一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011.ppt

1第一章、植物病原第一章、植物病原(bngyun)真菌的分离、真菌的分离、培养及纯化技术培养及纯化技术第一页，共六十五页。21 1）材料）材料(cilio)(cilio)：马铃薯马铃薯200g200g、葡萄糖、葡萄糖20g20g、琼脂、琼脂20g20g、水、水1000ml1000ml1、马铃薯葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂(qingzh)（PDA）培养基）培养基马铃薯葡萄糖琼脂马铃薯葡萄糖琼脂(qingzh)：potatodextroseagar,简称简称PDA；马铃薯蔗糖琼脂：马铃薯蔗糖琼脂：potatosucroseagar,简称简称PSA。一、一、真菌学研究中常见的真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌培养基的制作和灭菌第二页，共六十五页。3第三页，共六十五页。42 2）制作步骤）制作步骤马铃薯洗净，去皮称马铃薯洗净，去皮称200g200g切块切块/条，条，1000ml1000ml水煮沸水煮沸30min30min，用双层纱布滤去薯块，用双层纱布滤去薯块，加入加入15-20g15-20g琼脂，加热熔化，再加琼脂，加热熔化，再加20g20g葡萄糖，葡萄糖，待完全溶解后，趁热待完全溶解后，趁热(chn r)(chn r)用双层纱布再过滤，用双层纱布再过滤，补水并定容到补水并定容到1000ml,1000ml,分装于三角瓶或试管中，分装于三角瓶或试管中，塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。第四页，共六十五页。5自然自然pH；调调pH值值，也可用也可用1mol/L的的NaOH或或HCl调至调至pH为为5.56.5之间，最后加水补足至之间，最后加水补足至1000mL。Tips:实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子子(lz)，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。第五页，共六十五页。62、植物组织和煎汁、植物组织和煎汁许多植物材料如豆荚许多植物材料如豆荚(duji)、茎秆、种子等，可以、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。养基使用。植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，如加琼脂即能制成固体培养基。如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须当然，必须灭菌后灭菌后才能使用。才能使用。第六页，共六十五页。73、培养基的分装、培养基的分装根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中。角瓶中。试管分装时，使用玻璃漏斗。试管分装时，使用玻璃漏斗。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的为管高的1/5左右左右，用三角瓶分装培养基时，容量不，用三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的宜超过容积的1/3-1/2。注意注意(zhy)：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。塞而引起污染。第七页，共六十五页。8制备好的培养基必须经过灭菌制备好的培养基必须经过灭菌(mijn)，方能使用。，方能使用。4、灭菌、灭菌(mijn)高压高压(goy)蒸汽灭菌：蒸汽灭菌：15磅磅/英寸或英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持持续续15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干晾干/烘烘干干、包装好，进行干热灭菌。、包装好，进行干热灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌化学灭菌、以及辐射灭菌等。化学灭菌、以及辐射灭菌等。第八页，共六十五页。9 滤滤膜膜孔孔径径主主要要(zhyo)(zhyo)有有0.22 0.22 m m和和0.450.45m m两两种种。过过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。第九页，共六十五页。10第十页，共六十五页。115 5、斜面、斜面(ximin)(ximin)、平板培养基的制作、平板培养基的制作试管培养基试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/52/5至至3/53/5，冷凝后，冷凝后即成斜面培养基。即成斜面培养基。三角瓶三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。方法是方法是：将培养基冷却至：将培养基冷却至45455050（低于（低于4545易凝固，应在水浴锅中易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL15mL，平置、，平置、凝固即成。凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用注意：操作者事先必须洗净手，并用70%70%酒精消毒。酒精消毒。第十一页，共六十五页。12二、真菌二、真菌(zhnjn)分分离离 植物病原菌的分植物病原菌的分离离(fnl)(fnl)培养，是植物培养，是植物病理实验室工作中的病理实验室工作中的基本技能。基本技能。第十二页，共六十五页。13真菌的分离真菌的分离-就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们供给适当的条件，使它们(t men)(t men)繁殖而得到纯培养。繁殖而得到纯培养。一般是根据该微生物对一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气营养、酸碱度、氧气等条等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而而(cng r)(cng r)得到纯菌株。得到纯菌株。第十三页，共六十五页。14 观察观察(gunch)(gunch)一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而体而 作出作出诊断诊断。同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生长的的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生长的腐生性腐生性真菌。真菌。因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。此外，为了此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，或或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培养物是必要的。者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培养物是必要的。（一）目的意义（一）目的意义第十四页，共六十五页。15分分离离和和培培养养应应该该在在无无菌菌至至少少很很清清洁洁的的条条件件(tiojin)(tiojin)下下进行。进行。（二）、真菌分离（二）、真菌分离(fnl)(fnl)的程序的程序1 1分离前的准备分离前的准备(zhnbi)(zhnbi)工作工作第十五页，共六十五页。161.1 1.1 清洁环境：清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件分离工作严格说应在无菌条件(tiojin)(tiojin)下进行，无下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。为了为了(wi le)(wi le)保证无菌操作，应注意下面几点：保证无菌操作，应注意下面几点：1.2 1.2 若限于条件实验只能在若限于条件实验只能在普通房间普通房间进行时，必须对房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水水，以，以消除消除(xioch)(xioch)室内尘埃，工作台上铺好室内尘埃，工作台上铺好湿毛巾湿毛巾，点燃酒，点燃酒精灯。精灯。第十六页，共六十五页。171.3 1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品分离工作开始前最好将所需的一切用品(yngpn)(yngpn)都准备都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；1.4 1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；1.5 1.5 无菌操作前还要用无菌操作前还要用7070酒精擦手；酒精擦手；1.6 1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。第十七页，共六十五页。18分离材料的选择对分离培养分离材料的选择对分离培养(piyng)(piyng)的成败有着决定的影响。的成败有着决定的影响。病害材料应尽可能新鲜病害材料应尽可能新鲜，如可选择，如可选择新近发病新近发病的植株、器官或的植株、器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。最好在病、健交接处选材取样最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。2 2分离材料分离材料(cilio)(cilio)的选择的选择第十八页，共六十五页。19 例如：例如：果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的部分分根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的部分分离。离。值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到病菌的。当然中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到病菌的。当然(dngrn)(dngrn)，这类病害是比较少的。，这类病害是比较少的。从受害的边缘部分分离这一原则，对于从受害的边缘部分分离这一原则，对于(duy)(duy)绝大绝大部分病害都是适用的。部分病害都是适用的。第十九页，共六十五页。20 采得的材料如已经败坏采得的材料如已经败坏(bihui)(bihui)而沾染大量的腐生菌，有时可以而沾染大量的腐生菌，有时可以采用接种后再分离的方法采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作为，即将沾染有腐生菌的病组织作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得较多的再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得较多的是植物病原细菌的分离。是植物病原细菌的分离。引起果实引起果实(gush)和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫和疫霉属霉属(Phytophthora)的真菌，用这种方法分离的效果也很好。的真菌，用这种方法分离的效果也很好。分离烟草的根腐病菌分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，将烟草种，用这种方法效果也很好，将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后子播在培养皿中的吸水纸上，然后(rnhu)用田间采得的烟草病根切成用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生长而得到纯培养。长而得到纯培养。第二十页，共六十五页。21 （1 1）酒精酒精 用用酒精（酒精（70%70%）消毒消毒(xio d)(xio d)，只浸很短的时间（几秒钟，只浸很短的时间（几秒钟到到1 1分钟），然后用灭菌水冲洗；分钟），然后用灭菌水冲洗；较大的材料较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧去。酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧去。3 3组织组织(zzh)(zzh)的表面消毒剂的表面消毒剂第二十一页，共六十五页。22配方配方(pi fng)(pi fng)为：为：升汞升汞 1g1g，浓盐酸浓盐酸2.5mL2.5mL，加水加水 至至1000mL1000mL。将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。释。升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。染料。消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般而异，一般3 35 5分钟。消毒后用无菌水冲洗分钟。消毒后用无菌水冲洗3 34 4次。次。（2 2）升汞升汞(shn(shn nn)溶液（溶液（0.1%）第二十二页，共六十五页。23（3 3）次氯酸钠次氯酸钠NaClONaClO3 3 由于由于(yuy)(yuy)漂白粉的成分不固定而影响其消毒漂白粉的成分不固定而影响其消毒效果，目前多改用次氯酸钠效果，目前多改用次氯酸钠.消毒所用的浓度一般是消毒所用的浓度一般是3%-5%3%-5%的水溶液，消毒时的水溶液，消毒时间间5-155-15分钟分钟。幼嫩的幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短消毒时间应尽量缩短。比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗洗8 8、9 9次。次。第二十三页，共六十五页。244 4常规分离常规分离(fnl)(fnl)方法方法植物病原真菌的分离方法主要有两种：植物病原真菌的分离方法主要有两种：组织分离法组织分离法和和稀释分离法稀释分离法。组织分离法组织分离法是最常用是最常用(chn yn)(chn yn)的方法的方法.稀释分离法稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。原真菌的分离。第二十四页，共六十五页。25植植物物病病原原真真菌菌的的分分离离一一般般都都是是用用组组织织分分离离法法。就就是是切切取取小小块块病病健健组组织织，经经表表面面消消毒毒和和灭灭菌菌水水洗洗过过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。切切取取组组织织的的大大小小要要适适宜宜，一一般般可可将将较较大大(jio(jio d)d)的的组组织织，在在消消毒毒液液中中消消毒毒后后切切取取中中央央部部分分，经经灭灭菌菌水洗过以后培养。水洗过以后培养。4.1 4.1 组织组织(zzh)(zzh)分离法分离法第二十五页，共六十五页。261 1）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成5mm5mm5mm5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小方块若干，装于火焰灭菌(mi jn)(mi jn)的小碟中。的小碟中。注注:选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。斑点病害应在临近健全组织的部分分离。植物病原真菌的植物病原真菌的组织组织(zzh)(zzh)分离分离的技术与步骤：的技术与步骤：第二十六页，共六十五页。272 2）向装有病组织的小碟中加入向装有病组织的小碟中加入70%70%酒精（约半酒精（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉酒精。碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉酒精。注注:先用先用7070的酒精浸的酒精浸2 2、3s3s是为了消除寄主表面的气泡，减少是为了消除寄主表面的气泡，减少(jinsho)(jinsho)表面张力，表面张力，7070的酒精亦用于表面消毒，处理的时间的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短较短(一般数秒至一般数秒至lmin)lmin)。第二十七页，共六十五页。283 3）向小碟中加入向小碟中加入0.1%0.1%升汞或升汞或10%10%次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间可自（约半碟）进行表面消毒，处理时间可自3030秒秒至至3 3分钟不等，然后倒掉废液。分钟不等，然后倒掉废液。注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s30s至至30min30min不等，如不等，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之(fnzh)(fnzh)则可长些则可长些一般情况下，需时间一般情况下，需时间3 3、5min5min。第二十八页，共六十五页。294 4）向小碟中加灭菌向小碟中加灭菌(mi jn)(mi jn)水，冲洗水，冲洗3-43-4次次（除去残留的消毒剂除去残留的消毒剂），将病组织转移到灭菌将病组织转移到灭菌滤纸上吸去多余的水（滤纸上吸去多余的水（以大大减少病组织附近以大大减少病组织附近出现细菌污染出现细菌污染）。第二十九页，共六十五页。305 5）将吸干水分的病组织）将吸干水分的病组织(zzh)(zzh)移到预先倒好移到预先倒好的的PDAPDA平板上，注意要用平板上，注意要用镊子轻压组织镊子轻压组织使其着使其着靠在培养基上。靠在培养基上。第三十页，共六十五页。316 6）每皿）每皿5 5块，均匀摆放，块，均匀摆放，倒置倒置于于2525培养箱中培养。培养箱中培养。4-54-5天后天后(tin hu)(tin hu)检查结果。写明日期、姓名等。检查结果。写明日期、姓名等。第三十一页，共六十五页。32各各种种真真菌菌病病害害发发生生(fshng)(fshng)的的部部位位和和症症状状不不同同，其其分分离离要要根根据据具具体体情情况况，采采用用不不同同的的方方法法，下下面面介介绍绍几几种种典型材料的分离法。典型材料的分离法。4.1.1 4.1.1 斑点斑点(bndin)(bndin)病病原真菌的分离病病原真菌的分离4.1.2 4.1.2 维管束组织内病原真菌维管束组织内病原真菌(zhnjn)(zhnjn)的分离的分离4.1.3 4.1.3 根腐病菌的分离根腐病菌的分离4.1.4 4.1.4 肉质组织中病菌的分离肉质组织中病菌的分离4.1.5 4.1.5 种子内病菌的分离法种子内病菌的分离法第三十二页，共六十五页。334.1.1 4.1.1 斑点病病原斑点病病原(bngyun)(bngyun)真菌的分离真菌的分离 从病斑切取每边约从病斑切取每边约3-5mm3-5mm的小块病组织，用的小块病组织，用70%70%的酒的酒精浸几秒钟，再在精浸几秒钟，再在0.1%0.1%的酸性升汞的酸性升汞(shn(shn nn)水溶液中水溶液中浸浸3-53-5分钟；而后用灭菌水换洗分钟；而后用灭菌水换洗3 3次，将其移置在琼脂次，将其移置在琼脂培养基平板上培养。培养基平板上培养。第三十三页，共六十五页。344.1.2 4.1.2 维管束组织内病原维管束组织内病原(bngyun)(bngyun)真菌的分离真菌的分离第三十四页，共六十五页。35 从根茎维管束组织从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主分离病菌，可先将寄主病部表面用病部表面用7070酒精酒精擦拭擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗灭菌水冲洗(chngx)(chngx)几次，移几次，移置培养基面上。置培养基面上。第三十五页，共六十五页。364.1.3 4.1.3 根腐病菌的分离根腐病菌的分离 根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。材料小的可以仿照材料小的可以仿照(fngzho)(fngzho)斑点病的分离法。斑点病的分离法。材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。第三十六页，共六十五页。374.1.4 4.1.4 肉质组织中病菌的分离肉质组织中病菌的分离 多肉的茎、根和果实等，可以多肉的茎、根和果实等，可以(ky)(ky)采用维管束组织采用维管束组织内病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织内病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织分离。分离。如有杂菌感染如有杂菌感染(gnrn)可采用可采用“直接接种直接接种”法，待出现症法，待出现症状后，用此法再状后，用此法再行分离。行分离。第三十七页，共六十五页。38第三十八页，共六十五页。39种子如在种子如在未破裂未破裂的果荚的果荚内，可以内，可以不经过不经过表面表面消毒，在无菌的条件下消毒，在无菌的条件下取出移在培养基平板取出移在培养基平板(pngbn)(pngbn)上培养。上培养。4.1.5 4.1.5 种子内病菌的分离法种子内病菌的分离法 将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒（升汞（升汞(shn(shn nn)或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在琼脂培养基平板上培养。琼脂培养基平板上培养。第三十九页，共六十五页。40 稀释稀释(xsh)(xsh)法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离离细菌和酵母菌细菌和酵母菌等。等。4.2 4.2 稀释稀释(xsh)(xsh)分离法分离法植物植物(zhw)(zhw)病原真菌的病原真菌的分离一般很少用稀释分离一般很少用稀释法分离，但有些产生法分离，但有些产生大量大量孢子孢子的病原真菌和的病原真菌和霉菌，可以配成孢子悬霉菌，可以配成孢子悬浮液稀释分离。浮液稀释分离。第四十页，共六十五页。41方法：方法：用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液，液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上，基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至后冷却至4545的培养基，的培养基，轻轻振荡轻轻振荡(zhndng)(zhndng)、平置、凝固后倒置培养。、平置、凝固后倒置培养。第四十一页，共六十五页。424.2.1 4.2.1 孢子分离法孢子分离法 产生大量孢子的病菌如青霉属产生大量孢子的病菌如青霉属(PenicilliumPenicillium)、交链孢属交链孢属(AlternariaAlternaria)、小丛壳属、小丛壳属(GlomerellaGlomerella)、拟茎、拟茎点霉属点霉属(PhomopsisPhomopsis)及茎点属及茎点属(PhomaPhoma)等，则可配制成等，则可配制成孢子悬浮液孢子悬浮液,以稀释法或划线以稀释法或划线(hu xin)(hu xin)法分离。法分离。第四十二页，共六十五页。43 许多真菌的孢子在成熟时有许多真菌的孢子在成熟时有弹射弹射的作用，这样就可以将产生的作用，这样就可以将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面(xi mian)(xi mian)或者悬挂在上或者悬挂在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。第四十三页，共六十五页。44典型的是担子典型的是担子菌亚门菌亚门(ymn)大大型真菌担孢子型真菌担孢子的分离和获得：的分离和获得：担孢子无色或担孢子无色或有色，浅色的有色，浅色的担孢子需要成担孢子需要成团堆积时方能团堆积时方能辨识，一般是辨识，一般是依靠依靠“孢子印孢子印”。第四十四页，共六十五页。45 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释后用稀释(xsh)(xsh)法或划线法分离。法或划线法分离。4.2.2 4.2.2 土壤土壤(trng)(trng)带菌分离法带菌分离法第四十五页，共六十五页。46稀释稀释(xsh)倒平板法示意图倒平板法示意图第四十六页，共六十五页。47稀释稀释(xsh)涂布法示意涂布法示意图图第四十七页，共六十五页。481.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 1072.plate out 0.1 ml 平板平板(pngbn)稀释稀释法法第四十八页，共六十五页。49图图 平板划线平板划线(hu xin)(hu xin)分离法分离法1.1.斜线法斜线法 2.2.曲线法曲线法 3.3.方格法方格法 4.4.放射法放射法 5.5.四格法四格法第四十九页，共六十五页。50平板平板(pngbn)划线方法示意图划线方法示意图第五十页，共六十五页。51 分离真菌时经常有细菌分离真菌时经常有细菌(xjn)(xjn)污染。将培养基调污染。将培养基调节至酸性反应，如在节至酸性反应，如在10ml10ml培养基中加培养基中加1-21-2滴滴25%25%的乳酸，的乳酸，可使大部分细菌受到抑制，而并不影响真菌的生长。可使大部分细菌受到抑制，而并不影响真菌的生长。4.3 4.3 细菌细菌(xjn)(xjn)污染的排除污染的排除第五十一页，共六十五页。52培养基中加适当的抗菌素是抑制细菌生长很有效的方法。培养基中加适当的抗菌素是抑制细菌生长很有效的方法。加加金霉素金霉素(30ug/ml)可抑制多数细菌的生长，可抑制多数细菌的生长，加加青霉素青霉素(20ug/ml)可抑制革兰氏阳性细菌的生长，可抑制革兰氏阳性细菌的生长，加加多粘霉素多粘霉素B(5.0ug/ml)可抑制可抑制G阴性细菌的生长，阴性细菌的生长，加加链霉素链霉素(40ug/ml)或或氯霉素氯霉素(50ug/ml)可以抑制大部分细菌的生可以抑制大部分细菌的生长。长。除去除去氯霉素氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后并可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后并冷却到冷却到45左右时加入左右时加入(以手背触三角瓶感到以手背触三角瓶感到(gndo)烫，但尚可烫，但尚可以忍耐为宜以忍耐为宜)。第五十二页，共六十五页。535、内生真菌的分离、内生真菌的分离先将健康组织，如：叶片和茎，用自来水冲洗干净、晾干水分后先将健康组织，如：叶片和茎，用自来水冲洗干净、晾干水分后,剪成约剪成约1.5cm1.5cm的小片的小片(叶叶)或或1.5cm长的小段长的小段(茎茎)。按下列。按下列(xili)程序进行表面消毒程序进行表面消毒:70%酒精漂洗酒精漂洗30s0.1%升汞漂洗升汞漂洗1min70%酒精漂洗酒精漂洗30s无无菌水冲洗菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分次，在无菌滤纸上吸干水分。将上述处理过的材料在无菌状态下剪切成将上述处理过的材料在无菌状态下剪切成0.5cm0.5cm小片（剪去小片（剪去0.5cm的边缘），或的边缘），或0.30.5cm长段移植于含链霉素的供试培养基上长段移植于含链霉素的供试培养基上（PDA、Czapek、煎汁培养基）、煎汁培养基）,于于261黑暗条件下培养，待黑暗条件下培养，待组织块边缘有菌丝长出后，及时挑取菌丝尖端转入组织块边缘有菌丝长出后，及时挑取菌丝尖端转入PDA平板上培平板上培养。养。第五十三页，共六十五页。54用丝瓜诱发用丝瓜诱发(yuf)瓜果腐霉：瓜果腐霉：Pythium aphanidennatum6 6、土壤、土壤(trng)(trng)真菌的诱发技术真菌的诱发技术与步骤：与步骤：E E、进一步纯化，保存、进一步纯化，保存(bocn)(bocn)备用。备用。D D、在、在2525下放置下放置4-54-5天后，瓜上长出大量白色棉絮状的菌丝天后，瓜上长出大量白色棉絮状的菌丝体，即为所需真菌。体，即为所需真菌。C C、将丝瓜切段，切口端插入土中。、将丝瓜切段，切口端插入土中。B B、加入少量自来水，将菜园土混合成糊状。、加入少量自来水，将菜园土混合成糊状。A A、将菜园土装于玻璃杯中（约半杯）、将菜园土装于玻璃杯中（约半杯）第五十四页，共六十五页。551 1）先用剪刀）先用剪刀(jindo)(jindo)将每粒大麻籽一分为二，然后在水中煮将每粒大麻籽一分为二，然后在水中煮沸，进行简单灭菌。沸，进行简单灭菌。7 7、水生真菌的诱发技术、水生真菌的诱发技术(jsh)(jsh)与步骤：与步骤：4 4）进一步纯化，保存）进一步纯化，保存(bocn)(bocn)备用。备用。3 3）2 2天后开始换水，即将培养皿中的混合水全部倒掉，再加入约天后开始换水，即将培养皿中的混合水全部倒掉，再加入约15ml15ml灭菌水，以后每天换灭菌水一次，一般灭菌水，以后每天换灭菌水一次，一般4-54-5天后即可从大麻籽上长出天后即可从大麻籽上长出菌落，通常为菌落，通常为SaprolegniaSaprolegnia spp.spp.或或AchlyaAchlya spp.spp.。2 2）每人取）每人取3 3个灭菌培养皿，在每一培养皿中加入个灭菌培养皿，在每一培养皿中加入3-43-4瓣经简单灭菌瓣经简单灭菌的大麻籽，然后分别加入的大麻籽，然后分别加入1414、1212、10ml10ml灭菌水，再分别加入灭菌水，再分别加入1 1、3 3、5ml5ml池塘水，置池塘水，置2525培养。培养。第五十五页，共六十五页。56分离工作有时不很顺利，分离工作有时不很顺利，失败的原因失败的原因很多，以下几点值得首先加以考虑：很多，以下几点值得首先加以考虑：（1 1）材料是否新鲜）材料是否新鲜(xn xin)(xn xin)，标本中的病菌是否存活，其中杂菌，标本中的病菌是否存活，其中杂菌滋生的情况；滋生的情况；（2 2）表面消毒所用的药剂和处理方法是否适宜；）表面消毒所用的药剂和处理方法是否适宜；（3 3）培养基是否适当，包括它的化学性状和物理性状；）培养基是否适当，包括它的化学性状和物理性状；（4 4）培养的条件是否适宜，受低温、高温和其他因子的影响；）培养的条件是否适宜，受低温、高温和其他因子的影响；（5 5）病原生物的生物学特点，它对于腐生条件的适应能力）病原生物的生物学特点，它对于腐生条件的适应能力 （三）分离结果（三）分离结果(ji gu)(ji gu)与分析：与分析：第五十六页，共六十五页。57三、培养三、培养(piyng)(piyng)cultureculture病原物的培养病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长生长(shngzhng)的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。第五十七页，共六十五页。58每皿组织块均匀每皿组织块均匀(jnyn)(jnyn)摆放，干水，轻压；摆放，干水，轻压；培养皿倒置或正放；培养皿倒置或正放；于于25-27 25-27 培养箱中培养；培养箱中培养；黑暗或光照，或光暗交替；黑暗或光照，或光暗交替；日光灯，紫色光，黑光灯等；日光灯，紫色光，黑光灯等；2-32-3天后检查结果；天后检查结果；写明日期、姓名等。写明日期、姓名等。第五十八页，共六十五页。591 1菌落的质地；菌落的质地；2 2菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；菌丛密集及繁茂程度、菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；菌丛密集及繁茂程度、3 3形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；4 4各种子实体和休眠结构各种子实体和休眠结构(jigu)(jigu)（厚垣孢子、菌核等）的形成（厚垣孢子、菌核等）的形成 及所需的时间；及所需的时间；5 5菌落正、背面的颜色，有无色素分泌出来而渗入培养基中；菌落正、背面的颜色，有无色素分泌出来而渗入培养基中；6 6有无特殊气味；有无特殊气味；7 7菌落中有无部分呈扇形；菌落中有无部分呈扇形；8 8生长率的快慢，如菌落长到一定直径所需的时间。生长率的快慢，如菌落长到一定直径所需的时间。9.9.培养基种类培养基种类(成分及成分及pH)pH)10.10.培养温度培养温度11.11.光照条件。光照条件。真菌培养真菌培养(piyng)(piyng)性状观察性状观察观察观察(gunch)(gunch)和记载以下内容：和记载以下内容：第五十九页，共六十五页。60 1 1菌丝块法菌丝块法 一般从形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植培养，这也有一定的一般从形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植培养，这也有一定的纯化纯化(chn hu)(chn hu)作用。作用。四、真菌四、真菌(zhnjn)(zhnjn)菌种的纯化菌种的纯化 对一种真菌在进行深入研究以前，菌种的纯化是必要的。此对一种真菌在进行深入研究以前，菌种的纯化是必要的。此外，研究真菌的遗传和变异、性征和同宗或异宗外，研究真菌的遗传和变异、性征和同宗或异宗(y zn)(y zn)配合等现配合等现象，都要求菌种从单个孢子（或小段象，都要求菌种从单个孢子（或小段顶端菌丝顶端菌丝）繁殖而来。）繁殖而来。第六十页，共六十五页。61这种方法这种方法(fngf)(fngf)实质上是分离菌落实质上是分离菌落，主要用于，主要用于细菌和酵细菌和酵母菌母菌等菌种的纯化，但不能看到和确定一个菌落是从等菌种的纯化，但不能看到和确定一个菌落是从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。同时，这种单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。同时，这种方法也不能用来分离特定的孢子。方法也不能用来分离特定的孢子。2 2单菌落法单菌落法 将菌种上产生的孢子用灭菌将菌种上产生的孢子用灭菌(mi(mi jn)jn)水洗下，适当稀释后，取一定量水洗下，适当稀释后，取一定量的孢子悬浮液与熔化后冷却到的孢子悬浮液与熔化后冷却到4545左右的琼脂培养基充分混合，倒平左右的琼脂培养基充分混合，倒平板培养，从形成的单个分散的菌落板培养，从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体培养。上移植菌丝体培养。第六十一页，共六十五页。623 3稀释法稀释法 将孢子悬浮液加适将孢子悬浮液加适量的灭菌水，不断稀释量的灭菌水，不断稀释到每一小滴悬浮液中到每一小滴悬浮液中大大致只有致只有1 1个孢子个孢子。移植到适当的培养基移植到适当的培养基上培养。上培养。此方法操作此方法操作(cozu)(cozu)比比较麻烦，但是比前一较麻烦，但是比前一种分离法可靠。种分离法可靠。第六十二页，共六十五页。63 孢孢子子悬悬浮浮液液中中孢孢子子调调节节到到适适当当的的数数量量，再再涂涂匀匀在在琼琼脂脂平平板板表表面面上上。用用玻玻璃璃针针、金金属属(jnsh)(jnsh)针针或或其其他他器器具具在在显显微微镜镜下下观察和挑取。观察和挑取。4 4琼脂琼脂(qingzh)(qingzh)平板表面平板表面单孢单孢子挑取法子挑取法有有时时可可以以等等到到孢孢子子萌萌芽芽产产生生短短芽芽管管后后再再挑挑取取。孢孢子