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正交法优化植物生长调节剂在黄芪愈伤组织生长中的应用【摘要】 目的研究膜荚黄芪叶愈伤组织诱导、生长及黄芪多糖合成的最佳生长调节剂组合。方法以膜荚黄芪叶为外植体，运用正交设计研究 6-BA、2,4-D 和 NAA 等3种植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导、培养及黄芪多糖合成的影响。结果分别以诱导率、相对生长速率和黄芪多糖含量为指标，结果表明 NAA 和 6-BA 对愈伤组织诱导率影响显着，6-BA、2,4-D 和 NAA 都对愈伤组织的生长影响显着，2,4-D 和 NAA 对黄芪多糖合成影响显着。结论诱导愈伤组织的最佳培养基为：MS+2,4-D+6-BA+NAA；愈伤组织生长的最佳培养基为：MS+2,4-D+6-BA+NAA；促进黄芪多糖合成的最佳培养基为：MS+2,4-D+6-BA+NAA。【关键词】 膜荚黄芪 植物生长调节剂 愈伤组织 正交设计 黄芪多糖Abstract：ObjectiveTo study the optimum combinations of plant growth regulators in the induction, growth and polysaccharide biosynthesis of callus from the leaves of Astragalus membranaceus (Fisch.)the leaves of Astragalus Membranaceus (Fisch.) Bge as explants, three kinds of plant growth regulators, including 6-BA，2,4-D and NAA, were introduced into callus induction and growth, and polysaccharide biosynthesis by orthogonalparameters, including induction rate，relative growth rate and content of Astragalus polysaccharide, were used as criteria of estimating the efficiency of three regulators, both NAA and 6-BA could induce callus most effectively, three of 6-BA, 2,4-D and NAA all could affect the growth of callus remarkably, and both 2,4-D and NAA could promote the synthesis of polysaccharides effectivelyas compared with 6-BA. ConclusionThe optimal culture medium for callus induction is:MS+2,4-D+6-BA+NAA；The optimal culture medium for callus growth is: MS+2,4-D+6-BA+NAA; and the optimal culture medium for the synthesis of Astragalus polysaccharides is: MS+2,4-D+6-BA+NAA.Key words：Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.； Plant growth regulators； Callus； Orthogonal design； Astragalus polysaccharides 黄芪是豆科黄芪属植物，全世界约二千多种，而我国分布有 278 种、2 亚种 35 变种 2 变型，南北各省区均产1。黄芪的根是重要的中草药，其中膜荚黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.和蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongho licus (Bge.) Hsiao是它的法定基原，为正品。黄芪的药用成分主要是皂苷类、黄酮类和多糖等，在抗衰老、增强免疫力、强心降压等方面有重要的作用2，3。由于长期大量、无节制采挖和环境的污染，造成野生黄芪资源几近枯竭4；而人工栽培的药用黄芪，存在着劳动强度大、品质控制困难以及可耕地减少等限制因素。所以，利用生物技术大规模生产黄芪原材料，满足日益增长的医药市场需要，成为解决黄芪资源不足的重要途径之一。本文以膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.叶片为外植体，应用正交设计实验，研究 6-BA，NAA 和 2,4-D对愈伤组织的诱导、生长和黄芪多糖合成的影响，以期筛选适宜的生长调节剂组合。1 材料与方法1 材料供试为盆栽膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的幼嫩叶片。2 正交实验设计采用L9(34)正交设计，研究 6-BA，NAA和2,4-D等 3 种植物生长调节剂对愈伤组织诱导和生长以及黄芪多糖合成的影响，因素水平见表1。采用 MS 基本培养基，其中含 30 gL-1的蔗糖和 8 gL-1的琼脂，pH 。本文所有正交实验均用同一实验设计。实验结果用正交设计助手II专业版进行极差分析和方差分析。表1 因素水平3 愈伤组织诱导与培养选取生长良好的黄芪植株，取幼嫩叶片，自来水冲洗干净，75% 酒精消毒 30 s，% HgCl2消毒 7 min，然后用无菌水冲洗 4 次，无菌滤纸吸干水分，切成 cm2 的小块，接种在正交设计的 9 种培养基上培养，每种接 5 瓶，每瓶接 5 片。培养条件采用黑暗培养，(241)。30 d 后统计诱导率。 挑选生长良好的愈伤组织，称重后继代培养。30 d 后称重，按下式计算相对生长速率：相对生长速率(Rr) = t-11n 其中：W 1为接种时愈伤组织鲜重；W 2为收获时愈伤组织鲜重；t为愈伤组织培养时间。以上实验均重复两次取平均值。4 多糖含量测定 提取5将愈伤组织在 50 下烘干至恒重，粉碎，准确称取g，用滤纸包好置索氏提取器中加入适量70% 的乙醇提取 3 h 。滤纸包挥干乙醇，放于小烧杯中加入 20 倍量的去离子水超声波提取 110 min 。水提液浓缩定容于25 ml 的容量瓶中备用。 含量测定采用蒽酮比色法，按照文献6中的方法测定黄芪多糖。2 结果3 种植物生长调节剂对愈伤组织诱导率的影响黄芪叶片诱导 3 d 时边缘开始膨胀，第 7 天时边缘处长出愈伤组织。培养到 30 d 时，3 号、5 号和 8 号培养基全部诱导出愈伤组织，诱导率为 100%。其中 3 号诱导出的愈伤组织质地疏松，生长较快。结果见表2。表2 愈伤组织诱导、生长和多糖含量结果表3 极差分析正交实验结果表明，不同生长调节剂组合对黄芪愈伤组织诱导的效果差别较大。如表3极差分析结果所示，3种植物生长调节剂对愈伤组织的诱导效果的大小顺序是NAA6-BA2,4-D。对诱导率进行方差分析。结果表明 NAA 因素影响高度显着，6-BA 因素显着，而 2,4-D 因素不显着。通过诱导率的极差和方差分析，最佳的组合是 A1B2C3。通过实验验证得知，该组合对愈伤组织的诱导率为 100%，并且生长良好。表4 方差分析3种生长调节剂对愈伤组织生长的影响挑选生长良好的愈伤组织继代培养 30 d 收获，称重，计算相对生长速率，结果见表 2 及极差分析见表 3 。结果表明，愈伤组织在不同培养基中生长速度不同，生物量有很大的差异，其中组合 3 为最佳水平组合，相对生长速率达2。表 5 示相对生长速率方差分析的结果，表明 3 个因素对愈伤组织生长的影响都显着，其顺序是 6-BA2,4-DNAA。表5 方差分析(相对生长速率)3种生长调节剂对黄芪多糖合成的影响由黄芪愈伤组织中的黄芪多糖含量与极差分析可知组合4的样本中多糖含量最高，为干重的 %，但经极差分析可知产黄芪多糖最多的组合应该是 A2B2C2 组合。它不在本正交设计表内，理论上它应该达到%以上，其真实值有待于进一步验证。 多糖含量的方差分析结果见表 6。由表6可知，2,4-D 和 NAA 对黄芪多糖合成的影响显着，6-BA 的影响不显着，其影响大小顺序为 NAA2,4-D6-BA。表6 方差分析3 讨论本研究初步筛选出影响黄芪愈伤组织诱导、生长和多糖合成的主要因素，优化出了理论上的最佳植物生长调节剂配方。植物生长调节剂对植物离体培养具有非常重要的调控作用，选择合适的生长调节剂种类和浓度是愈伤组织诱导和生长的关键因素7。本文结果表明 NAA 与 6-BA 在诱导愈伤组织的过程中起着决定性的作用，生长素与分裂素配合使用更有利于愈伤组织的诱导，但2,4-D 的影响不显着。张爱娟等8在研究内蒙黄芪的组织培养中发现，2,4-D 对愈伤组织的诱导效果优于 NAA，与本文的结果有差异。本实验采用的是盆栽膜荚黄芪叶而张爱娟等采用的是内蒙黄芪的无菌苗，两者的外植体材料不同，再加上她们采用的培养条件与本实验也不完全相同，这些可能是导致两者结论差异的原因。另外，本研究发现 2,4-D 对愈伤组织的诱导影响不显着，并且 2,4-D 对人体有毒副作用，所以可以在黄芪愈伤组织培养基中不添加2,4-D，或者添加毒副作用小、生理活性强的替代品9。【参考文献】 1张东佳,杨永建,赵汝能. 甘肃黄芪属药用植物资源J. 中国野生植物资源,2005,24(1):38. 2吴发宝,陈希元.黄芪药理作用研究综述J. 中药材,2004,27(3):232.3Shao BM,Xu W,Daistudy on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astmgalus membamnaceus,a Chinese medicinal herbJ.Biochem Biophys Res Commun ,2004,20(4):1103.4赵明,段金廒,黄文哲,等.中国黄芪属(Astragalus Linn.)药用植物资源现状及分析J.中国野生植物资源,2000,19(6):5.5张桂娟,江蔚新,陈明小.黄芪叶中有效成分含量的研究J.黑龙江医药,2004,17(3):164.6陈毓荃.生物化学实验方法和技术M.北京:科学出版社,7谢从华,柳 俊.植物细胞工程M.北京:高等教育出版社,8张爱娟,吴文娟,吴乃居,等.内蒙黄芪的组织培养及有机锗对其作用影响的研究J. 中草药,1991,22(l):31.9崔月花,吴晓霞,夏 铭.黄芪培养系统的建立及皂苷合成的研究进展J.中草药,2001,32(5):464.