三七总皂苷对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及机制研究_蔡曾晓瑞.pdf

第 卷 第 期 年 月石河子大学学报（自然科学版）（）收稿日期：基金项目：辽宁省高等学校创新人才支持计划项目（）；辽宁省教育厅服务地方项目（）作者简介：蔡曾晓瑞（），女，硕士研究生，专业方向为中药药效学研究。通信作者：代春美（），女，教授，从事中药药理及安全性评价、中药生物质量控制方面的研究，：。：.文章编号：（）三七总皂苷对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及机制研究蔡曾晓瑞，胡相卡，桂留铭，齐沐爽，代春美（锦州医科大学，辽宁 锦州）摘要：目的 探讨三七总皂苷（）对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及作用机制。方法 只 雄性小鼠，分为正常组、模型组和 低（）、中（）、高剂量（）组，每组 只。治疗组小鼠按相应的剂量预保护 后，模型组和 治疗组小鼠以 剂量尾静脉注射碘酸钠溶液，建立小鼠视网膜损伤模型。治疗组继续灌胃给药 。采用眼底照相及 检测小鼠视网膜损伤情况；法观察视网膜血管渗漏情况；染色观察小鼠视网膜组织形态变化；试剂盒检测血清中抗氧化指标水平，法检测小鼠血清中炎性细胞因子的表达水平；法检测各组小鼠视网膜组织细胞核内、核内 、与 蛋白的表达情况。结果 与正常组比较，模型组小鼠视网膜出现大量的黄白色类似玻璃膜疣状沉积，视网膜相对厚度下降（.），视网膜血管出现大面积的渗漏；血清中 活力与 含量下降（.），、与 含量上升（.）。与模型组相比，治疗组小鼠视网膜黄白色类似玻璃膜疣状沉积减少，视网膜相对厚度增加（.）、血管渗漏面积减少；血清中 活力与 含量上升（.），、与 的含量下降（.）；视网膜组织细胞核内、和 的蛋白表达上升（.），核内 的蛋白表达减少（.）。结论 可通过抗氧化应激与抗炎作用减弱碘酸钠诱导的视网膜损伤，其机制可能与 激活 信号通路有关。关键词：三七总皂苷；视网膜损伤；核因子 相关因子；血红素氧合酶；醌氧化还原酶 中图分类号：.文献标志码：，（，）：（），（），（），（），；，；（），（），（.），石河子大学学报（自然科学版）第 卷（.），（.），（.），；（.），（.）；（.），（.）：；年龄相关性黄斑变性（，）是导致老年人视力下降和致盲的主要原因，包括湿性和干性两种类型。湿性 的治疗目前主要使用靶向血管内皮生长因子受体的药物；干性 早期发病机制与氧化应激和炎症引起的视网膜色素上皮（，）细胞生理功能受损有关，病理表现主要为布鲁赫氏膜和 细胞之间有玻璃膜疣沉积，光感受器细胞及 细胞地图样萎缩。干性 的早期可使用抗氧化剂营养补充剂进行干预，如 （叶黄素 ：玉米黄质：维生素 ：维生素 ：锌：铜），在某些干性 患者中，可降低 进展的风险，但疗效欠佳，对于干性 临床上目前并无明确的治疗方法。碘酸钠作为一种强氧化毒性剂，会使机体 增多，可特异性损伤 细胞，继而引起感光细胞损伤，这种病理变化与人干性 相似，以碘酸钠诱导的干性 小鼠模型已较为经典。三七总皂苷（，）是从传统中药三七中提取的主要有效成分，其药理作用包括抗炎、抗氧化和清除自由基等，通过其抗氧化功能对高糖诱导的视网膜毛细血管内皮细胞的损伤产生保护作用。还可通过抑制视网膜的氧化应激与炎症反应，对光损伤小鼠的光感受器细胞发挥保护作用。中主要成分人参皂苷 与人参皂苷 在人视网膜色素上皮细胞中抑制脂多糖诱导的促炎基因表达。目前，对碘酸钠诱导的小鼠视网膜损伤是否具有保护作用尚未见报道。本文将探讨 对碘酸钠诱导的小鼠视网膜损伤是否具有保护作用及可能的作用机制，为治疗干性 提供一定的参考。材料与方法.实验动物 只 级 雄性小鼠，体重 ，购自辽宁长生生物科技有限公司，许可证号：（辽）（）。实验动物的喂养及实验相关操作于锦州医科大学心脑血管重点实验室内进行，已经取得锦州医科大学动物伦理委员会的批准（），实验期间小鼠自由摄食饮水。.主要试剂与仪器三 七 总 皂 苷，纯 度：，批 号：，购自上海广锐生物科技有限公司；荧光素钠，货 号：；碘 酸 钠，纯 度：，货 号：，购自上海麦克林生化科技有限公司；戊巴比妥钠，货号：，购于美国 公司。抗体（货号：）、抗体（货号：）购于美国 生物公司；抗体（货号：）购于 公司；（货 号：）、抗 体（货 号：）、辣根过氧化物酶（）标记山羊抗兔 抗体（二抗）（货号：）均购于 公司；抗体（货号：）购于沈阳万类生物公司。（货号：）、（货号：），（货号：）购于美国 公司；试剂盒（货号：），试剂盒（），试剂盒（货号：）购于南京建成生物工程研究所有限公司。小动物眼底成像系统（美国）；光学相干断层扫描仪和血管造影仪（加拿大 公司）；光学显微镜（德国）；型酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司产品）；蛋白电泳与转膜系统（美国 公司）。.方法.实验动物分组及给药 只小鼠适应性喂养一周后，按体重随机分为正常组、模型组、低（）、中（）、高剂量组（），每组 只。溶于.羧甲基纤维素钠溶液中，分别按上第 期蔡曾晓瑞，等：三七总皂苷对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及机制研究 述剂量灌胃给药预保护，正常组与模型组小鼠灌胃等体积.羧甲基纤维素钠溶液。除正常组外，其余各组小鼠一次性鼠尾静脉注射 碘酸钠溶液 （碘酸钠溶解于生理盐水中，终浓度为），建立小鼠视网膜损伤模型；正常组注射等量的生理盐水。继续灌胃给药 ，各组小鼠给药体积均为 。.眼底照相及光学相干断层扫描（，）给药结束后，以戊巴比妥钠将小鼠麻醉后，使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，涂一层眼用凝胶于角膜。使用 进行眼底照相，调整 镜头与参数进行观察并拍照，利用 软件分析视网膜相对厚度。.眼底荧光素钠血管造影（，）给药结束后，将小鼠麻醉、散瞳，涂一层眼用凝胶于角膜，立即腹腔注射荧光素钠（）溶液进行视网膜血管造影，然后采用 检测。.样本的收集 实验结束后，摘除小鼠左眼球取血，离心 ，分离血清，置于 保存；左侧眼球取出后用生理盐水清洗眼球表面残留血液，固定于改良的 固定液（冰醋酸 甲醛 生理盐水 乙醇 ）。将小鼠右侧眼球取出，用生理盐水清洗干净，剥离视网膜，冻存于，备用。.苏木精伊红（，）染色 小鼠左侧眼球于改良的 固定液中固定，用石蜡包埋，以视神经与角膜中心为轴向切片，厚度为 ，进行常规 染色，使用光学显微镜观察视网膜结构。.小鼠血清中、含量检测 取出冻存于 冰箱中的血清，按照南京建成生物工程研究所有限公司说明书要求分别进行测定。.小鼠血清中、含量测定 取出冻存于 冰箱中的血清，采用 法分别对、的含量进行检测。.检测小鼠视网膜组织蛋白表达 按照 蛋白定量法测定视网膜组织中的蛋白含量并绘制标准曲线。每组取 蛋白样品进行 电泳，转膜封闭后分别加入相应的一抗孵育过夜，洗膜后加入二抗，通过化学发光试剂盒进行显影成像。用 软件计算目的条带的相对蛋白表达量。.统计学分析 用.软件进行数据处理，数据结果以均数标准差（?）表示，多组间比较采用单因方差分析，方差齐则采用 法检验，方差不齐则采用 法检验，.表示差异具有统计学意义。结果.对小鼠眼底的影响 与正常组相比，模型组小鼠眼底损伤严重，出现大量黄白色类似玻璃膜疣物质；经 治疗后各组小鼠眼底损伤减轻，黄白色类似玻璃膜疣物质有不同程度的减少，高剂量组减少最明显，结果见图。图 各组小鼠眼底照相结果.对小鼠视网膜厚度的影响 正常组的视网膜各层结构排列整齐，密度均匀；与正常组相比，模型组小鼠视网膜结构排列紊乱，层出现高反射点，光感受器层与外核层受损，视网膜相对厚度减小（.）。与模型组比较，中和高剂量治疗组小鼠视网膜 层结构排列紊乱程度均有不同程度的减轻，层高反射点减少，光感受器层与外核层受损程度减轻，且视网膜相对厚度增加（.，.），结果见表 和图。表 对碘酸钠诱导的视网膜损伤小鼠视网膜相对厚度的影响?，组别剂量（）视网膜相对厚度 正常组.模型组.低剂量组.中剂量组.高剂量组.与正常组比较，.，.；与模型组比较，.，.。石河子大学学报（自然科学版）第 卷图 各组小鼠 检查结果（比例尺长度为 ）.对小鼠眼底血管完整性的影响 正常组小鼠视网膜中血管充盈明显，可清晰的看到各级血管分布情况；与正常组相比，模型组小鼠视网膜中次级血管分布不明显，视网膜血管出现大面积渗漏；与模型组比较，经 治疗后，各组小鼠视网膜血管渗漏面积减少，高剂量组减少最明显，结果见图。图 各组小鼠 检查结果.对小鼠视网膜组织形态学的影响 正常组小鼠视网膜各层细胞排列整齐且密度均匀，结构完整；与正常组相比，模型组小鼠视网膜光感受器细胞层和 层的结构被破坏，并可见大量的棕褐色玻璃膜疣沉积；与模型组相比，经 治疗后各组小鼠视网膜光感受器细胞层和 层的结构损伤好转，棕褐色玻璃膜疣数量减少，高剂量组减少最为明显，结果见图。图 各组小鼠视网膜 染色结果（）.对小鼠血清中、水平的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清中 活力、含量下降，含量上升（.）；与模型组 相比，低、中和高剂量治疗组小鼠血清中 活力上升（.），中、高剂量治疗组小鼠血清中 含量上升，含量下降（.，.），结果见表。表 对碘酸钠诱导的视网膜损伤小鼠血清中、水平的影响?，组别剂量（）（）（）（）正常组.模型组.低剂量组.中剂量组.高剂量组.与正常组比较，.，.；与模型组比较，.，.。.对小鼠血清中、含量的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清中、与 含量升高（.，.）；与模型组相比，低、中与高剂量治疗组小鼠血清中、含量降低（.，.），高剂量治疗组 含量降低（.），结果见表。第 期蔡曾晓瑞，等：三七总皂苷对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及机制研究 表 对碘酸钠诱导的视网膜损伤小鼠血清中、的影响?，组别剂量（）（）（）（）正常组.模型组.低剂量组.中剂量组.高剂量组.与正常组比较，.，.；与模型组比较，.，.。.对小鼠视网膜中、蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组小鼠视网膜中细胞核内，、表达升高但无统计学意义，细胞核内 蛋白表达升高（.）；与模型组相比，中、高剂量治疗组小鼠视网膜中细胞核内，蛋白表达升高（.，.），核内 表达减少（.，.）；低、中和高剂量治疗组小鼠视网膜中 蛋白表达升高（.，.），结果见图 和表。：正常组；：模型组；：低剂量组；：中剂量组；：高剂量组。图 对碘酸钠诱导的视网膜损伤小鼠视网膜组织中 抗氧化应激信号通路的调节作用表 对碘酸钠诱导的视网膜损伤小鼠视网膜中、的影响?，组别剂量（）正常组.模型组.低剂量组.中剂量组.高剂量组.与正常组比较，.；与模型组比较，.，.。讨论 是一种病因不明的多因素诱发的眼底疾病，干性 发病机制与氧化应激、慢性炎症等因素密切相关。视网膜作为人体中耗氧量较多的组织之一。长期及持续的光线照射，丰富的多不饱和脂肪酸以及大量的光敏剂均增加了视网膜组织中 的生成，当 产生的增多并且超过机体的抗氧化应激能力时，会引起细胞蛋白质、脂质和 被修饰并进一步造成损伤。长期的氧化应激状态会使 细胞受损，细胞的功能障碍，会进一步引起 的慢性炎症过程，玻璃膜疣作为早期 病变的主要特点，是局部炎性反应的表现，因此目前，降低机体氧化应激状态和抑制炎症反应，是防治干性 的重要措施。本次实验通过小鼠尾静脉注射碘酸钠诱导小鼠视网膜损伤，模拟干性 病理变化。通过观察视网膜层次结构、测量视网膜相对厚度、比较玻璃膜疣沉积的数量，进一步探讨 在体内对干性 的治疗是否有效。本研究发现给予碘酸钠处理后，小鼠视网膜 层和光感受器层、外核层都出现了不同程度的损伤，出现大量玻璃膜疣沉积，说明小鼠视网膜氧化损伤模型制备成功。在给予 治疗后，层结构排列紊乱程度减轻、高反射点减少，光感受器层与外核层紊乱程度降低，并抑制视网膜相对厚度变薄，保护了视网膜血管的完整性，减少了玻璃膜疣的数量。提示 可减轻由碘酸钠诱导的小鼠视网膜损伤。是机体中重要的抗氧化酶，可清除氧自由基；作为机体中重要的还原剂，其含量的多少也是评价机体抗氧化应激能力的重要指标之一。作为一种脂质过氧化反应产物，是自由基损害的标志，可间接反映机体受氧化应激损害的程度。是血红素降解的限速酶，通过上调，可改善氧化应激引起的损伤；作为一种黄素酶，可改善由代谢引起的氧化应激损伤，维持细 石河子大学学报（自然科学版）第 卷胞内物质处于氧化还原平衡状态。信号通路是机体内重要的内源性抗氧化应激信号通路。当细胞处于氧化应激状态时，在细胞质中，与它的抑制蛋白果蝇肌动蛋白结合蛋白 解偶联、并转位入核激活靶基因转录进而调节下游多种保护性蛋白如、与 等基因的转录，清除过多的，提高机体对氧化应激的抵抗能力。是经典的炎症信号分子，作为重要的核转录因子，介导一些炎症因子的转录，参与调节炎症反应、细胞凋亡等多种病理生理过程。本研究中与对照组相比，模型组小鼠血清中 活力、含量下降，含量上升，说明模型组小鼠抗氧化应激能力不足；通路相关蛋白的表达升高，说明在碘酸钠作用下，视网膜对氧化应激作出了适应性反应。经 治疗后，小鼠血清中 活力上升，含量增加，含量下降，通路相关蛋白、蛋白表达升高，说明 可提高机体抗氧化应激的能力，其可能是通过增加 通路相关蛋白 的核内的表达量，刺激下游抗氧化蛋白、蛋白表达，提高抗氧化酶 活力、含量，降低 含量，从而发挥抗氧化应激的作用。同时在碘酸钠作用下，模型组小鼠视网膜组织细胞核中 信号通路中的关键蛋白 的表达上调，其下游炎症因子、的释放增加。经 干预后视网膜组织细胞核中 蛋白的表达下降，由 调控释放的炎症因子、与 的表达水平下降，表明 具有抗炎作用。综上所述，本研究发现 对碘酸钠诱导的小鼠视网膜损伤有改善作用，同时明确了 对 信号通路具有调控作用。参考文献（），（）：，：，（）：，（）：，（）：（），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：刘杨 在 动物模型中的应用及机制探讨吉林：吉林大学，（）：梁晓莲，刘纤纤，李文莉，等三七总皂苷药理作用及临床应用研究进展湖北农业科学，（）：，（）：，：金茹娜，郭红，徐静，等三七总皂苷对新生血管性视网膜病变的干预效应及机制研究世界科学技术中医药现代化，（）：，（）：，（）：第 期蔡曾晓瑞，等：三七总皂苷对碘酸钠所致视网膜损伤的保护作用及机制研究 董苏敏，胡相卡，赵苗鑫，等三七总皂苷对糖尿病肾病小鼠的肾保护作用机制研究中国临床药理学杂志，（）：，（）：牛占宇，李建德，石永鹏，等尾静脉注射碘酸钠对小鼠视网膜形态结构变化的影响 眼科新进展，（）：，（）：，：罗灿峤，梁英杰，吴惠群，等小鼠眼球标本固定液及制片方法的改进中国组织化学与细胞化学杂志，（）：，（）：张敬法，张宇萌，孙晓东干性年龄相关性黄斑变性发病机制及治疗眼科新进展，（）：，（）：，：，（），（）：，（）：，（），（）：张成国，孙国祥，杨晓，等谷胱甘肽抑制氧化应激反应进展科技创新与应用，：，（）：蒋丽，芮燕君，戴佳琪，等丹参酮 对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的影响眼科新进展，（）：，（）：景亮，祁永章红景天苷对糖尿病足溃疡大鼠 信号通路及伤口愈合的影响中国比较医学杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：吴军，关涛，田峰，等瑞香素对脊髓损伤大鼠运动功能改善作用的 信号通路机制研究中国比较医学杂志，（）：，（）：（责任编辑：唐慧）