄影，进行条带分析。单向混合淋巴细胞反应(MLR)分别取2104刺激细胞于有或无1mmol/L的1-甲基色氨酸37水浴1小时、2105 T淋巴细胞，接种96孔板行MLR，加入200 U/ml的IL-2，每实验组设3个复孔，另设刺激细胞、T淋巴细胞以及1640完全培养液培养空白对照。将实验组与对照组细胞于37 、5% CO2 孵育培养5天，培养结束前6小时加入2 0 l浓度为5 mg/ml的MTT液，离心培养板，弃上清100 l，加入等量DMSO，震荡5分钟，酶标仪490 nm处测吸光度()值。淋巴细胞增殖率(%)=100%。IDO活性的反相高效液相色谱检测留取上述混合淋巴细胞培养后的上清液用于检测IDO活性，按参考文献5并略作改动。IDO活性以色氨酸的特异代谢产物犬尿氨酸的百分数来表示。特异代谢率(%)=(K-C)/(T-C)100% 。式中K:样品特异降解的犬尿氨酸浓度;T:实验培养液中色氨酸的起始浓度;C:样品中非特异性降解的犬尿氨酸浓度。检测波长sig =360 nm时，以紫外检测器检测犬尿氨酸;ex=285，em=365时，以荧光检测器检测色氨酸。统计学处理采用SASfor windows统计软件进行数据处理。实验数据以均值标准差 表示，组间均数比较用t检验，以P为具有显着性意义。结 果白血病细胞IDO的表达对获取的23例AML患者的骨髓白血病细胞进行免疫组织化学染色检测，其中17例患者的白血病细胞上有IDO抗原表达，而正常人骨髓细胞(n=10)未能检测到IDO抗原的表达。我们用RT-PCR方法检测23例AML患者的骨髓白血病细胞上IDO mRNA的表达，同样只有17例白血病细胞有IDO mRNA的表达，正常人(n=10)没有该基因的表达。白血病细胞抑制IL-2作用下T淋巴细胞的增殖建立单向MLR培养体系观察白血病细胞与外周T淋巴细胞的免疫应答关系。结果显示，在淋巴细胞生长因子IL-2的刺激下，单独T淋巴细胞培养的T淋巴细胞的增殖率为()%。无1-MT存在时，患者白血病细胞(n=17)与外周T淋巴细胞共培养的MLR体系中T淋巴细胞的增殖率为()%；当加入1-MT后，白血病细胞(n=17)与T淋巴细胞共培养的MLR体系中T淋巴细胞的增殖率为()%，二者比较有显着性差异。白血病细胞的IDO活性对T淋巴细胞增殖活性的影响取上述的MLR体系的上清液采用反相高效液相色谱检测IDO活性。结果显示，在无1-MT存在的共培养体系中IDO活性为()%；当加入1-MT后，IDO活性则为()%，二者比较有显着性差异。而单独的白血病细胞培养体系(n=17)中IDO活性与无1-MT存在的共培养体系中相似()% ；在单独T淋巴细胞培养体系中未能检测到功能性的IDO活性。讨论恶性肿瘤细胞具有抵抗凋亡和无限繁殖的能力，肿瘤患者的免疫系统不能有效地清除或杀伤癌细胞，使其得以逃避免疫监视而长期存活。自Taylor等6提出IFN-对肿瘤生长的抑制是由其诱导色氨酸代谢所致的观点后，对肿瘤相关的IDO表达的研究开始倍受关注。Mollor等7发现，经转染后表达IDO的小鼠肿瘤细胞能使与其共培养的T细胞表达活化标志如CD69，但却抑制T细胞增殖。在本研究中，获取23例AML患者骨髓白血病细胞，通过免疫组织化学染色法检测其IDO的蛋白表达，其中17例患者的白血病细胞有IDO抗原的表达，且细胞来源不同，其IDO抗原表达存在差异；同时采用RT-PCR法检测患者白血病细胞上IDO mRNA 的表达，同样只有这17例白血病细胞能检测到IDO基因的表达；在体外单独白血病细胞培养体系中(n=17)，我们还能检测到IDO活性()%。以上结果表明，这些患者白血病细胞不仅在分子水平上表达IDO，而且表现出有功能的IDO活性。 IDO是肝脏以外唯一可催化色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶。体内、外研究都表明，抗原呈递细胞如巨噬细胞、DC上IDO能够抑制细胞增殖，是机体天然存在的免疫抑制机制3。一般认为，IDO抑制细胞增殖的原因是它降解色氨酸，造成缺乏Trp的微环境；Trp缺乏对一般细胞影响似不明显，而T细胞由于存在1个对Trp敏感的检查点，在Trp缺乏的环境下细胞增殖停止并滞留于G1期中间8。由此，我们设想白血病细胞上的IDO活性是否也与T细胞的增殖有关系。我们建立混合淋巴细胞培养体系来进行研究，结果发现白血病细胞与外周T淋巴细胞共培养后，T细胞的增殖率在淋巴细胞刺激因子IL-2的作用下显着下降。加入IDO的特异性抑制剂1-甲基色氨酸后，不仅白血病细胞的IDO活性能较好的被抑制，而且T细胞的增殖率基本可以恢复到非共培养的水平。Uyttenhove等9的研究发现，部分实体肿瘤细胞高表达的IDO抗原使局部淋巴细胞增殖受抑，从而介导肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。本研究的结果与其结果一致，证实了血液系统的恶性肿瘤细胞亦表达IDO，并可能通过降解局部环境中的Trp而间接抑制T细胞的增殖，使T细胞活化信号转导受阻，从而诱导白血病细胞发生免疫逃逸。 肿瘤免疫逃逸是当今有效肿瘤免疫治疗的主要障碍，人们针对肿瘤免疫逃逸的机制，致力于研究多种免疫治疗方案，如肿瘤疫苗、过继免疫治疗、肿瘤基因治疗等，以提高肿瘤的免疫原性，激发机体的特异性和非特异性免疫应答，促进肿瘤的消亡。相对于这些治疗方案，小分子药物有安全性高、容易生产、费用低等优势。已有研究表明，在体外IDO的特异性抑制剂1-MT能增强肿瘤细胞对T细胞的免疫刺激的敏感性，而在体内的动物模型中1-MT能延缓肿瘤细胞的生长和增强化疗药物的抗肿瘤效应10，11。实验结果也证实了1-MT能增强外周T淋巴细胞的增殖。因此，对IDO介导肿瘤免疫逃逸机制以及1-MT调控IDO活性机制进一步的深入研究将为小分子免疫药物-IDO的特异性抑制剂运用到肿瘤免疫治疗中开辟新途径。 综上所述，本研究的结果证实了白血病细胞表达的IDO活性可阻抑外周T淋巴细胞的增殖，它可能参与了肿瘤免疫逃逸。这为IDO介导肿瘤免疫逃逸及肿瘤免疫治疗提供了实验基础和新的思路。 【参考文献】 1Gabrilovich D，Pisarev V. 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