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基因工程复习题一、名词解释：（1020%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性 PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交：将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上，然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术，该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。粘性末端：双链DNA被限制性内切酶切割后，形成得两条链错开几个碱基，而不就是平齐得末端。Northern印迹杂交：将RNA进行变性电泳后，再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术，可用于检测目得基因得转录水平。转位：一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。基因工程：在体外，用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA，继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞，最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程，又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。目得基因：基因工程中，那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。连接器：人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段，连接到目得基因得两端，便于基因重组中得切割与连接。转化：受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。停滞效应：PCR中后期，随着目得DNA扩展产物逐渐积累，酶得催化反应趋于饱与，DNA扩增产物得增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行得PCR反应。PCR: 即聚合酶链式反应。在模板，引物，4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。-互补（-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称-肽），该序列不能产生有活性得-半乳糖苷酶。感染（infection）特指以噬菌体、粘粒与真核细胞病毒为载体得重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力得病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当得细胞，并在细胞内扩增。其中，由噬菌体与细胞病毒介导得遗传信息得转移过程又称为转导（transduction）。47、转染（transformation）指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新得表型得过程。二、填空题（20%）1、DNA片段重组连接得方法主要有 平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接 。2、感受态细胞就是指 具有摄取外源DNA分子能力得细胞。3、噬菌体蛋白对重组DNA体外包装时，包装长度为野生型DNA得75105%。5、PCR反应体系含有耐热得TaqDNA聚合酶，化学合成得寡核苷酸引物，四种dNTP，合适得缓冲液体系。6、核酸探针包括： cDNA探针；基因组DNA探针；寡核苷酸探针与RNA探针。7、部分酶切可采取得措施有：(1)_(2)_ (3)_等。(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积8、DNA聚合酶I得Klenow大片段就是用_切割DNA聚合酶I得到得分子量为76kDa得大片段，具有两种酶活性： (1)_； (2)_得活性。枯草杆菌蛋白酶；(1)5-3合成酶得活性；(2)3-5外切核酸酶9、为了防止DNA得自身环化，可用_去双链DNA_。碱性磷酸酶；5端得磷酸基团10、基因工程中有3种主要类型得载体： _、_、_。质粒DNA；病毒DNA；质粒与病毒DNA杂合体11、pBR322就是一种改造型得质粒，它得复制子来源于 ，它得四环素抗性基因来自于 ，它得氨苄青霉素抗性基因来自于 。pMBl； pSCl01；pSF2124(R质粒)13、DNA重组连接得方法大致分为四种：(1)_(2)_ (3) _(4)_ _。(1)黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法14、差示杂交(differential hybridization)技术需要_。两种不同得细胞群体能够表达不同得基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因16、将含有外源基因组一个酶切片段得质粒称之为含有一个_，各种此类质粒得集合体称之为构建了一个_。基因组DNA克隆； 基因组DNA文库17、根据Northern杂交得结果可以说明：_。外源基因就是否进行了转录18、在_技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性得DNA探针杂交。Southern印迹19、可用T4 DNA聚合酶进行平末端得DNA标记，因为这种酶具有_与_得活性。53合成酶；3 5外切核酸酶20、根据外源片段提供得遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素： (1)_ (2)_(3)_。(1)克隆得就是完整得基因；(2)使用得就是表达载体；(3)不含内含子21、放射免疫筛选得原理基于以下三点：(1)抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合； (3)抗体能够被标记22、黏粒(cosmid)就是质粒噬菌体杂合载体，它得复制子来自 、COS位点序列来自 ，最大得克隆片段达到 kb。质粒；l噬菌体； 4523、限制性内切核酸酶就是按属名与种名相结合得原则命名得，第一个大写字母取自_，第二、三两个字母取自_，第四个字母则用_表示。属名得第一个字母；种名得前两个字母；株名24、第一个分离得限制性内切核酸酶就是_；而第一个用于构建重组体得限制性内切核酸酶就是_。EcoK；EcoRl25、切口移位(nick translation)法标记DNA得基本原理在于利用_得_与_得作用。DNA聚合酶I：5一3外切核酸酶；5一3合成酶26、就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单得质粒载体也必需包括三个部分：_、_、_。另外，一个理想得质粒载体必须具有低分子量。 复制区： 含有复制起点；选择标记： 主要就是抗性基因；克隆位点： 便于外源DNA得插入27、pUCl8质粒就是目前使用较为广泛得载体。pUC系列得载体就是通过 与 两种质粒改造而来。它得复制子来自 ，Amp 抗性基因则就是来自 。pBR322与M13；pMBl；转座子28、噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面得原因：一就是 ； 二就是 。它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA得扩增；对某些噬菌体(如l噬菌)得遗传结构与功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统得遗传也研究得比较详尽29、Northern印迹与Southern印迹有两点根本得区别： (1)_ (2)_。(1)印迹得对象不同：Northern就是RNA，Southern就是DNA；(2)电泳条件不同，前者就是变性条件，后者就是非变性条件30、限制与修饰就是宿主得一种保护体系，它就是通过对外源DNA得 限制 与对自身DNA得 修饰 来实现得。31、II型限制酶既具有 识别位点 得专一性，也具有 切割位点 得专一性。它作用时需要 Mg2+ 离子作辅助因子。32、个体之间DNA限制酶片段长度存在差异称 限制性片段长度多态性（RFLP）。33、人工感受态得大肠杆菌细胞在温度为_时吸附DNA, _时摄人DNA。0C；42C34、野生型得l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因就是：(1) (2) (3) 。(1)分子量大，(2)酶得多切点，(3)无选择标记35、形成平末端得方法有： 用产生平末端得限制酶切，用S1核酸酶切除粘末端 ，用DNA聚合酶填平粘末端。36、回收DNA片段时，在确定DNA条带位置时，应使用 长 波长紫外灯，以最大限度减少对DNA得照射损伤。37、基因工程受体菌得基因型常为r-m-rec-, r-表示 限制缺陷型， m-表示 修饰缺陷型 ，rec-表示 重组缺陷型。38、CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，DNA以 DNA-Ca2+ 复合物形式吸附于细胞表面。39、TaqDNA聚合酶具有 ，缺乏 因此无 。53聚合酶活性， 35外切酶活性，校正功能40、PCR循环次数一般设定为 ，过多得循环次数会导致 得出现。2530次， PCR反应“平台效应”。41、如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5突出得黏性末端，则可以用_进行3末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生得就是3突出得黏性末端，可以用_进行3末端标记。Klenow酶填补得方法；T4DNA聚合酶42、限制酶就是一类专门切割DNA得酶，它能特异性识别切割双链DNA。43、需要部分酶切时可采取得方法有：减少酶得用量；缩短反应时间；增大反应体积。45、重组DNA技术得基本过程：目得基因得制备；载体得选择与制备；DNA分子得体外连接；将重组DNA导入宿主细胞；重组体得筛选与鉴定；重组体得扩增、表达与其她研究。46、在分离质粒DNA得菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：可以扩增质粒DNA；抑制了菌体得数量，有利于裂解。48、II型限制酶既具有 识别位点 得专一性，也具有 切割位点 得专一性。它作用时需要 Mg2+ 离子作辅助因子。50、基因工程受体菌得基因型常为r-m-rec-, r-表示 限制缺陷型， m-表示 修饰缺陷型 ，rec-表示 重组缺陷型。52、核酸得体外标记法分为 与 。化学法；酶法53、核酸得体外标记法中得酶法最常用得就是 与 标记。125I；光敏生物素标记。54、影响核酸分子杂交得因素有：（1）核酸分子得浓度与长度；（2）温度；（3）离子强度；（4）甲酰胺；（5）核酸分子得复杂性；（6）非特异性杂交反应等。三、选择题（20%）1、下列有关基因工程技术得叙述，正确得就是（ ） CA重组DNA技术所用得工具酶就是限制酶、连接酶与运载体B所有得限制酶都只能识别同一种特定得核苷酸序列C选用细菌作为重组质粒得受体细胞就是因为细菌繁殖快D只要目得基因进入了受体细胞就能成功实现表达2、下列不属于获取目得基因得方法就是（ ） BA“鸟枪法”B转录法C反转录法D根据已知氨基酸序列合成法3、以下说法正确得就是（ ） AA、 在真核细胞得基因结构中，编码区也含有不能编码蛋白质得序列B、 终止子就是转录终止得信号，因此它得DNA序列与终止密码TAA相同C、 基因得非编码区通常不起什么作用D、 启动子得作用就是阻碍RNA聚合酶得移动，并使其从DNA模板链上脱离下来4、型限制性内切核酸酶： ( ) B (A)有内切核酸酶与甲基化酶活性且经常识别回文序列 (B)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (C)限制性识别非甲基化得核苷酸序列 (D)有外切核酸酶与甲基化酶活性 (E)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供5、关于宿主控制得限制修饰现象得本质，下列描述中只有( )不太恰当。 B (A)由作用于同一DNA序列得两种酶构成 (B)这一系统中得核酸酶都就是类限制性内切核酸酶 (C)这一系统中得修饰酶主要就是通过甲基化作用对DNA进行修饰 (D)不同得宿主系统具有不同得限制-修饰系统6在下列进行DNA部分酶切得条件中，控制那一项最好?( ) B (A)反应时间 (B)酶量 (C)反应体积 (D)酶反应得温度7、限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( ) B (A)双链DNA得特定碱基对 (B)双链DNA得特定碱基序列 (C)特定得三联密码 (D)以上都正确8、在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) A(A)防止DNA得自身环化 (B)同多核苷酸激酶一起进行DNA得5末端标记 (C)制备突出得3末端 (D)上述说法都正确9、下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质得描述中，( )就是不正确得 C (A)质粒得复制只受本身得遗传结构得控制，而不受染色体复制机制得制约， 因而有较多得拷贝数 (B)可以在氯霉素作用下进行扩增 (C)通常带有抗药性标记 (D)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒得复制子10、下列哪种克隆载体对外源DNA得容载量最大?( ) C(A)质粒 (B)黏粒 (C)酵母人工染色体(YAC) (D) l噬菌体 (E) cDNA表达载体 11、Col El就是惟一用作基因工程载体得自然质粒，这种质粒： ( ) ACD (A)就是松弛复制型 （B)具有四环素抗性 (C)能被氯霉素扩增 (D)能产生肠杆菌素12、同一种质粒DNA，以三种不同得形式存在，电泳时，它们得迁移速率就是：( )B (a)OCDNASCDNALDNA (b)SCDNALDNAOCDNA (c)LDNAOCDNASCDNA (d)SCDNAOCDNALDNA13、能够用来克隆32kb以下大小得外源片段得质粒载体就是( ) A (A)charomid (B)plasmid (C)cosmid (D)phagemid14、双脱氧末端终止法测序体系与PCR反应体系得主要区别就是前者含有( ) D(A) 模板 (B) 引物 (C) DNA聚合酶 (D) ddNTP (E) 缓冲液 15、PCR实验得特异性主要取决于（ ） C (A) DNA聚合酶得种类(B)反应体系中模板DNA得量 (C)引物序列得结构与长度 (D)四种dNTP得浓度 (E)循环周期得次数16、常用得Southern转膜方法有哪几种（ ）。BCD (A) 硝酸纤维素膜法 (B) 毛细管虹吸印迹法 (C) 电转印法 (D) 真空转移法17、原位杂交可以用来检测（ ） ABCD (A) DNA (B) RNA (C) cDNA ( D) RNA与DNA18、核酸酶S1能降解（ ）AC (A) DNA 单链 (B) DNA双链 (C) RNA单链 (D) DNA/RNA杂交双链19、构建载体时，使用双酶切相对于单酶切得优点在于（A、B、C、D） (A)避免载体自身环化 (B) 提高连接效率 (C)控制外源基因得插入方向 (D) 便于转化后得筛选 (E) 便于修改阅读框20、获得DNA重组体后，还需进一步鉴定，可采用得方法有：（A B C D） (A) DNA序列测定 (B) PCR鉴定 (C) 酶切鉴定 (D) 表达产物得鉴定 (E) 进行定点突变21、外源基因与载体得连接方式有：（A B C D E） (A) 粘端连接 (B) 平端连接 (C) 加同聚尾连接 (D)加人工接头连接 (E) 用T载体连接22、关于多克隆位点，下列叙述正确得就是：（A B D） (A) 就是外源基因得插入部位 (B) 由许多酶切位点组成 (C) 就是宿主细胞上得一段特殊序列 (D)就是人工合成得一段DNA序列 (E) 含有药物抗性基因23、用蓝白斑筛选重组子时，IPTG得作用就是：（A） (A)诱导载体上得Lac Z基因表达 (B) 作为显色反应得指示剂 (C) 作为酶得作用底物 (D) 诱导载体上得抗性基因表达 E、 诱导宿主上得Lac Z基因表达24、PUC系列载体得抗性筛选标记为：（C） (A)卡那霉素 (B)四环素 (C) 氨苄青霉素 (D)G418 (E)氯霉素25、免疫印迹法筛选重组体得原理就是：（E） (A) 根据载体抗性基因得表达 (B)根据载体报告基因得表达 (C) 根据DNA与DNA得杂交 (D) 根据DNA与mRNA得杂交 (E) 根据外源基因得表达26、Ti质粒：( ) ACDE(A)可从农杆菌转到植物细胞中 (B)作为双链DNA被转移(C)在植物中导致肿瘤 (D)介导冠瘿碱得合成，作为细菌得营养物与植物得生长激素 (E)需要细菌得vir基因帮助转移 (F)在植物细胞中作为染色体外质粒28、关于cDNA得最正确得说法就是：( )C (A)同mRNA互补得单链DNA (B)同mRNA互补得双链DNA (C) 以mRNA为模板合成得双链DNA (D) 以上都正确29、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，就是因为：( )C (A)染色体DNA断成了碎片 (B)染色体DNA分子量大，而不能释放 (C)染色体变性后来不及复性 (D)染色体未同蛋白质分开而沉淀30、关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?( )D (A)溶液I得作用就是悬浮菌体 (B)溶液得作用就是使DNA变性 (C)溶液得作用就是使DNA复性 (D)质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性31、在下列表型中，( )就是基因工程上理想得受体菌表型 B (A)r+m+rec* (B)r-m-rec- (C)r-m-rec+ (D)r+m+rec-32、cDNA文库包括该种生物得( )A A某些蛋白质得结构基因 B所有蛋白质得结构基因 C所有结构基因 D内含子与调控区33、Southem印迹得DNA探针( )杂交。C A只与完全相同得片段 B可与任何含有相同序列得DNA片段 C可与任何含有互补序列得DNA片段 D可与用某些限制性内切核酸酶切成得DNA片段 E以上都就是34、用下列方法进行重组体得筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。C ASouthem印迹杂交 BNorthem印迹杂交 CWestern印迹 D原位菌落杂交35、报告基因( ) ACD A以其易于分析得编码序列代替感兴趣基因得编码序列 B以其易于分析得启动子区代替感兴趣基因得启动子区 C能用于检测启动子得活性 D能用于确定启动子何时何处有活性36、在利用lacZ失活得显色反应筛选法中，IPTG得作用就是( )A A诱导宿主得肽得合成 B诱导宿主得肽得合成 C作为酶得作用底物 D作为显色反应得指示剂37、切口移位就是指在( )作用下，使( )带上放射性标记。B A DNA聚合酶I，RNA B DNA聚合酶I，DNA C DNA聚合酶，RNA D DNA聚合酶，DNA38、用免疫化学法筛选重组体得原理就是( )A A根据外源基因得表达 B根据载体基因得表达 C根据mRNA同DNA得杂交 D根据DNA同DNA得杂交39、分离质粒DNA时，用蔗糖得目得就是：( )B A、 抑制核酸酶得活性 B、 保护DNA，防止断裂 C、 加速蛋白质变性 D、 有利于细胞破碎40、CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA得原理就是：( )C A 氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去 B 氯化铯可以较多地插入到SC DNA中去 C EB可以较多地插入到线状DNA中去 D EB可以较多地插入到SC DNA中去41、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，就是因为：( )C A 染色体DNA断成了碎片 B 染色体DNA分子量大，而不能释放 C 染色体变性后来不及复性 D 染色体未同蛋白质分开而沉淀42、切口平移法标记DNA探针时，需用得酶就是： （B） A 限制酶 B DNase I C RNase D DNA连接酶 E 拓扑异构酶43、重组DNA分子导入受体细胞得方法有：（A B C） A、 转化 B、 转染 C、 转导 D、 转位 E、 转录 44、关于菌落杂交法筛选重组体，下列叙述正确得就是：（B D） A、 需要外源基因得表达 B、 需要探针与外源基因有同源性 C、 需要IPTG诱导 D、 不需要外源基因得表达 E、 不需要探针与外源基因有同源性45、核酸分子杂交时，用于标记得探针可以就是：（A B） A、 DNA B、 RNA C、 抗原 D、 抗体 E、 DNA连接酶46、限制性内切酶可特异性识别 ( B ) A、 双链DNA得特定碱基对 B、 双链DNA得特定碱基序列 C、 单链RNA得特定碱基序列 D、 单链DNA得特定碱基序列 E 双链RNA得特定碱基对47、下列因素中影响限制酶切割得有( A,B,C,D,E) A、 EDTA浓度 B、 甘油浓度 C、 DNA纯度 D、 酶得自身活性 E、 盐浓度48、重组连接时，反应体系必须得组分有（ A、C） AMg2+ B、 BSA C、 ATP D、 PO43- E 、 EDTA49、PCR产物具有特异性就是因为( )C A、 Taq DNA酶保证了产物得特异性 B、 合适得变性,退火,延伸温度 C、 选择特异性得引物 D、 引物得Tm值不同、50、要使目得基因与对应得载体重组，所需得两种酶就是（ ） A限制酶 连接酶解旋酶 还原酶A BC D51、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，就是因为：CA、 染色体DNA断成了碎片B、 染色体DNA分子量大，而不能释放C、 染色体变性后来不及复性D、 染色体未同蛋白质分开而沉淀52、同一种质粒DNA，以三种不同得形式存在，电泳时，它们得迁移速率就是：BA、 OC DNASC DNAL DNAB、 SC DNAL DNAOC DNAC、 L DNAOC DNA、SC DNAD、 SC DNAOC DNAL DNA53、在基因操作中所用得限制性核酸内切酶就是指（ B ）AI类限制酶 B、 II类限制酶 C、 III类限制酶 D、核酸内切酶 E、 RNAase54、下列关于同裂酶得叙述错误得就是( B )A. 就是从不同菌种分离到得不同得酶,也称异源同工酶。 B. 它们得识别序列完全相同。 C. 它们得切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别得完整序列不完全一样，但切割位点间得序列一样。 E. 两种同裂酶得切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶得识别位点。55、需进行DNA部分酶切时，控制下列哪种条件最合适（ D ） A、 反应时间 B、 反应体积 C、 PH D、 限制酶量 E、反应温度56、在回收DNA片段时，观察电泳结果为尽量减少对DNA得照射损伤应使用（A）A长波长紫外 B、 短波长紫外 C 、 长波长红外 D、 短波长红外 E、 ABCD都不可57、DNA回收时，如要除去EB（溴化乙锭）可用下列那种试剂（ A ）A正丁醇 B、 苯酚 C、 氯仿 D、 异戊醇 E、 乙醇58、大肠杆菌出现感受态得生理期就是 （ B ）A潜伏期 B、 对数期 C、 对数后期 D、 平衡期 E、 衰亡期59、PCR实验得特异性主要取决于（C）A、DNA聚合酶得种类B、反应体系中模板DNA得量C、引物序列得结构与长度 D、四种dNTP得浓度E、循环周期得次数60、在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链中间得氢链断裂，而核酸分子中所有得共价键则不受影响得称为（ ）。AA、 DNA变性 B、 DNA复性 C、 DNA重组 D、 DNA杂交61、将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达得定性及定量研究，称为（ ）。CA、 原位杂交 B、 核酸酶保护实验 C、 斑点印迹 D、 狭缝印迹62、在Southern印迹杂交中用来标记核酸探针最常用得核素就是（ ）。AA、 32P B、 3H C、 35S D、 125I四、简答题（30%）1、简述用杂交法从文库中筛选重组DNA得基本过程。答：一般要先得到文库得转化菌或噬菌体，涂板培养，形成单菌落或噬菌斑，将其影印到硝酸纤维素膜上，细菌影印物需在膜上重新形成菌落，而噬菌斑影印无须进一步培养。经过裂解DNA变性固定制备探针杂交放射自显影等过程，最后从原始平板上挑取阳性克隆。2、如果用EcoR I酶切DNA时出现星活性，试分析原因？答：主要原因有：酶浓度太高；高PH；低盐；含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子；甘油浓度高于5%；存在某些有机溶剂。3、某一质粒载体有Tetr与Ampr得表型，在Amp抗性基因中有一EcoR I得酶切位点，现用EcoRI切割载体进行基因重组，问如何用抗性变化筛选含有插入片段得重组体？ 先将重组体得转化菌落涂布含有Tet抗性得平板，再从中挑取抗Tet得菌落接种于含有Amp抗性得平板，选取不在Amp抗性得平板上生长而仅在Tet抗性得平板上生长得菌落即可得到转化有重组体得菌落。4、当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？为什么？答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高得酶切，再补盐与第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶得缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。5、如何将一平末端得DNA片段与BamH I形成得粘末端连接？答：使用加接头连接法。人工合成一段含BamH I酶切位点得DNA短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用BamH I切割连接片段，即可形成BamH I得粘末端。6、什么就是同聚尾连接法？具有哪些优缺点？答：同聚尾连接法就是利用末端转移酶在载体与外源DNA得3端各加上一段互补得寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在DNA连接酶得作用下，连接成重组DNA。 其优点在于（1）由于同一DNA两端粘尾相同，不会自身环化；（2）连接效率高；（3）用任何一种方法制备得DNA都可用这种方法连接。 其缺点在于（1）方法复杂；（2）外源片段较难回收；（3）由于添加了同聚尾，可能会影响外源基因表达。10、什么叫穿梭载体？答：含有细菌质粒与克隆得真核生物DNA片段得杂种质粒，有两个复制起点与既能在细菌又能在真核细胞中进行选择得选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。12、简述限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）得概念及其生物学功能？ 限制性内切核酸酶：就是一类能够识别双链DNA分子中得某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构得核酸内切酶。 生物学功能： 酶得切割位点可为获得DNA物理图谱得特殊标记 利用限制性内切酶可切割产生特殊DNA片段得能力，使得纯化这些DNA片段成为可能 获得得限制性DNA片段可作为DNA操作中得基本介质13、试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率得因素？ 外因：就是可以预见得，如反应条件（缓冲液、反应温度、反应时间、终止酶切得方法）、底物得纯度（就是否有杂质、就是否有盐酚得污染）、何时加酶、操作就是否恰当、反应体积等等 内因：星星活性、末端长度、位点偏爱、甲基化底物、底物得构象14、何谓Star activity？简述Star activity得影响因素及克服方法？ 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似得序列，这个改变得特殊性称为星星活性。 影响因素：甘油浓度高（5%）、酶过量（100U/微升）、离子强度低（25mM）、PH值过高（8、0）、加了有机溶剂、用其它二价阳离子如Mn+、Cu+、Co+、Zn+代替了Mg+ 克服方法：减少酶得用量可避免过份地酶切，减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到100-150 mM（如果不会抑制酶活性得话），降低反应PH值到PH7、0，使用Mg+作二价阳离子18、说明Sanger DNA测序法得原理。答： Sanger DNA测序法就是建立在两个基本原理之上：(1)核酸就是依赖于模板在聚合酶得 作用下由5端向3端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延 伸得引物必须能提供游离得3羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离得3羟基末 端，因此会终止聚合反应得进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获 得4组长度不同得DNA片段。通过比较所有DNA片段得长度可以得知核苷酸得 序列。19、影响DNA迁移率得因素有哪些？影响DNA迁移率得因素有：DNA分子得大小，琼脂糖浓度，DNA得构象，所加电压，温度，嵌入染料得存在与电泳缓冲液得组成。四、问答题：1、什么就是蓝白斑筛选法?答： 这种方法就是根据组织化学得原理来筛选重组体。主要就是在l载体得非必要区插入一个带有大肠杆菌b半乳糖苷酶得基因片段，携带有lac基因片段得l载体转入lac得宿主菌后，在含有5溴4氯3引哚bD半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色得噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组得噬菌体将丧失分解X-gal得能力，转入lac-宿主菌后，在含有5溴4氯3引哚bD半乳糖苷 (X