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不同发展阶段黑素瘤细胞中Wnt5A和Wnt11基因表达的动态变化
【摘要】 目的： 研究Wnt/Ca2+通路中Wnt5A，Wnt11基因在不同发展阶段的黑素瘤细胞中的表达水平. 方法： 运用RTPCR法，检测正常黑素细胞和6种黑素瘤细胞中Wnt5A和Wnt11基因表达水平. 结果： 在正常黑素细胞和不同的黑素瘤细胞中，Wnt5A和Wnt11基因的表达均表现出动态变化的特征. Wnt5A和Wnt11水平在正常黑素细胞中表达很低，而在黑素瘤细胞中有不同程度的升高. 另外，分别来自表面生长阶段、结节状生长阶段和黑色素瘤淋巴结转移的 WM793B, 451Lu和A2058细胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表达水平逐渐下降，甚至在A2058细胞系中，两种基因的表达均低于正常黑素细胞. 结论： 在黑素瘤的不同发展阶段，Wnt5A和Wnt11基因表达的动态变化使非经典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同.
【关键词】 黑素细胞；黑色素瘤；Wnt5A；Wnt11
　　【Abstract】 AIM： To investigate the expression levels of Wnt5A and Wnt11 genes in Wnt/Ca2+ signal pathway activated in different stages of melanoma progression. METHODS: By using RTPCR, we detected the expression levels of Wnt5A and Wnt11 genes in cultured normal epidermal melanocytes and 6 skin melanoma cell lines. RESULTS: RTPCR results showed that the characteristics of Wnt5A and Wnt11 expression were similar, both of which were dynamically changed in different cells. Compared with the low levels in normal melanocytes, Wnt5A and Wnt11 were upregulated with different intensities in the most investigated melanoma cell lines except for A2058. Interestingly, WM793B, 451Lu and A2058 cell lines, which respectively derived from primary superficial spreading situation, nodular melanoma, and lymph node metastases, gradually decreased the Wnt5A and Wnt11 expression levels. CONCLUSION： During different stages of melanoma progression, dynamic change of Wnt5A and Wnt11 gene expressions activates noncanonical Wnt/Ca2+ pathway with different degrees.
　　【Keywords】 melanocytes; melanoma; Wnt5A; Wnt11
　　0 引言
目前对于非经典的Wnt/Ca2+信号通路在恶性肿瘤发生中的作用尚未明确. 早期研究显示： Wnt5a属于Wnt原癌基因家族成员之一,由该蛋白介导的Wnt/Ca2+激活可以抑制多种癌细胞的生长，例如结肠［1］、癌肾癌［2］和膀胱癌［3］. 但是有些研究发现它可以促进细胞的过度增殖和分化,导致多种癌症的发生，如肺癌、前列腺癌［4］、胃癌［5］和乳腺癌［6-7］. 最近，非经典的Wnt/Ca2+信号通路在黑素瘤发生和发展中的作用也逐渐受到重视. 虽然Weeraratna［8］提出在黑素细胞成熟、增殖和形成肿瘤的阶段需要不同的Wnt蛋白家族成员参与，但是该信号通路发挥作用的确切机制尚未明确,值得深入研究.
　　1 材料和方法
　　材料 角质形成细胞无血清培养基KSFM，DMEM、胰蛋白酶，购自美国GIBCO公司，胎牛血清FCS购自杭州四季青公司. 逆转录试剂盒均购自Gibico公司，TRIzol购自Invitrogen公司.原代培养黑素细胞取自15～25岁的青少年包皮环切手术标本. 6种恶性黑素瘤细胞株均为本实验室保存.
　　方法

　　黑素细胞分离和培养 正常人黑素细胞分离培养方法参照文献［9］. 将包皮组织浸泡于750 mL/L乙醇溶液中1 min后，用加双抗的DHanks液冲洗，放入 g/L dispase 液中4℃过夜，次日分离表皮，将表皮剪碎，在 g/L胰酶中消化5 min，制成细胞悬液，细胞浓度以1×105/mL为宜，接种于DMEM/F12培养液中，置入37℃,50 mL/L CO2孵箱中. 2 h后，弃上清，用无血清的KSFM培养基培养3 d，换为黑素细胞培养基培养. 在37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养，第3～6代细胞用于试验.

　　黑素瘤细胞培养 将复苏的黑素瘤细胞置事先加含100 mL/L 胎牛血清的DMEM细胞培养液的培养瓶中, 37℃, 50 mL/L CO2孵箱内培养.常规更换培养液、传代.
　　细胞形态学观察 培养的正常黑素细胞和黑素瘤细胞生长方式和细胞形态通过 IX71倒置显微镜获得.
　　RTPCR 用RTPCR方法检测正常黑素细胞和6种黑素细胞瘤细胞中Wnt5A表达. PCR反应体系20 L，Wnt5A引物序列如下，上游引物5′CAGTTCAAGACCGTGCAGAC3′；下游引物5′TGGAACCTACCCATCCCATA3′；Wnt11引物序列如下，上游引物5′TGACCTCAAGACCCGATACC3′；下游引物5′CAAGTGAAGGCAAAGCACAA3′；GAPDHP引物序列如下,上游引物 5′ATGACATCAAGAAGGTGGTG 3′，下游引物5′CATACCAGGAATGAGCTTG 3′. PCR反应条件为： 预变性94℃，5 min，94℃，40 s；退火54℃，40 s；延伸 72℃，1 min；终末延伸72℃，5 min，共30个循环.
　　2 结果
　　细胞形态学检测 培养的正常黑素细胞和黑素瘤细胞在生长方式和细胞形态上均有显着的不同. 培养的表皮黑素细胞呈现规则的涡旋状生长方式，细胞形态为纤细的双极纺锤状，细胞核清晰，黑素颗粒少见. 来自浅表扩散型恶性黑素瘤的WM793B 细胞形态多为双极纺锤状，黑素颗粒较多. 来自结节性恶性黑素瘤黑素瘤 的451Lu 细胞形态为树枝状. 来自黑素瘤腋窝淋巴结转移的SKMEL5细胞形态为短纺锤状，并有局部聚集生长的倾向. 来自黑素瘤淋巴结转移,具有高侵袭特性的A2058细胞呈局部聚集生长，形态主要为纺锤状. Libr细胞和A375细胞也呈现纺锤状. 与正常的黑素细胞相比，6种黑素瘤细胞均呈现出典型的肿瘤细胞特性，即细胞膜、细胞核的形态异质性以及生长方式的不规则性.
　　RTPCR结果 Wnt5A和Wnt11条带出现的位置分别是500 bp和510 bp，对照组内参GAPDH条带出现的位置是170 bp. 在正常黑素细胞和不同黑素瘤细胞中，Wnt5A和Wnt11的表达均表现出动态变化的特征. 正常黑素细胞中Wnt5A和Wnt11水平表达很低，甚至不表达. 在检测的6种黑素细胞瘤中两种基因水平有不同程度的变化. 除了来自肿瘤淋巴结转移的A2058细胞系表达水平显着降低外，其余5种黑素瘤中Wnt5A和Wnt11均升高. 通过比较发现： 分别来自浅表扩散型黑素瘤、结节性黑素瘤和黑色素瘤淋巴结转移的WM793B,451Lu和A2058细胞系的Wnt5A和Wnt11基因表达水平逐渐降低.
　　A: 表皮黑素细胞; B: WM793B细胞; C: 451Lu细胞; D: SKMEL5细胞; E： A2058细胞; F: Libr细胞; G: A375细胞. 标尺：25 μm.
　　图1 培养的正常黑素细胞和黑素瘤细胞的形态特征比较
　　1: MC; 2: SKMEL5; 3: A2058; 4: Libr; 5: WM973B; 6: 451Lu; 7: A375.
　　图2 正常黑素细胞和黑素瘤细胞Wnt5A和Wnt11基因表达

　　3 讨论
我们选择了不同生长阶段的黑素瘤细胞系模拟黑素瘤的肿瘤发生和发展过程，其中WM793B细胞系来自肿瘤的浅表扩散阶段，451Lu细胞系来自结节状生长阶段， SKMEL5 和A2058细胞系来自远处淋巴结转移. 结果发现： 在正常黑素细胞和黑素瘤细胞中，使Wnt/Ca2+信号通路激活的两个重要成员的基因Wnt5A和Wnt11［8］的表达均呈现出动态变化的特征. 在正常黑素细胞中，Wnt5A和Wnt11水平表达很低；分别来自表面生长阶段、结节状生长阶段和淋巴结转移的WM793B, 451Lu和A2058细胞系的Wnt5A和Wnt11水平有逐渐下降的趋势.
Wnt5A基因被认为是评价皮肤黑素瘤侵袭能力的重要指标［10］，并且进一步的研究显示： Wnt5A介导的Wnt/Ca2+信号通路主要通过激活蛋白激酶C增强黑素瘤的侵袭力［11］. 然而临床研究却表明： Wnt/Ca2+信号通路的激活程度与黑素瘤的侵袭力并非正相关. Bachmann等［12］发现细胞核内Wnt5A基因表达越高，黑素瘤进展越慢，对瘤组织周围的侵袭能力也越弱. Pham等［13］通过比较皮肤黑痣和黑素瘤中Wnt蛋白与组织病理特征之间的关系发现： 黑痣组织中Wnt2, Wnt5A, Wnt7b和Wnt10b高表达；在胞体小而规则的细胞内，Wnt蛋白与黑痣相似；而在胞体大而不规则的细胞内，Wnt10b高表达，Wnt5A低表达，Wnt2无表达. 我们的实验结果也提示： 随着黑素瘤在浅表扩散阶段、结节状生长阶段和淋巴结转移的不同阶段Wnt5A和Wnt11的激活程度呈现出动态变化的特点，并且有随着肿瘤发展而基因表达逐渐下降的趋势. 结合上述临床资料，可以推测在黑素瘤的不同发展阶段，Wnt5A和Wnt11的基因表达的动态变化使Wnt/Ca2+信号通路激活程度不同，从而影响肿瘤的侵袭能力. 正确认识Wnt/Ca2+信号通路在黑素瘤发生和发展过程中的作用，将为这一具有高度侵袭特性的肿瘤的预防和治疗提供有意义的参考.
【参考文献】
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