第五章-海洋动物的细胞操作.ppt

第五章第五章 海洋动物海洋动物(dngw)(dngw)的细胞操作的细胞操作第一页，共四十三页。第一节第一节 概论概论(giln)(giln)第二页，共四十三页。一、定义(dngy)(dngy)：细胞操作（或细胞工程）:利用细胞融合和显微操作等方法对生物体的基本单位-细胞(包括体细胞和生殖细胞)直接用手操作,创造出对人类有价值的物质和生命体的技术。包括细胞融合技术、细胞器移植、染色体工程(gngchng)和组织培养技术。细胞操作、染色体操作以及基因操作的关系密切，有时统称细胞操作。第三页，共四十三页。第四页，共四十三页。第五页，共四十三页。第六页，共四十三页。细胞融合（cellfusion）又称细胞杂交（cellhybridization）。它是指用人工方法使2种或2种以上的体细胞合并形成一个细胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。在自然(zrn)情况下，体内或体外培养细胞间所发生的融合，称为自然融合。而在体外用人工方法（使用融合诱导因子）促使相同或不同的细胞间发生融合，称为人工诱导融合。第七页，共四十三页。第八页，共四十三页。二、细胞工程的优势(yush)(yush)细胞工程的优势在于避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接(zhji)转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，因而能够提高基因的转移效率。第九页，共四十三页。三、细胞操作(cozu)(cozu)意义通过细胞融合技术，可以培育出新物种，打破了传统的只有同种生物杂交(zjio)的限制，实现种间的杂交(zjio)。这项技术不仅可以把不同种类或者不同来源的植物细胞或者动物细胞进行融合，还可以把动物细胞与植物细胞融合在一起。这对创造新的动、植物和微生物品种具有前所未有的重大意义。第十页，共四十三页。四、细胞操作的基本(jbn)(jbn)手段包括增殖(zngzh)(通过培养)分离(包括分割）混合(包括融合)移植(包括注入)第十一页，共四十三页。第十二页，共四十三页。1、体细胞及配子的制备(1)细胞制备：除游离细胞(血球)外，在进行体细胞分离时，要将组织切碎，用无Ca2+和无Mg2+的盐溶液清洗，然后，再用胰蛋白酶或胶原酶消化，使细胞分离。(2)培养和维持：体细胞的保存精子的保存：特定的盐溶液或冷冻法保存卵子的保存：采集(cij)后立刻受精受精卵可在海水或淡水中发育第十三页，共四十三页。2、卵和早期胚胎的细胞操作的前处理（1）卵膜的去除：不管是未受精卵还是受精卵，一接触水即吸水，卵膜和卵的表面分离，很容易用镊子剥去，也可用蛋白酶消化除去(chq)。所使用的酶有蛋白酶、木瓜酶、枯草溶菌素胰酶制剂等。不同的鱼类，其卵膜消化的时间有长有短。（2）无膜卵的培养：除去卵膜的卵(裸卵)抵抗物理冲击能力很弱，所以应尽可能不要移动它。将裸卵放在有冻粉或角蛋白涂层的器皿里也能减少裸卵的损伤。第十四页，共四十三页。（3）卵膜硬化的抑制：虹蹲卵受精后在1mmol/L还原型谷光甘肽水溶液(PH8.0)中吸水,可以阻止卵膜蛋白质的ss键形成(xngchng)的卵膜硬化。受精后已经硬化的卵膜可用尖刀或手术刀切开或用微型打孔器在膜上开孔。第十五页，共四十三页。五、海洋(h(hiyng)iyng)动物细胞操作特点1、海洋动物自诞生以来，就生存在环境相对稳定的海洋中，从无脊椎动物到低等脊椎动物(鱼类)种类繁多。2、海洋动物与陆生动物相比，其体制比较原始(yunsh)。多数配子(卵子和精于)排到体外(水中)受精，再发育成为个体。3、海洋生物具有多样性的特点，并且取材容易。第十六页，共四十三页。第十七页，共四十三页。六、研究(ynji)(ynji)方向1、性别控制:性别控制是通过人为地干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖技术。可以通过人工授精或体外授精将分离的优良精子注入(zhr)受体，精子的分离可通过物理、免疫、流动细胞等分离方法进行分离。授精后，可通过胚胎性别鉴定，如染色质、染色体组型鉴定法、雄性特异抗原鉴定或分子生物学SRY-PCR鉴定。第十八页，共四十三页。2、嵌合体：嵌合体是由两个遗传上不同的细胞混合起来组成的生物体。可以作为一种研究用动物、用来探索动物的免疫宽容度、杂种优势和细胞谱系等，在理论研究上具有重要意义。在海洋动物产业的物种方面，能扩大遗传因子的范围，培育(piy)山适应环境变化的个体，即使在不能形成杂种的种类间，也可获得具有双亲优良品质的物种。获得嵌合体有多种方法，比较实用的方法是基因导入法，又称基因工程。第十九页，共四十三页。我国朱作言等(985，1986，989)利用显微注射法将人生长激素基因先后转移到金鱼、泥锹、鲤鱼和鲫鱼中，培育出多种转基因鱼。英国人把老鼠生长激素基因注入(zhr)虹蹲受精卵，培育出生长快、个体大的超级虹蹲。第二十页，共四十三页。第二十一页，共四十三页。第二十二页，共四十三页。第二节性决定(性别(xngbi)(xngbi)控制)一、海洋动物性别决定的特点1、性染色体缺少或处于进化的初始阶段：海洋动物一般缺乏性染色体或性染色体处于进化的初级阶段，不少种类(zhngli)性别受多基因影响，这些基因往往分布于不同的染色体上。2、表型性别容易改变，海洋动物的性别容易改变，有些海洋动物的性别在很大程度上受环境条件影响，有的其至完全取决于环境。如牡蛎,黑鲷第二十三页，共四十三页。鱼类的原始生殖上皮组织，同时具有决定向雌性发育的皮质部分和决定向雄性发育的髓质部分的两个组织部分。在雌性激素作用(zuyng)下，皮质部分会分化为卵巢，髓质部分不发育而呈雌性具有产卵生殖功能；反之，在雄性激素作用(zuyng)下，鱼会变成雄性的。所以，鱼类性别分化具有相当大的可塑性，完全可以按人们的要求，促进鱼类性别的转化，获得单性别的鱼类。如罗非鱼和虹鳟鱼.第二十四页，共四十三页。（3）性变后个体具有正常的功能：彻底性反转的海洋动物都具有正常的生殖能力。性反转个体在繁衍后代(hudi)时，能依照性变后的表型性别产生配子,但性别遗传型不变.第二十五页，共四十三页。(4)YY型雄鱼可育；YY型雄鱼不但具有(jyu)很高的成活率和正常的生育力，而且还可以被雌激素反转为功能正常的雌鱼。第二十六页，共四十三页。二、海洋动物性别控制的意义1、提高群体生长率：雌雄性别个同生产(shngchn)性能往往不同。2、控制繁殖速度3、延长有效生长期4、提高水产品质量第二十七页，共四十三页。三、方法的选择1、性决定的样式，限于(xiny)雌同型-雄异型配子的动物。海洋无脊椎动物的性决定机构不明显。多数鱼类，性染色体用x、Y表示，雌的XX型、雄的XY型。2、由于两型精子在形态、组成、比重、生化特性、被膜抗原和活力等各方面的差 异，有可能应用各种方法，给以分离。X和Y精子的分离是性别控制的基本原理。第二十八页，共四十三页。四、实验举例：1、伪雄(XX型)及超雄鱼(YY型)的培育：（1）排卵：给成熟雌性的金鱼或鲋鱼腹腔注射胎盘绒毛(rngmo)膜促性腺激素100IU/mL，使其排卵。（2）将金鱼的精液或泥鳅的精巢磨碎用林格氏液将原液稀释100倍，作为稀释精液用。第二十九页，共四十三页。(3)伪雄(XX型)个体的培育：A、紫外线照射泥鳅稀释精液；B、遗传上不活化(huhu)的精子与金鱼卵受精，诱发雌核发育；C、在22下接触水5分钟后，低温处理卵(0,30min)，使其二倍体化；D、在孵化后2080天期间、投喂添加50ug/g甲基睾酮饲料；所获得的雄性个体,只产生X精子。第三十页，共四十三页。第三十一页，共四十三页。(4)超雄个体的培育：A、给金鱼卵射线照射(zhosh)，使其细胞核在遗传上失去作用；B、然后立即用精子受精，诱导雄核发生；C、22，接触水45min，后将卵用高温处理(40，1min)，使其二倍体化。所获得的雄性，全部是超雄个体(YY型)，只产生Y精于。第三十二页，共四十三页。第三十三页，共四十三页。第三节嵌合体动物(dngw)(dngw)的培育一、意义：1、定义：所谓嵌合体（Chimera），是将两个遗传上不向的细胞混合(hnh)起来发育得到的生物体。2、完全的转基因鱼与嵌合体转基因鱼区别：外源基因在受精卵分裂后某阶段才整合入受体基因组中，则肯定那些从整合了外源基因的细胞发育而来的组织才含有外源基因序列。这种仅在部分组织中整合有外源基因的动物称为嵌合体。第三十四页，共四十三页。3、应用：A、在海洋动物水产养殖方面，嵌合体主要以扩遗传因子的范围，培合适应环境变化的个体为目标；B、即使在不能形成杂种的动物之间，利用制作嵌合体的方法也可获得具有(jyu)双亲优良品质的动物；C、转基因动物的实用化，有必要用相同的外来基因置换特定的基因第三十五页，共四十三页。二、方法的选择：（一）嵌合体类型：1、胚细胞未分化的早期胚胎形成嵌合体：嵌合体的状态将涉及(shj)整个细胞系(全身嵌合体，一次嵌合体)；2、器官形成后的胚成体形成嵌合体：局部嵌合体(二次嵌合体)，也可以形成特定的细胞系嵌合体：3、进展：取自身的造血干细胞,在体外培养，导入有用基因后，再返回到体内，以改变动物遗传特性的方法，已在哺乳类实用化第三十六页，共四十三页。（二）操作方法：(1)凝集(nngj)法(aggregationmethed)：除去卵膜后，在囊胚期用细玻璃针将胚盘的一部分刺伤、将其他胚盘的细胞块移入第三十七页，共四十三页。(2)显微注射法(microinjectionmethed):将一个(y)胚盘分离出的分裂球,用毛细吸管注入另一胚盘的内部(3)基因导入法(genetransfermethed):在二细胞期后,用毛细吸管给一部分分裂球或单细胞的卵导入外源基因第三十八页，共四十三页。第三十九页，共四十三页。三实验(shyn)(shyn)举例1、人工催情，分别收集(shuj)鱼的卵子和精液，体外人工受精；2、受精后35min，用0.25的胰蛋白酶消化除卵壳；3、将裸卵移入盛有Holtfreter氏培养液的平面皿中；4、将外源基因装入玻璃微针，在第一次卵裂前实施外源基因的显微注射手术。每卵注射12nL的DNA溶液，约含1106拷贝的外源基因；第四十页，共四十三页。5、显微注射后，受体卵在Holffreter氏溶液中培养发育(fy)。6、胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释；发育至心跳期后，将胚胎转移到暴气的冷开水中直至形成鱼苗。7、在胚胎发育过程中，需精心管理，及时去除死胚胎。第四十一页，共四十三页。第四十二页，共四十三页。内容(nirng)总结第五章 海洋动物的细胞操作。精子的保存：特定的盐溶液或冷冻法保存。不同(b tn)的鱼类，其卵膜消化的时间有长有短。X和Y精子的分离是性别控制的基本原理。B、即使在不能形成杂种的动物之间，利用制作嵌合体的方法也可获得具有双亲优良品质的动物。(1)凝集法(aggregation methed)：除去卵膜后，在囊胚期用细玻璃针将胚盘的一部分刺伤、将其他胚盘的细胞块移入第四十三页，共四十三页。