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微卫星不稳定状态对散发性直肠癌预后的影响
【摘要】 目的 研究汉族人散发性直肠癌的微卫星不稳定状态(microsatellite instability,MSI)及其与临床病理学和预后的关系。方法 应用PCR扩增患者肿瘤组织和对应正常组织的DNA，分析微卫星不稳定状态，并采用单因素、多因素分析评估预后。结果 MSI分为高频率微卫星不稳定(microsatellite instabilityhigh,MSIH)、低频率微卫星不稳定(microsatellite instabilitylow,MSIL)、微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)。93例直肠癌患者中，MSIH 11例(12%)，MSIL和MSS分别为23例(25%)和59例(63%)。与MSIL和MSS相比，大多数MSIH为高分化肿瘤、患者年龄小、术前CEA水平高、总的生存率高。结论 在汉族人群散发性直肠癌中，MSIH发生率高，且MSI是一个相对较好的预后预测指标。
【关键词】 微卫星不稳定； 直肠肿瘤； 散发性
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between microsatellite instability (MSI) status and clinicopathological features and prognosis of sporadic rectal cancer in Chinese Han population. Methods DNAs from freshfrozen paired samples of tumors and corresponding normal tissue from 93 rectal cancer patients were analyzed for MSI by PCR amplification. Cox proportional hazards model was used to assess prognostic significance. Results Eleven (12%) tumors in our study were highfrequency MSI (MSIH), 23 (25%) were lowfrequency MSI (MSIL) and 59 (63%) were microsatellite stable (MSS). Compared with MSIL and MSS tumors, most of the MSIH tumors were found in young patients, had high grade of differentiation and high level of preoperative serum carcinoembryonic antigen. The survival rates of rectal cancer patients with MSIH were higher than those with MSIL or MSS (RR, ; 95% CI,　to , ). Conclusions There is high incidence of MSIH in sporadic rectal carcinoma in Chinese Han population. MSI is a comparatively good prognostic factor of sporadic rectal carcinoma.
【Key words】 Microsatellite instability; Rectal cancer; Sporadic
在国内，肿瘤引起的死亡中结直肠癌居第5位，并且有上升的趋势。过去30多年由于技术的进步使其病死率有所下降，但总的预后仍然很差。微卫星不稳定状态(microsatellite instability，MSI)的评估能为结直肠肿瘤提供有用的预后信息，怀疑具有遗传性非息肉病性大肠癌的患者被排除。入选病例术前均未行放、化疗。102例患者中， 9例由于标本不足或失访，仅93例进行研究。家族史、民族情况通过口头询问获得。肿瘤组织学类型及分化程度根据WHO标准,临床病理学分期根据第六版美国癌症联合委员会(AJCC)分期指南。
随访采用门诊复查、电话及书信。30例Ⅱ期和30例Ⅲ期直肠癌患者接受术后化疗(5氟尿嘧啶+四氢叶酸+奥沙利铂)，15例Ⅳ期患者中，10例接受术后化疗，其余患者接受中药治疗。生存时间定义为自手术治疗之日至末次随访日或死亡所经历的时间，以月为单位计算。研究终点为2006年10月，中位随访时间为34个月(4～48个月)。
　DNA提取
石蜡组织连续切片，再进行显微切割，把切割后含70%以上肿瘤细胞的组织和正常大肠组织用二甲苯和酒精多次脱蜡,加蛋白酶K消化后，用快速盐析法提取DNA，4 ℃保存备用。
　MSI测定
引物由宝生物工程(大连)公司合成。选择美国国立癌症研究所(NCI)推荐的5个标记(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250)进行MSI研究。所有引物序列根据基因数据库。将肿瘤与其相应正常组织基因组DNA的PCR结果同时比较，若肿瘤标本电泳带对照正常组织相应电泳带出现移位带或额外带即为MSI，若5个微卫星位点中有≥2位点表现为MSI则为高频率微卫星不稳定(microsatellite instabilityhigh,MSIH)；若仅1个位点出现MSI，则为低频率微卫星不稳定(microsatellite instabilitylow,MSIL)；若没有位点出现MSI则为微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)。PCR条件参照文献［3］，PCR产物采用2%含Goldview的凝胶进行电泳，然后用紫外线透照灯检查并证实为一条带。证实后的PCR产物在6%含8 mol/L尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。凝胶参照文献［4］的方法进行银染。出现MSI的病例分别重复2～3次PCR和电泳。 统计学分析
数据采用SPSS 软件包分析。用χ2检验、t检验和Fisher确切概率法对临床病理学各参数进行统计；生存曲线通过KaplanMeier法生成并采用Logrank检验进行比较；多因素分析采用Cox比例风险模型，仅统计有意义变量进入最终Cox模型分析，双侧检验。为差异有统计学意义。
2 结果
　患者基本特征
93例中，男50例，女43例；中位年龄56岁(22～85岁)。通过MSI分析，59例为MSS，23例为MSIL，11例为MSIH。与MSIL或MSS相比，MSIH更常见于起病早的直肠癌(73%的MSIH患者年龄55岁，Fisher值为，，)。55%的男性直肠癌患者和45%的女性直肠癌患者显示MSIH， 但是在MSI和性别之间没有相关性。
　　　MSI与临床病理学特征
与MSIL或MSS相比，MSIH具有高分化的特征，并且术前CEA水平更高(Fisher值为，，，，)。在性别、肿瘤大小、浸润深度或组织学方面，没有观察到MSIH与MSIL和MSS之间的差异。当我们将MSIL和MSS合并起来与MSIH进行比较时，统计学上相关性不变。当我们单独对比MSIL和MSS时，两者差异无统计学意义(表1)。
　生存分析
单因素分析中，分期(0和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)、组织学(非黏液癌)、分化程度、术前CEA水平( μg/L)等因素与预后相关，见表2。MSIH的预后比MSIL和MSS明显更好()。多因素分析中，MSI状态、患者年龄、肿瘤分期和组织学与预后相关，见表3。MSIH肿瘤表现出比非MSIH肿瘤更低的死亡风险(相对危险度；95%可信区间～；)。 表1 93例直肠癌患者的MSI与临床病理学特征表2 93例直肠癌患者预后的单因素分析表3 93例直肠癌患者预后的多因素分析
3 讨论
目前，对散发性直肠癌MSI的特征和重要性了解不多。我们从93例患者中发现了MSIH直肠癌在此种群的频率及其特征。通过PCR的筛选揭示了MSIH、MSIL、MSS的频率分别为12%、25%和63%。这个频率高于之前Morán等［5］的报道，而低于Colombino等［6］的报道。我们认为汉族人中较多的MSIH直肠癌可能归结于种族的差异，后者主要在于许多方面，诸如生活方式、饮食习惯和环境等。另外，样本的选择，如混杂家族病例，也可以导致MSI频率的差异［6］。
本研究中直肠癌MSIH频率较高，这可以在一定程度上反映汉族人直肠癌的发病机制。对于结直肠肿瘤发生，已经报道两种形式的基因组不稳定：MSI和染色体不稳定(chromosomal instability，CIN)。林武华等［7］的研究表明错配基因修复突变引起MSI是导致结直肠癌发生的机制之一。我们认为：如果表现MSIH表型的肿瘤在发展为癌的过程中被看作通过MSI途径，那么与其他种群相比汉族人群的MSI高发生率而言，MSI通路只对12%的汉族人群的散发性直肠癌负有责任。也可能该种群与一般种群相比，散发性直肠癌的CIN和MSI特征有更显着的重叠。
本组中散发性直肠癌的汉族病例证实MSIH与年龄小、分化程度高和术前血清CEA水平高显着相关。MSIH与MSS和MSIL之间不同的特征表明遗传不稳定可能瞄准易感性不同的癌基因和/或通路。我们发现与年龄55岁的关系同Colombino等［6］的研究，而与Ishikuboa等［8］的研究相反。这个偏差可能归结于所用样本的种群和数目的不同。
本研究发现MSIH预后更好。同时，多因素分析，MSIH患者的生存优势独立于几个临床和病理学参数。
在我们的研究中，不论肿瘤的分期，MSIH有更好的预后。但这是肿瘤的内在致癌特点赋予一个低侵袭的生长模式，还是其对化学治疗制剂的更好反应尚不清楚。所以MSI是否可以作为直肠癌化疗反应的监测有待证明。
总之，汉族人群直肠癌的MSIH发生频率高于之前报道的众多种群且MSI是一个相对好的预后的预测指标。加上不同亚组散发性直肠癌可能对相同治疗产生不同的结果。因此，基于MSI测定的直肠癌的分类将为直肠癌的个体化诊断和治疗提供重要的依据。
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