分子肿瘤概论研究生课件学生.pptx

分子肿瘤概论分子肿瘤概论v 重庆医科大学病理教研室重庆医科大学病理教研室 v 王娅兰王娅兰 教授教授(博士生导师博士生导师)v 分子肿瘤概论分子肿瘤概论v一、有关肿瘤的基本概念（复习）一、有关肿瘤的基本概念（复习）v肿瘤（肿瘤（tumor,neoplasm)v 基因水平基因水平 v 调控失常调控失常 v 异常增生异常增生 v 新生物新生物v肿瘤生物学行为肿瘤生物学行为-浸润、转移能力浸润、转移能力v 浸润浸润(invasion)：起源处迁移起源处迁移v 侵入周围邻近组织侵入周围邻近组织v转移转移(metastasis)：v从原发部位从原发部位v血管、淋巴管、体腔血管、淋巴管、体腔v它处继续生长它处继续生长v与原发瘤同样类型肿瘤与原发瘤同样类型肿瘤（转移瘤或继发瘤）（转移瘤或继发瘤）转移的途径转移的途径（2）Hematogenenous metastasis 全身脏器全身脏器（3）Transcoelomic metastasis 体腔内脏器体腔内脏器-脱落种植脱落种植 （医源性种植）（医源性种植）v浸润生长浸润生长-恶性肿瘤生长的特点恶性肿瘤生长的特点 v 肿瘤转移过程必经的第一步肿瘤转移过程必经的第一步v肿瘤的组织结构肿瘤的组织结构 v实质实质 （parenchyma)v间质间质（mesenchyma,stroma)v肿瘤间质的主要成分肿瘤间质的主要成分v1.血管血管v 小血管小血管 毛细血管毛细血管 血窦样血窦样 血管球样血管球样 v v新的肿瘤血供模式新的肿瘤血供模式v-血管生成拟态血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)v1999年，美国学者年，美国学者Maniotis等等v一种完全不同于经典血管生成的微循环模式一种完全不同于经典血管生成的微循环模式v-小管状（似血管）小管状（似血管）v-管壁主要由基底膜管壁主要由基底膜(PAS阳性阳性)围成，外衬以肿瘤围成，外衬以肿瘤细胞细胞v-腔内有血浆和红细胞流动腔内有血浆和红细胞流动v-管道与内皮性血管相通管道与内皮性血管相通v多存在于高度恶性肿瘤多存在于高度恶性肿瘤v血管生成拟态（血管生成拟态（vasculogenic mimicry）v 肿瘤细胞构成肿瘤细胞构成v 有基底膜有基底膜v 小管状（似血管）小管状（似血管）v 与血管交通与血管交通v2.结缔组织间质结缔组织间质v （1）纤维和基质）纤维和基质v 胶原纤维胶原纤维 v 常规常规 HE-红红v 特殊化学染色特殊化学染色v VG 改良法改良法-红红 v Masson-兰色兰色v 构成成分构成成分 I II III型胶原原纤维型胶原原纤维v 又由相应原纤维分子构成又由相应原纤维分子构成v 免疫组化或分子生物学方法可区别免疫组化或分子生物学方法可区别v弹力纤维弹力纤维v 常规常规 HEHE-淡红色淡红色v 特殊化学染色特殊化学染色v WeigertWeigert或或Verhceff-Verhceff-暗兰或黑色，弹力暗兰或黑色，弹力v 酶消化后阴性酶消化后阴性v v v网状纤维网状纤维v 银染银染-黑色，故也称嗜银纤维。黑色，故也称嗜银纤维。v PAS-强阳性强阳性v v成分成分 胶原蛋白为主要成分胶原蛋白为主要成分 v 细胞间质网状纤维细胞间质网状纤维-型胶原蛋白型胶原蛋白 v 基底膜网状纤维基底膜网状纤维-型胶原蛋白和型胶原蛋白和v 层黏连蛋白（层黏连蛋白（lamininlaminin）v纤维黏连蛋白纤维黏连蛋白 Fibronectin（FN）v 作用作用v A.连接基质中各种成分连接基质中各种成分v B.介导细胞外基质成分与细胞表面连接介导细胞外基质成分与细胞表面连接v黏蛋白黏蛋白v 又称蛋白多糖又称蛋白多糖（proteoglycan）v 如透明质酸，硫酸肝素等如透明质酸，硫酸肝素等 v骨黏素骨黏素（osteonectin）v（2）基底膜）基底膜(basement membrane,BM)v 多种成分多种成分 v 与疾病（肿瘤浸润）关系密切与疾病（肿瘤浸润）关系密切 v 型胶原型胶原 v -不形成纤维，与不形成纤维，与、型胶原不同型胶原不同v 层黏连蛋白层黏连蛋白 （laminin,LM）v -有与细胞膜有与细胞膜LM LM 受体相结合的位点受体相结合的位点v （3 3）细胞成分）细胞成分 固有的细胞成分固有的细胞成分 -纤维母细胞和纤维细胞纤维母细胞和纤维细胞v-肌纤维母细胞肌纤维母细胞 v-间充质细胞间充质细胞 v-巨噬细胞巨噬细胞v-树突状细胞树突状细胞 v反应性细胞成分反应性细胞成分v 各种细胞浸润各种细胞浸润 v -淋巴细胞淋巴细胞 最常见最常见 v -浆细胞浆细胞v -巨噬细胞巨噬细胞 v 都属免疫活性细胞都属免疫活性细胞 v二、肿瘤浸润、转移的分子机制二、肿瘤浸润、转移的分子机制v（一）肿瘤细胞的浸润转移（一）肿瘤细胞的浸润转移 v 1.肿瘤细胞增殖和扩展肿瘤细胞增殖和扩展v 浸润转移的前提和基础浸润转移的前提和基础 v2.肿瘤血管生成肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)v 肿瘤浸润转移的必要条件肿瘤浸润转移的必要条件v3.3.肿瘤细胞分离脱落，与细胞外基质黏附肿瘤细胞分离脱落，与细胞外基质黏附v （1 1）瘤细胞表面负电荷增加）瘤细胞表面负电荷增加 v （2 2）瘤细胞黏附力的改变）瘤细胞黏附力的改变v 瘤细胞自身结构异常瘤细胞自身结构异常 v 瘤细胞同质黏附力下降瘤细胞同质黏附力下降 v 指同种瘤细胞之间的黏附力指同种瘤细胞之间的黏附力v瘤细胞异质黏附力增加瘤细胞异质黏附力增加 v指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力v同质黏附力降低，有利于肿瘤细胞分离；同质黏附力降低，有利于肿瘤细胞分离；v异质黏附力的增加，有利于瘤细胞与基底膜、间质异质黏附力的增加，有利于瘤细胞与基底膜、间质成分粘附并穿过这些组织成分粘附并穿过这些组织v均由黏附分子介导均由黏附分子介导v通过配通过配-受体之间的识别和结合实现受体之间的识别和结合实现 v（3 3）肿瘤黏附分子）肿瘤黏附分子(adhesion molecules)细胞表面结构细胞表面结构v 钙黏蛋白钙黏蛋白(cadherin)v 又称为钙连接素，又称为钙连接素，钙黏素。钙黏素。v 依赖细胞外钙依赖细胞外钙 v 介介导导钙钙离离子子依依赖赖性性细细胞胞与与细细胞胞（同同源源细细胞胞）的黏附的黏附 v据分布不同据分布不同 E-E-钙黏蛋白钙黏蛋白v P-钙黏蛋白钙黏蛋白v N-钙黏蛋白钙黏蛋白 H-cad v 整合素整合素(integrin)v-细胞表面糖蛋白细胞表面糖蛋白 ，约有，约有20 20 多个亚型多个亚型 v-各种肿瘤细胞表面整合素种类不同各种肿瘤细胞表面整合素种类不同v-肿瘤生长各个阶段表达水平也不同肿瘤生长各个阶段表达水平也不同 v作用作用 v a.a.介导细胞与细胞外基质的黏附介导细胞与细胞外基质的黏附 v b.b.参与不同细胞之间的黏附连接参与不同细胞之间的黏附连接 v C.C.扮演细胞信号传递的角色扮演细胞信号传递的角色v配体配体-整合素整合素-细胞骨架蛋白跨膜信息传导系统细胞骨架蛋白跨膜信息传导系统v 免免 疫疫 球球 蛋蛋 白白 超超 基基 因因 家家 族族(immunoglobulin superfamily)v 主要参与细胞与细胞间的连接主要参与细胞与细胞间的连接v ICAM-1 ICAM-1（细胞间黏附分子（细胞间黏附分子-1-1）v VCAM-1 VCAM-1（血管黏附因子）（血管黏附因子）v NCAM NCAM（神经细胞黏附因子）（神经细胞黏附因子）v 其它其它 包括包括CEA CEA、DCCDCCv选择素选择素(selectin)v内源性植物凝血素（凝集素）内源性植物凝血素（凝集素）v 作用作用 介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附v 选择素家族包括：选择素家族包括：v P-selectin P-selectin v E-selectin E-selectin v L-selectin L-selectinv CD44 CD44 及其它及其它 v CD 44(CD 44(透明质酸受体透明质酸受体)v -介导细胞与细胞外基质粘附介导细胞与细胞外基质粘附 v 路易斯寡糖（路易斯寡糖（SLESLEX X，,s-Lewis,s-LewisX X ）v -血管内皮细胞血管内皮细胞E-E-选择素的配体选择素的配体v v 4.4.瘤细胞的迁移瘤细胞的迁移(migration)及化学趋向性及化学趋向性v (1)(1)瘤细胞的运动瘤细胞的运动v 黏附；肌动蛋白、微管、中间丝黏附；肌动蛋白、微管、中间丝v (2)(2)瘤细胞运动的调节瘤细胞运动的调节据其作用，大致可分为两大类：据其作用，大致可分为两大类：v仅影响运动的因子仅影响运动的因子 迁移刺激因子（迁移刺激因子（MSFMSF）v既影响运动又影响生长的因子既影响运动又影响生长的因子v AMFAMF(自分泌运动因子自分泌运动因子)v HGF/SF HGF/SF（肝细胞生长因子肝细胞生长因子/分散因子分散因子)v(3)(3)瘤细胞的化学趋向性瘤细胞的化学趋向性v 21KD 21KD 的蛋白质的蛋白质 v 骨吸收因子骨吸收因子 v5.细胞外基质的降解细胞外基质的降解v(1)肿瘤浸润细胞外基质的步骤肿瘤浸润细胞外基质的步骤v Liotta 1986年提出年提出 v 第一步第一步 黏附于基底膜或其他间质成分黏附于基底膜或其他间质成分 v 第二步第二步 分泌蛋白酶并激活分泌蛋白酶并激活,降解瘤细胞降解瘤细胞v 邻近的细胞外基质邻近的细胞外基质v 第三步第三步 进入受蛋白酶降解的基质区域内进入受蛋白酶降解的基质区域内 v(2)肿瘤细胞产生的蛋白水解酶肿瘤细胞产生的蛋白水解酶v丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子v纤维蛋白溶解酶纤维蛋白溶解酶(纤溶酶纤溶酶)v 纤溶酶原纤溶酶原 v a.降解基质降解基质 如纤维蛋白，如纤维蛋白，FN,LM,蛋白多糖蛋白多糖v b.激活胶原酶激活胶原酶 胶原降解胶原降解v尿激酶型纤溶酶原激活剂尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,u-PA）系统系统 vAu-PA：v 介导细胞周围基质蛋白的降解介导细胞周围基质蛋白的降解vBu-PA 受体（受体（u-PAR）及纤溶酶原受体）及纤溶酶原受体v v 活化活化u-PA 原酶形式的原酶形式的u-PAv纤溶酶原纤溶酶原+纤溶酶原受体纤溶酶原受体 纤溶酶纤溶酶vCPAI（PA 抑制剂）抑制剂）v PAI1 是是u-PA 的主要抑制剂的主要抑制剂 v PAI2 不同肿瘤表达意义不一不同肿瘤表达意义不一v PAI3 功能不清功能不清v基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）及其抑制因子及其抑制因子v 需钙、锌离子作辅助因子需钙、锌离子作辅助因子 v MMP 分类分类v 胶原酶：如间质胶原酶胶原酶：如间质胶原酶（Collagenase）v 明胶酶：如明胶酶明胶酶：如明胶酶A(gelatinase A)v 间质溶素：如间质溶素间质溶素：如间质溶素1、2v 膜型基质金属蛋白酶：膜型基质金属蛋白酶：、型型 v可分别降解可分别降解ECM中各种不同成分中各种不同成分v ECM降解的主要蛋白水解酶类降解的主要蛋白水解酶类v金属蛋白酶抑制物金属蛋白酶抑制物 v TIMP-1，TIMP-2 浸润与否取决于浸润与否取决于MMP与与TIMP的对比的对比v MMPTIMP ECM降解才能成为可能降解才能成为可能v胱氨酸蛋白酶类胱氨酸蛋白酶类 v Cathepsin B v作用作用v 降解降解ECM中各种胶原、中各种胶原、LM、FN、黏蛋白、黏蛋白v 激活间质胶原酶和激活间质胶原酶和IV型胶原酶型胶原酶v天（门）冬氨酸蛋白酶天（门）冬氨酸蛋白酶 vcathepsin D,Ev 在肿瘤浸润转移中的作用在肿瘤浸润转移中的作用 v CD 表达的调节表达的调节v6.瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子v 微小淋巴管、微小静脉壁微小淋巴管、微小静脉壁 缝隙缝隙v 血管血管 基底膜缺损基底膜缺损 v瘤细胞存在形式瘤细胞存在形式 v 单个单个v 成团成团 同类癌栓同类癌栓 v 异类癌栓异类癌栓v 黏附分子对其发挥调节作用黏附分子对其发挥调节作用v v7.在在特特定定器器官官的的毛毛细细血血管管滞滞留留并并黏黏着着，再再次次穿穿过过血血管壁并定居、增殖管壁并定居、增殖v 器官特异性（选择性）机制器官特异性（选择性）机制v (1)黏附分子的作用黏附分子的作用v (2)化学趋化因子（归巢现象化学趋化因子（归巢现象)v (3)微环境不适合微环境不适合v (4)与免疫状态有关与免疫状态有关v（二）（二）机体免疫状态与肿瘤浸润转移机体免疫状态与肿瘤浸润转移v 参与控制转移的免疫细胞主要有参与控制转移的免疫细胞主要有 v NK NK 细胞细胞v 巨噬细胞巨噬细胞v T T 淋巴细胞淋巴细胞v （三）肿瘤浸润转移相关基因（三）肿瘤浸润转移相关基因v 转移相关基因转移相关基因v指指基基因因的的表表达达和和改改变变能能够够促促进进或或导导致致肿肿瘤瘤发发生生转移的基因转移的基因 v v（四）肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移（四）肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移v表观遗传学表观遗传学(Epigenetics)v-与遗传学与遗传学(genetic)(genetic)相对应的概念相对应的概念v-表型状态改变，基因型不改变表型状态改变，基因型不改变 v-没有没有DNADNA序列变化的情况下，序列变化的情况下，可遗传的基因可遗传的基因v表达改变，导致的基因产物的变化。表达改变，导致的基因产物的变化。v -1942-1942年提出，上世纪年提出，上世纪8080年代后期逐渐兴起的一年代后期逐渐兴起的一门新学科门新学科 DNADNA的的“后天性后天性”修饰修饰 v CpGCpG岛高甲基化岛高甲基化v 癌细胞基因组低甲基化癌细胞基因组低甲基化组蛋白残基的各种修饰组蛋白残基的各种修饰v 磷酸化磷酸化v 乙酰化乙酰化v 甲基化甲基化v 泛素化等等泛素化等等 v（五）肿瘤干细胞（五）肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)v 2001年由年由Reya等提出等提出v 2006年美国癌症研究协会（年美国癌症研究协会（AACR）定义）定义v 存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞 v 特征特征 v (1)无限增殖和多向分化无限增殖和多向分化 v (2)存在自我更新的信号传导途径存在自我更新的信号传导途径v (3)具不同表型，异质性，对放化疗不敏感具不同表型，异质性，对放化疗不敏感v (4)具有端粒酶活性具有端粒酶活性 v (5)能转移到各种不同的组织能转移到各种不同的组织 v（六）肿瘤微环境与肿瘤浸润转移（六）肿瘤微环境与肿瘤浸润转移 v肿瘤细胞肿瘤细胞v间质细胞间质细胞 v细胞外基质细胞外基质v间质细胞所分泌的活性介质（细胞因子）间质细胞所分泌的活性介质（细胞因子）v 共同构成的局部内环境共同构成的局部内环境 v微环境改变微环境改变v肿瘤细胞肿瘤细胞v-自分泌和旁分泌自分泌和旁分泌 v全身和局部组织全身和局部组织v-代谢、分泌、免疫代谢、分泌、免疫v 结果：结果：限制或促进肿瘤的发生和发展限制或促进肿瘤的发生和发展 v三三.肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用用v(一一)蛋白表达异常的检测蛋白表达异常的检测-免疫组化（荧光）定位免疫组化（荧光）定位-ELISA和和Western blot、流式细胞术定量、流式细胞术定量 抗体抗体标标记记抗原抗原标标记记抗体抗体细细胞胞细细胞胞抗体抗体标标记记抗原抗原标标记记细细胞胞v（二）蛋白质相互作用的检测方法（二）蛋白质相互作用的检测方法v1.1.酵母双杂交法酵母双杂交法v 验证两个已知蛋白的相互作用验证两个已知蛋白的相互作用v 筛选与已知蛋白作用的未知蛋白筛选与已知蛋白作用的未知蛋白v酵母双杂交系统是分析蛋白酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效蛋白间相互作用的有效和快速的方法，和快速的方法，v酵母双杂交的原理是将酵母双杂交的原理是将2个目的蛋白分别与转录激活区（个目的蛋白分别与转录激活区（transcription activation domain，AD）和）和DNA 结合区（结合区（DNA-binding domain，DBD）融合产生新的融合蛋白，如果这）融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使该相互作用会促使AD和和DBD 互相靠近而产生有活性的转录因子，进而互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。v（真核转录因子（真核转录因子DBD能把蛋白定位到基因组特定能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上，序列上，AD能够能够使转录装置激活基因转录。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功使转录装置激活基因转录。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能，但当它们在空间上彼此联系时，则能够激活基因转录。）能，但当它们在空间上彼此联系时，则能够激活基因转录。）v局限性局限性 v双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内内 v酵母双杂交系统的一个重要的问题是酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性假阳性”v2.免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）v是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的常用、经典方法。究蛋白质相互作用的常用、经典方法。v其基本原理是其基本原理是:v细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及及Western blotting分析。分析。v缺点缺点v免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通过第三者间接相互作用的蛋白是通过第三者间接相互作用的蛋白v灵敏度不及蛋白亲和色谱高灵敏度不及蛋白亲和色谱高v必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，方测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性法本身具有冒险性v假阳性的概率比较高假阳性的概率比较高v设置的对照包括：设置的对照包括：v在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等系作为阴性对照等等。v3.GST沉淀实验（沉淀实验（GST-pull down实验）实验）v主要是用来证明细胞外蛋白质相互作用主要是用来证明细胞外蛋白质相互作用v利用利用GST(Glutathione-S-transferase，GST)和谷胱甘和谷胱甘肽亲和树脂之间的高亲和性肽亲和树脂之间的高亲和性v将将GST固化在树脂上固化在树脂上vGST和谷胱甘肽转移酶蛋白在细菌、动物细胞等体和谷胱甘肽转移酶蛋白在细菌、动物细胞等体系中融合表达系中融合表达v固化的诱饵蛋白固化的诱饵蛋白【即诱饵蛋白即诱饵蛋白(Bait protein)】可以捕获可以捕获细胞裂解物中的互作用靶蛋白细胞裂解物中的互作用靶蛋白v洗洗脱脱结结合合物物后后通通过过western blot 检检测测诱诱饵饵蛋蛋白白和和靶靶蛋蛋白白,从从而而证证实实两两种种蛋蛋白白间间的的相相互互作作用用或或筛筛选选相相应应的的目的蛋白目的蛋白 v4.Far-Western blottingv在经典在经典Far-Western印迹中，运用经标记的印迹中，运用经标记的或可被抗体检测的或可被抗体检测的“诱饵诱饵”蛋白检测转移膜蛋白检测转移膜上的上的“猎物猎物”靶蛋白。靶蛋白。v用用SDS-PAGE 或非变性或非变性PAGE分离含有未知分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。膜。v转膜后与已知诱饵蛋白孵育，运用该诱饵蛋转膜后与已知诱饵蛋白孵育，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统检测。（出相应条带白的特异性检测系统检测。（出相应条带+）v5.生物信息学生物信息学v（三）基因拷贝数、转录产物（三）基因拷贝数、转录产物mRNA异常异常v-核酸分子生物学方法进行检测核酸分子生物学方法进行检测v核酸变性、复性基本性质核酸变性、复性基本性质v常用方法常用方法 1.核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridisation）技术）技术v最常用的基本技术最常用的基本技术v基本原理：基本原理：v -标记的已知碱基序列标记的已知碱基序列v（DNA或或RNA单链片段）单链片段）v（探针（探针probe）v （同位素（同位素P32 I125v 非同位素非同位素 生物素生物素 地高辛地高辛 荧光素）荧光素）v -检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之v 同源的序列同源的序列 v（1）原位杂交原位杂交 （ISHISH）v（2 2）荧光原位杂交）荧光原位杂交 （FISHFISH），），v（3 3）双色（多色）银染原位杂交（）双色（多色）银染原位杂交（DSISHDSISH）v（4 4）Southern blot(DNA Southern blot(DNA 杂交杂交)v（5 5）Northern blot(RNA Northern blot(RNA 杂交杂交)v2.聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术）技术 又称体外基因扩增又称体外基因扩增利用利用DNA变性和复性原理变性和复性原理体外进行体外进行特定的特定的DNA 片段高效扩增片段高效扩增 获得或放大特异基因信号的重要手段获得或放大特异基因信号的重要手段v扩增产物的检测扩增产物的检测 凝胶电泳分析凝胶电泳分析 v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(最常用最常用)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带单一条带v Real-time PCRReal-time PCRv RT-PCR RT-PCRv3.3.基因芯片技术基因芯片技术v(四四)基因突变的检测方法基因突变的检测方法v1.1.聚合酶链反应聚合酶链反应-单链构象多态性分析单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products,PCR-SSCP）v长度相同，构象不同长度相同，构象不同v在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳v迁移率（泳动率）不同迁移率（泳动率）不同v碱基序列不同的单链碱基序列不同的单链DNADNA构像改变构像改变v基本方法基本方法v 作作PCRPCRv 将产物变性而成为单链将产物变性而成为单链v 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 v 显示结果显示结果v 可用同位素可用同位素/荧光素标记荧光素标记 v 非同位素标记非同位素标记 v2.PCR-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（restrection fragment length polymorphisms,RFLP）分析技分析技术术v基本原理基本原理 v-序列中一个碱基发生改变序列中一个碱基发生改变 v-使原来的内切酶位点消失使原来的内切酶位点消失v或产生新的酶切位点或产生新的酶切位点v-用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化PCRv扩增出来的扩增出来的DNA片段片段 -检测其酶切片段长度的差异检测其酶切片段长度的差异v3.变性梯度凝胶电泳法变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)v基本原理基本原理v 电泳时，不同浓度凝胶温度不同电泳时，不同浓度凝胶温度不同v DNA链中有一个碱基改变链中有一个碱基改变v 在不同的温度发生解链在不同的温度发生解链v 电泳迁移率改变电泳迁移率改变v v 4.DNA 序列分析（序列分析（DNA sequencing）v 5.荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH)v 6 DNA 芯片技术（芯片技术（DNA chip）v（五）肿瘤的微卫星不稳定性分析（五）肿瘤的微卫星不稳定性分析v微卫星不稳定性微卫星不稳定性（microsatellite instability,MI）,是指简单重复序列的增加或丢失是指简单重复序列的增加或丢失 v PCR+DNA 序列凝胶电泳序列凝胶电泳（六）肿瘤易感性检测（六）肿瘤易感性检测 v采用相应基因变异方法进行检测采用相应基因变异方法进行检测（七）肿瘤相关病毒（七）肿瘤相关病毒v 核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCR技术技术 (八八)基因重组技术基因重组技术v 主要目的是获得某一基因或主要目的是获得某一基因或DNA片段的大片段的大v 量拷贝量拷贝 (九九)基因转染基因转染（gene transfection）技术技术（十（十）RNARNA干涉干涉(RNA interference）核酸杂交核酸杂交/PCR技术与蛋白表达技术与蛋白表达【免疫组化免疫组化/荧光、流式荧光、流式细胞术、细胞术、WB方法结合、蛋白结合检测方法方法结合、蛋白结合检测方法】v-蛋白表达蛋白表达 在翻译水平上定位研究基因表达在翻译水平上定位研究基因表达 v-核酸杂交核酸杂交/PCR技术技术 检测检测DNA/RNA，在基因或转在基因或转录水平研究基因表达录水平研究基因表达 v（十一）（十一）DNA-蛋白质结合检测蛋白质结合检测v1.凝胶阻滞实验（凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）vDNA迁移率变动试验（迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（）或条带阻滞实验（Band retardation assay）v基本基本 原理原理：v 在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 中，中，D N A和蛋和蛋白质的复合物的迁移速度比单一的白质的复合物的迁移速度比单一的 D N A片段或双片段或双链的寡核苷酸慢链的寡核苷酸慢 v反应产物反应产物 电泳分析电泳分析vD N A与蛋与蛋 白质结合的特异性通过非标记白质结合的特异性通过非标记D N A竞竞争性实验来确定争性实验来确定v2.足迹实验（足迹实验（foot-printing assay）v原理：原理：v当当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割酶的切割,而不产而不产生出相应的切割分子生出相应的切割分子,在凝胶电泳放射性自显影图在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区片上便出现了一个空白区,俗称为俗称为“足迹足迹”.v3.染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术v（chromatin immunoprecipitation assay,CHIP）v基本原理：基本原理：v在活细胞状态下固定蛋白质在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物复合物,并将其随并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过然后通过免疫学方法沉淀此复合体免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结特异性地富集目的蛋白结合的合的DNA片段片段v（十二）（十二）激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection，LCM)v-显微镜直视下显微镜直视下v-组织切片组织切片v-确确定定、分分离离、纯纯化化单单一一类类型型细细胞胞群群或或单单个个细胞细胞