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成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察
【摘要】 目的：探索成人脂肪组织来源的间充质干细胞体外分离、培养方法，并化学诱导使其向心肌细胞分化，为心肌再生医学提供理想的种子细胞来源. 方法：体外分离成人ADMSCs并进行传代培养，5氮胞苷诱导其向心肌细胞分化. 分别于诱导后14，21，28 d时用免疫细胞化学染色、RTPCR法进行心肌细胞鉴定. 结果： ADMSCs经5aza诱导后14 d时细胞形态趋向于心肌细胞，诱导28 d免疫细胞化学显示心肌特异性肌钙蛋白I、结蛋白表达阳性，RTPCR检测心肌β肌球蛋白重链基因表达阳性. 结论：成人脂肪组织存在丰富的间充质干细胞且易于分离扩增，体外5aza诱导可使其向心肌细胞分化，可做为心肌再生医学的理想种子细胞.
【关键词】 间充质干细胞；脂肪组织；细胞分化；心肌细胞
0引言
近年有关干细胞移植技术的研究进展对临床治疗心肌终末期疾病带来了前所未有的希望. 国外已有动物实验及小规模临床试验显示自体骨髓间充质干细胞移植入坏死心肌后可改善心功能［1-2］. 但由于BMMSCs来源有限，其广泛临床应用受到限制. 新近研究发现，同样来源于中胚层的脂肪组织中亦含有一种多向分化潜能干细胞，这种细胞群更易分离，细胞数量多，可以发挥替代BMMSCs的作用［3-6］. 本实验我们通过体外分离脂肪组织源性间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells，ADMSCs)并传代扩增，在体外特定条件下定向诱导，探讨其向心肌细胞分化的潜能.
1材料和方法
1．1材料新鲜脂肪组织，高糖DMEM培养基，胰蛋白酶，Ⅰ型胶原酶，优质胎牛血清，5氮胞苷，鼠抗人心肌特异性肌钙蛋白I及Desmin mAb，FITC标记羊抗鼠二抗，总RNA抽提试剂盒，RTPCR试剂盒.
1．2方法
原代细胞分离培养外科手术室无菌条件下取大网膜脂肪组织约100 mg，去除包膜及血管组织，PBS(含2×105 U/L青霉素和200 mg/L链霉素)冲洗3次以洗去红细胞的污染，眼科剪剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，加 g/L胰蛋白酶5 mL,　g/L Ⅰ型胶原酶5 mL，37℃恒温水浴箱振荡消化60 min，弃上层脂肪及上清，加含150 mL/L FBS的DMEM培养基10 mL吹打成混悬液终止消化，3000 r/min离心10 min，弃上清，最底层细胞层用双抗PBS洗3遍，DMEM培养基吹打混悬，400目细胞筛过滤收集细胞并移至25 cm×25 cm塑料培养瓶中，加完全培养液37℃, 50 mL/L CO2培养箱饱和湿度培养. 24 h后首次换液，去除悬浮细胞. 此后每3日换液1次，1 wk后细胞生长至70%~80%融合时 g/L胰酶消化，按1∶3传代. 相差显微镜逐日观察细胞形态. 取第4代已纯化细胞做以下实验.
体外诱导分化将已传至第4代生长状态良好的细胞用 g/L胰酶消化，DMEM培养液洗涤后制成1×106/cm2浓度的单细胞悬液，重新接种于培养瓶中培养. 24 h后换液去除未贴壁细胞，加入含有10 μmol/L 5aza的完全培养液进行常规培养条件下药物诱导. 作用24 h后吸弃含5aza培养液，以PBS洗涤2次后再改换完全培养液继续培养，每3日换液1次.
1．免疫细胞化学分别取诱导14，21，28 d的细胞于6孔板内细胞爬片行心肌细胞特异抗原cTNI，Desmin的免疫细胞化学鉴定. 细胞爬片用PBS洗3次，冷丙酮固定15 min，PBS振洗3次×5 min，3 g/L TritonX100于37℃、饱和湿度条件下透膜30 min，PBS振洗3次×5 min，100 mL/L无免疫羊血清封闭60 min，分别滴加鼠抗人cTNI及Desmin一抗工作液，湿盒内4℃冰箱过夜，PBS振洗3次×5 min，滴加二抗工作液37℃、湿盒内孵育45 min，PBS振洗3次×5 min洗去未结合二抗，缓冲甘油封片后在荧光显微镜下观察照相. 对照组用未诱导细胞爬片行免疫细胞化学.
1．消化收集诱导前、诱导后14，21，28 d约1×107/L细胞，Trizol法提取各自总RNA，以成人心肌组织做为阳性对照. 以逆转录试剂盒方法步骤逆转录生成cDNA. 以GAPDH为内参照进行PCR扩增. 目的基因心肌β肌球蛋白重链引物按GenBank由软件设计，上游引物为：5′TGCCGAGACTGAGTATGG3′，下游引物为：5′GTTAGACAGGATTTGGTAGAA3′，扩增片段为697 bp. PCR反应总体系50 μL，反应条件为：各反应体系先94℃预变性5 min，接着35个循环扩增,最后延伸7 min至4℃. 完成PCR扩增后产物即行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，经溴化已啶染色后在紫外线激发下观察电泳条带，凝胶成像分析系统照相.
2结果
2．1ADMSCs的形态学特性分离细胞接种于塑料培养瓶时呈大小不一的圆形悬浮于培养液中，24 h后开始贴壁，此时培养物中混有大量悬浮红细胞,随培养时间的延长，这些红细胞随换液次数的增多而被清除. 接种后3 d内，体积较大的细胞大多已贴壁，并开始伸展，多呈梭形成纤维样细胞，部分贴壁细胞呈三角形或多角形，核居中，有1～2个核仁，此时贴壁细胞开始分裂增殖. 约7~8 d细胞融合成单层，经3~4次连续传代后细胞变为均一梭形生长. 5aza诱导后形态变为不规则星状及杆状，细胞体积及胞核变大，有不同方向的长钉状突起伸出，胞质着色加深，类似于心肌样细胞生长(图1B).
2．2免疫细胞化学ADMSCs经5aza诱导后14 d时免疫细胞化学未见有心肌细胞特异抗原cTNI，Desmin表达，继续培养至21 d时见有少量Desmin表达，诱导后28 d时显示cTNI，Desmin均阳性表达，对照组未见表达.
2．3RTPCR结果显示经5aza诱导14, 21 d时PCR产物条带未见有心肌βMHC基因的表达，诱导4 wk细胞心肌βMHC基因明显表达，对照组
　　无表达.

3讨论
近年研究发现成体组织除骨髓中存在MSCs外，其他中胚层来源的组织如骨、软骨、骨骼肌、表皮等诸多组织中亦存在MSCs［7］. Zuk等采用酶消化筛选法A: Desmin表达 ×200；B: cTNI表达 ×200. 成功从成体大鼠脂肪组织中分离出MSCs，研究发现这种细胞体外可迅速扩增，不易衰老. 并发现ADMSCs象BMMSCs同样具有多向分化潜能，在特定条件下可分化为上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞, 甚至可横向分化为外胚层的神经细胞等［3-6］. 本实验在Zuk等的分离方法上略加改进，在Ⅰ型胶原酶的基础上加用等体积的胰蛋白酶并将消化时间延长至60 min，获得较好的效果，细胞呈贴壁生长，增殖速度较快. 实验中发现原代细胞混杂有少量圆形及卵圆形细胞，考虑可能是来自于脂肪组织血管基质成分中的其它细胞，但经3～4次传代后细胞在光镜下呈均一梭形生长. 说明从脂肪组织分离的MSCs成分并不纯，但经传代后可在体外得以纯化.
5aza是现今被公认的能诱导干细胞分化为心肌细胞的最佳诱导药物. Rangappa等［8］用5aza对ADMSCs进行体外定向化学诱导分化为心肌细胞，3 wk时可观察到细胞自发搏动，并证实诱导后的心肌样细胞表达α肌动蛋白, CTnI等心肌细胞特异性标志. 本实验中采用10 μmol/L浓度5aza进行诱导24 h，与对照组比较，相差显微镜下观察1 wk后细胞核呈单核位于中央，胞体变大呈多角形，趋向于心肌样细胞生长. ADMSCs经5aza诱导后21 d免疫细胞化学显示有少量Desmin的表达，诱导后28 d时细胞cTNI表达阳性，PTPCR检测到心肌βMHC表达阳性，说明心肌细胞主要标志物的表达具有时间依赖性. cTNI是心肌肌钙蛋白复合体的亚单位之一，参与钙离子介导的肌肉收缩，在胎儿及成人骨骼肌中不表达；心肌βMHC是构成心肌肌球蛋白的重链结构，均具有高度心肌特异性，是现今公认的用于鉴定心肌细胞的特有分子标志. 因此本实验提示ADMSCs经5aza诱导后在分子水平上已具备心肌细胞的特征性变化.
综合以上实验结果，我们认为脂肪组织中存在大量的具有多向分化潜能的MSCs，其取材较为简便，体外易于分离并可进行迅速扩增，5aza诱导后可向心肌细胞分化，可望成为今后心肌细胞移植的理想细胞来源.
【参考文献】
［1］ Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium［J］. Nature,2001,410(6829):701-705.
［2］ Strauer BE, Brehm M, Zeus T, et al. Intracoronary, human autologous stem cell transplantation for myocardial regeneration following myocardial infarction［J］. Dtsch Med Wochenschr, 2001, 126(3435):932-938.
［3］ Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cellbased therapies［J］. Tissue Eng, 2001，7(2): 211-228.
［4］ Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］. Mol Biol Cell,2002，13(12):4279-4295.
［5］ Mizuno H, Hyakusoku H. Mesengenic potential and future clinical perspective of human processed lipoaspirate cells［J］. J Nippon Med Sch, 2003，70(4):300-306.
［6］ Morizono K, De Ugarte DA, Zhu M, et al. Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehicles［J］. Hum Gene Ther, 2003，14(1): 59-66.
［7］ Minguell JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem cells ［J］. Exp Biol Med, 2001, 226(6):507-520.
［8］ Rangappa S, Fen C, Lee EH, et al. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes ［J］. Ann Thorac Surg, 2003, 75(3): 775-779.