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二噁英--色谱法
( 中国科学院上海高等研究院分析测试中心)
高工--
用色谱学方法检测二恶英类化学物质首先需进行样本中待分析物的提取和净化, 这是由于分析物在样本中含量低( ppt级) , 超痕量分析很容易受基质中其它成分的影响。然后色谱柱的分离, 并联用检测器进行定性、 定量。下面将分别介绍以上各步。
提取 这步目的在于使待测物游离, 并萃取进入用于抽提的溶剂中。该步对于检测的重复性至关重要, 主要是溶剂的选择和提取方法的选择, 且不同的样本需采用不同的提取方法。对于土壤、 灰尘等样本使用溶剂有甲苯、 乙烷、 二氯甲烷、 二氯甲烷和丙酮混合液( 1: 1体积比) 、 二氯甲烷和丙烷混合液( 1: 1体积比) 、 苯, 提取时间为12~60小时。而且一般采用索氏抽提, Hengstmann等曾研究采用超音速索氏抽提( supersonic Soxhlet extraction) , 超临界流体抽提( supercritical fluid extraction) 也已使用, Barnabas对此进行了详细综述。对生物样本一般是在冰冻后与无水硫酸钠共同研磨去除水分, 然后再采用合适的溶剂提取。常见溶剂有: 轻石油-丙酮-乙烷-二乙基乙醚( 18: 10: 5: 2体积比) 、 丙酮-乙烷( 1: 1体积比) 、 丙酮-戊烷( 3: 7体积比) 、 丙请、 二氯甲烷和乙烷混合液( 1: 1体积比) 、 氯仿-甲醇-乙烷混合液( 1: 1: 1体积比) 。其中二氯甲烷和乙烷混合液用于血样, 丙请和氯仿-甲醇-乙烷混合液用于奶样, 其余用于脂肪和肌肉组织。血样提取前常添加乙醇和硫酸铵饱和溶液, 然后再抽提。奶样则先用甲酸处理。生物样本提取方法, 除血样和奶样是于室温下振荡提取外, 其它样品一般用Dean Stark的仪器进行索氏抽提。水样中二恶英的抽提一般使用二氯甲烷和甲苯, 于索氏抽提器中抽提24小时。水中多氯联 苯的提取方法主要有三种: ( 1) 使用有机溶剂液-液萃取; ( 2) 使用填充柱吸附; ( 3) 碱性水溶液分解-水蒸气蒸馏法。常见溶剂有正己烷和二氯甲烷, 常见吸附剂有活性碳、 石墨、 高分子大口径网状吸附树脂( 特别是美国的XAD系列) , 常见洗脱剂有乙醚、 甲醇、 二氯甲烷、 甲酮、 二甲基亚砜。对空气样本在采样后, 用以下有机溶剂进行洗脱抽提, 主要为: 丙酮、 甲苯、 苯、 二氯甲烷。对于植物样本首先冰冻脱水, 然后在适当有机溶剂作用下微波消化, 常见溶剂为: 二氯甲烷、 甲苯-丙酮( 1: 1体积比) 、 甲苯-乙醇( 3: 1体积比) 。所有样本提取后的有机溶剂在进行净化前, 都要浓缩以利于下一步操作。
净化 经过抽提步骤多氯代二苯并二恶英/呋喃和多氯联苯绝大部分进入了提取液中, 但同时进入的还包括有机农药、 脂肪物质、 多环芳烃、 叶绿素等, 这些物质的存在会干扰二恶英类物质的检测, 因此必须进行净化去除干扰物质。用于净化的方法主要有以下方法: 液-液分配、 浓硫酸磺化、 碱解、 氧化、 柱层析( 包括凝胶色谱和液相色谱) 。净化方法的选择主要依靠于样本的类型、 抽提溶剂的种类等。液-液分配只能去除部分杂质, 经酸/碱处理的样品, 经过己烷处理可去除部分杂质; 经有机溶剂处理的样品在碱性溶液中分配可去除酸性杂质, 但碱处理时间不能太长否则二恶英会分解; 经有机溶剂提取的样本用浓硫酸磺化, 可去除脂肪、 色素等杂质。柱层析往往采取几根层析柱串联或多种填料填充柱的方法, 当前主要采用两种方法相结合的方法, 即采用两根多种填料填充柱。其中第一根柱由上至下依次填充硅酸钾、 硅胶、 硅酸钾或硅酸铯、 硅胶、 活性碳, 第二根采用串联柱依次填充硅酸钾或硅酸铯、 硫酸饱和硅胶、 活性氧化铝[72]。可是填充柱使用的填料及组合方式多样, 有数十种。佛罗里达毛细管柱( 130度激活) 可将共平面多氯联苯、 多氯代二苯并二恶英/呋喃和非共平面多氯联苯分别开来。佛罗里达柱依次用乙烷和二氯甲烷洗脱, 收集洗脱液, 第一部分为非共平面多氯联苯, 第二部分则包括共平面多氯联苯、 多氯代二苯并二恶英/呋喃可用于分析。最近有发展了三种将共平面多氯联苯与多氯代二苯并二恶英/呋喃分离的吸附剂, ( 1) 多孔石墨碳, ( 2) 2-( 1-芘基) -乙烷基甲基silylated硅胶, ( 3) C60/V70fullerenes bonded to polystyrene-divinylbenzene( 聚苯乙烯-二乙烯基苯) 。这三种吸附剂具有相同的洗脱特性, 所须洗脱剂少。但这三种吸附剂比较昂贵, 样本容量小, 而且要求所进样品不含脂质和其它共存物。使用高效液相色谱来净化抽提物是近几年才发展起来的, 而且也有用薄层色谱来净化提取物的。
测定 二恶英类化学物质的测定采用过高效液相色谱、 高效薄层色谱和气相色谱, 其中气相色谱技术远优于另外两者。所用的气相色谱柱包括填充柱和毛细管柱, 毛细管柱以其所需样品少、 柱效高已逐渐取代了填充柱。普通填充柱内径为2~6mm, 柱长1~3m, 柱容量大, 但精密度及灵敏度不行。毛细管柱长一般25~60 m, 内径为0.20~0.32 mm, 涂层厚度为0.15~0.33 μm, 以前多使用不锈刚和玻璃毛细管柱, 现在以熔融石英为材料的毛细管柱正得到广泛使用。最近, SUPELCO公司推出了二恶英专用毛细管柱, 它极性较强, 能分离TCDDs, 最高使用温度为275度。尽管人们近年来在分离上做了大量的工作, 但想在一根柱上分离全部的异构体是不可能的。表1列出了色谱柱选择的一些标准。
表1 色谱柱的选择
色谱柱的进样方式包括有冷柱头进样、 程序升温进样以及在柱前用冷阱富集进样。
曾用于检测二恶英的检测器很多, 包括有红外、 紫外、 X射线衍射、 荧光、 冷磷光、 核磁共振、 电子自旋共振、 火焰离子化检测器、 电子铺获检测器、 原子激发检测器以及质谱仪。由于检测限的原因, 当前主要使用的检测器是质谱仪, 电子俘获检测器也有一定的应用。质谱仪使用的有低分辨率、 中分辨率和高分辨率, 电离方式有EI和NCI, 但主要使用EI-SMI, 因为使用SIM可减少基体的影响。当前串联质谱也得到了应用, 它与高分辨率质谱仪比较有更好的选择性。有关气相色谱检测二恶英的具体条件及检测限等内容可见表2, 表2仅是少部分例子, 但绝大多数检测都是使用相同的毛细管柱、 相同的升温程序和相同的检测器。
表2 气相色谱检测二恶英的条件和检测限
定性: 二恶英类化学物质的定性可根据与标准物质保留时间比较, 一种方法是在相同条件下, 标准物质与待测物质分别进样比较保留时间; 另一种方法是标准物质和待测物质共同进样, 根据峰高的增加而定性。这种定性方法要求有标准物质, 而当前二恶英类化学物质的数百种物质中仍有一些没有标准物质, 但那些毒性较大的都已有标准物质, 如四氯代二苯并二恶英的22种同分异构体都有标准物质, 可依此检测出毒性最大的2, 3, 7, 8-四氯代二苯并二恶英。另外依靠标准物质定性在标准物质的来源及价格方面也必须有所考虑, 特别是在国内。因此依靠质谱定性是使用越来越多的种方法, 质谱的定性可根据总离子流色谱图、 质量色谱图和碎片色谱图等。
定量: 二恶英的定量采用TEQ定量法: 由于当前只有部分标样, 因此定量时一般采取测定最毒的17种化合物, 以代表全部的二恶英, 即首先测定各分量, 再乘以相应毒性当量因子, 最终以TEQ的量来表示。当前较多的是以同位素为内标来定量, 以同位素为内标定量准确, 可对分析各步进行评价和控制, 进行质量控制。
色谱学方法是当前国际公认的检测二恶英类化学物质的标准方法, 特别是高效毛细管色谱加高分辨率质谱( 以选择性离子方式) , 其优点在于能够分离该类物质的每种成分, 并进行准确的定量。但色谱学方法需要有复杂的样品前处理过程, 一般需数天; 而且要求有精密的仪器、 良好的实验环境和训练有素的操作人员; 用于定性和定量用的标准品也是必须的, 但当前有些标准品还不具备; 一般用色谱学方法检测一个二恶英样品耗时数周至一个月, 花费800~1000美元。因此要在基层单位开展二恶英类化学物质的色谱学检测是不可能的, 中国只有武汉中科院水生生物研究所和中国科学院环境化学研究所进行了这方面的工作。色谱法检测二恶英类化学物质虽然能够精确定量, 但检测某样品的二恶英类化学物质含量, 必须换算成总毒当量。而毒性等价因子的值则依观察终点的选择不同, 其值不同, 不利于比较。而且色谱法仅能反映样本的二恶英类化学物质总量, 而不能反映其生物效应。
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