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溃疡性结肠炎与肠道细菌研究进展【摘要】 溃疡性结肠炎是一种慢性非特异性的炎症性肠病，其病因和发病机制尚不明确。目前多认为是由多种因素共同作用的结果，主要包括感染、免疫、遗传、精神及心理等因素，其中感染因素在UC起病中发挥重要作用，已在多项研究中得到证实。近年来，关于各种肠道病原微生物在UC中的损伤机制及其引起的一系列免疫学、微生态学、病理生理等方面的变化出现了研究和报道，同时由于微生态制剂在肠道免疫调节、控制炎症反应等方面的优点已大量用于治疗UC。本文就溃疡性结肠炎与肠道菌群紊乱研究进展以及微生态制剂治疗UC综述如下。关键词 溃疡性结肠炎 细菌 微生态制剂 溃疡性结肠炎是一种病因不十分明确的慢性非特异性肠道炎性疾病。现在研究认为该疾病是由多种因素作用的结果，包括:基因易感性、肠道细菌作用、自身免疫失衡、环境因素等。近年来针对UC的病因、发病机制的研究，以及临床治疗均越来越重视肠道细菌及其他病原体在其间所起的作用。 1 肠道病原体与UC发病的相关性 感染因素一直被认为是UC的主要致病因素，虽尚未被证实，但许多研究均表明细菌是UC的始发因素，在无菌动物模式中不能诱发与UC类似的炎症 14 ;改变宿主肠道内菌群分布即可改变其肠道粘膜的炎症反应和免疫反应过程 57 。 Borody等 8 报道了6例经过挑选的UC病人在经过2周的抗炎治疗后，即停用一切抗炎治疗改用健康人肠道菌群灌注疗法至少5年，分别停用113年后，该6例患者都未复发。故推测肠道内多种具有抗微生物活性的菌群可保护肠道免受病原体入侵，同时正常的肠道细菌可分泌细菌素抑制病原体的生长 9 。 由于炎性肠疾病的症状与典型的肠道感染、Johnes病较相似，在过去的数十年中，许多病原体都被推测为IBD的病因，例如沙门菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、耶尔森鼠疫杆菌、组织内阿米巴属及双核阿米巴属、分枝杆菌属、副结核杆菌属等 1013 。但是，没有一种病原体可被持续发现或单独证实。使用经典的粪标本肠道菌培养法来分析肠道菌群已超过15年了，然而，只有10%40%肠道细菌可用这种方法被鉴别出来。近年随着RT-PCR、原位荧光杂交、PCR-单链构象多态性分析技术及其他基因片段分析技术的发展，可更加精确地分析肠道菌群的组成和变化。Ott等用SSCP技术发现在UC和CD的患者中，肠道细菌的多样性较正常对照人群明显增高 13 ，但仍需做进一步研究以明确该种变化是原发性还是继发性的。Fite等用RT-PCR技术发现UC患者的肠粘膜活检标本中100%有脱硫弧菌属的脱硫菌 4 ，SRB在大肠中将硫酸盐转化成硫化物，后者对结肠上皮有细胞毒作用，而用常规细菌鉴别法，大约有92%UC患者和52%非炎症性肠病患者的粘膜活检组织中发现SRB 15 。 在一项回顾性研究中 16 ，除了考虑细菌感染为IBD的首发原因外，还发现了病毒感染也可能参与其间，在三个患者组织中发现腺病毒，一个患者发现了肠病毒，另一个患者发现有高滴度的巨细胞病毒抗体并有血清学反应。 2 肠道细菌在UC发病过程中的作用 近年来的研究表明可能是肠道细菌及其代谢产物作用于基因易感性宿主，使之产生免疫应答，三者在炎症的开始和持续发展中起了重要的协同作用，即“扳机”样作用 17 。在IBD中，病原微生物引起的感染可导致组织损伤，肠上皮由于细菌、内毒素的侵害可诱导细胞因子分泌而增加了黏膜的渗透性。一旦肠黏膜屏障被突破，侵入的肠道内抗原就可引起慢性的持续性刺激，招募各种免疫活性细胞，引发一系列的炎症反应。在临床，亦可发现季节性发病的IBD患者多于春秋季发病，可能与潜在的感染有关 18 而非消化道感染亦可引起IBD的复发频率增高，其中40%60%的复发与呼吸道感染有关。 在UC活动期患者的肠黏膜活检发现SRB，SRB可分解产生H 2 S，故推测SRB是导致UC的一个活跃的致病因素 19 ，它可提高肠道内硫酸盐的浓度而致结肠黏膜溃疡。在动物模式中，用硫化钠溶液灌注鼠结肠上皮细胞，在生理浓度范围内呈剂量效应关系，现结肠上皮细胞凋亡、杯状细胞减少、黏膜糜烂溃疡 20 。丁酸酯类是结肠上皮细胞获能的重要来源之一，而H 2 S却会抑制丁酸醋类的氧化和利用。因此SRB干扰丁酸酯类的代谢可致肠绒毛层的萎缩，而肠绒毛层萎缩及杯状细胞增生肥大正是活动性结肠炎的一个特征 21 。 某些肠道菌群可引起肠道丁酸代谢紊乱，而丁酸代谢异常则导致肠黏膜UC样改变。Ohkusa等 22 用变形梭菌培养上清液灌注小鼠结肠细胞24h后的变化与用丁酸溶液灌注的变化相同，都出现黏膜下溃疡、炎性细胞聚集及细胞凋亡样表现。推测F varium中致病因子为丁酸，后者对结肠Vero细胞有细胞毒作用。研究发现，UC患者结肠上皮细胞氧化丁酸的能力较正常人群的结肠上皮细胞明显降低，局部高浓度的丁酸超过了病变区域的肠上皮细胞代谢处理能力，而直接造成对粘膜的损伤。随后在对活动性UC患者的结肠黏膜组织活检并进行免疫化学分析证实，F varium可侵入结肠黏膜并在隐窝内生存，其产生的丁酸直接对肠上皮有细胞毒性作用。 3 菌群紊乱引起结肠上皮细胞的炎症反应在肠道常存在着大量的细菌、食物抗原及其他种类的抗原，而消化道相关淋巴结可保护宿主免受潜在病原体的攻击或由肠道内抗原引起的异常免疫反应。这是一个抑制和激活相互拮抗的过程。通常引起消化道病变的免疫反应有以下几个特点:在IBD炎症的肠段固有层中的T、B细胞较非炎症区域表达更多的细胞活化标志物。IBD患者粘膜的T细胞表达的前炎症因子增加，UC患者可能表现出来的是一系列Th2细胞激活的疾病，与CD的发病机制不同，当然这种理论还未完全证实。激活固有层T细胞引起炎症反应的是记忆性抗原，与引起正常粘膜免疫反应的抗原不同，其引起组织增生为主。此外，抗原刺激诱导细胞凋亡而以免疫细胞增生的机制在IBD患者中也是异常的。与正常对照组比较，IBD患者分泌血浆IgA细菌减少，而分泌血浆IgG和IgM的细胞增多，部分是针对原籍菌的。在IBD患者中递呈抗原的肠上皮细胞激活的是CD4 + Th细胞，而不是CD8 + Ts细胞。而在免疫反应异常的开始阶段，粘膜屏障的缺损似为一个重要的原因。在一个用N-钙粘素阴性基因取代正常E-钙粘素的小鼠模型中，它们的肠黏膜中既有正常的肠粘膜区域也有较薄弱的区域，在其较薄弱的区域中表现出慢性IBD样改变 23 。 Dionne等 24 在活检组织中可以观察到，随着细菌的刺激，肿瘤坏死因子-、白介素-1、白介素-1受体拮抗物增加。在UC患者的直肠活检组织中，TNF-非刺激性分泌明显增加，且与炎症的严重程度相关联。脂多糖在炎症组织中只适度地刺激TNF-的分泌，而美洲商陆丝裂原在UC患者和正常对照人群中都可引起TNF-的分泌，在UC患者中引起更明显的增加。超抗原金葡菌肠毒素A可引起炎似的效应，程度较PWM轻。SEB在各组中是最强的TNF-诱导剂，在炎症组织中尤为明显。IL -1的分泌较TNF-相对减少。SE的诱导作用较LPS强，但较诱导TNF-的效应减弱。此外，IL-1RA也是由细菌刺激产生的，IL-1RA/IL-1率相对稳定。在炎症组织中，炎症因子TNF-和IL-1分泌增加，而抗炎因子IL-1RA只由正常肠上皮细胞分泌增加。由于细菌内毒素和LPS协同可增加肠粘膜的渗透性，LPS或细菌毒素在IBD患者的血浆中测得，菌群失调及/或肠膜通透性增加进一步引起了内毒血症。Bene等 25 发现在CD及UC患者中抗微生物热休克蛋白65抗体明显低于健康人群，在活动性CD及活动性、缓解期UC可测得低水平HSP65抗体，故推测可能是由细菌HSP65或其抗原决定簇引起的宿主针对肠道细菌感染的免疫反应紊乱亦参与其间。 过去一直认为肠上皮细胞只是被动地应对细菌的侵袭，现在发现肠上皮细胞在对病原微生物的识别及随后的一系列反应中都起着积极的作用。用细菌内毒素刺激体外培养肠上皮细胞，可发现细胞低表达内毒素受体TLR-4 26 。但近来有资料表明肠上皮细胞表达细胞内TLR-4，且只在内毒素区域表达。在内毒素的影响下，肠上皮细胞还可调节内毒素结合蛋白分泌。NF-B和丝裂原活化蛋白激酶在肠上皮细胞内调节内毒素诱导的反应，而核受体PPAR-途径可抑制前二者的活化途径。肠道细菌可诱导PPAR-表达，而在UC患者中表达相对较低。在结肠炎模型中，治疗性激活PPAR-途径可减轻炎症的严重程度 27 。 4 抗肠道病原体治疗及微生态制剂的应用 柳氮磺胺吡啶类药物是治疗UC的传统药物。近来研 究发现它有抑制肠道内氨基酸分解产生硫化物的作用。磺胺吡啶没有此项功能，5-ASA作用较小。而其新型制剂的效果则较明显 28 。 基于感染理论的运用，抗生素在临床上使用较普遍。特别是甲硝唑、氯林可霉素、环丙沙星结合万古霉素治疗发作期的UC效果较好。这些抗生素主要针对厌氧菌和一些革兰阳性菌。然而在一组随机对照实验中，抗生素的治疗效果却不理想，这可能是由于还不明确何为致病菌，何时该给予抗生素、抗生素的配伍及使用疗程的问题 29 。近年来发现CMV可加重用激素难以控制的IBD患者的病情 3031 ，故临床上对这类病人加用抗病毒药物治疗，取得了较好的疗效甚至有的病人进入了缓解期 3233 。 在对UC的动物模型临床研究中发现，UC发作期与健康对照组粪便菌群比较，肠杆菌和肠球菌呈有意义增加，尤以肠链球菌数增加显着，而酵母菌变化不显着，乳酸杆菌也略有减少。主要原籍菌双歧杆菌、真杆菌、类杆菌和消化链球菌都呈有意义减少，双歧杆菌检出率尤其低 34 。因此微生态制剂已被广泛用于治疗和改善UC炎症活动情况。微生态制剂一般包含乳酸菌、双歧杆菌和消化链球菌，但其具体治疗机制目前未完全明确。 有研究认为，乳酸菌通过影响树突状细胞的活性，可介导白介素-12和TNF-分泌，上调MHC分子的表达。然而有些亚型的乳酸菌可引起相反的效应，例如:L reuteri介导IL-12和TNF-作用及上调MHC分子表达的作用较小，对IL-10无影响。L casei则可抑制IL-12、TNF-、IL-6的合成。 Shibolet等 35 发现在用微生态制剂治疗由不同诱导剂诱导的UC动物模型的疗效有明显不同。微生态制剂在治疗由巯基阻滞剂诱导的动物模型疗效明显，而对由硫磺二硝基苯酸诱导的动物模型几无疗效，微生态制剂的保护效应主要表现在结肠的损伤面积和结肠湿重减少，并伴有PGE2代谢物和MPO减少，NOS活性增加。巯基复合物在维持消化道上皮的完整性方面起到了重要的作用，有抗自由基的作用。Iodoacetamide诱导的UC动物模型反映了氧自由基损伤粘膜的生化过程，该研究揭示微生态制剂可能有增加内源性巯基复合物的作用，或清除氧自由基的作用。 Suhultz 36 用乳酸菌治疗IL-10基因敲除的小鼠UC模型，发现炎症过程明显和缓，粘膜中IgG、ITF-和IL-12含量降低。如继续使用，则在组织学上可看到明显改善。在体培养中还发现活性乳酸菌可增强血液中吞噬细胞和腹膜中吞噬细胞的活性。但目前在临床上，微生态制剂一般只用于预防或缓解炎症反应加剧，而非急性期的治疗。 在另一项随机对照的临床试验中，Ishikawa等 37 用含有双歧杆菌的牛奶作为日常食物提供给UC患者，BFM组剂量是100ml/d，持续1年。试验结束后分别考察两组的肠镜表现、血液学检查及肠道菌群培养结果。发现在BFM组中有3人病情加重，而在对照组中中有9人病情加重。肠道菌群培养结果显示，BFM组中肠杆菌属及丁酸盐类的浓度较对照组明显降低。故推测双歧杆菌有预防UC复发的作用。 而在比较抗生素和微生态制剂的作用方面，Marotta等 38 设计了以下这个试验，选择了26名缓解期UC患者随机分为两组，另选了对照组15人，分别先测定其血常规、内毒素浓度、脂多糖结合蛋白和巨噬细胞集落刺激因子的浓度。然后一组予以甲硝唑，另一组予以复合微生态制剂SCM-，各治疗2周，经过6周洗脱期后再进行交换治疗。在每次治疗前后对各组进行血液学检查。发现治疗组与对照组的内毒素水平无明显差别，而内毒素水平随着病程的迁延反复和病变范围的扩大可明显升高，SCM-有降低内毒素水平的作用，而甲硝唑无此作用。对于M-CSF，SCM-已有明显的下调作用，而甲硝唑对此亦无作用。而在LBP水平及血浆抑制内毒素作用方面，SCM-组与甲硝唑组无明显差别。故建议无论何种类型的UC患者都可长期加用微生态制剂治疗。虽然微生态制剂有价廉、安全、无害等优点，但能否长期应用微生态制剂尚无定论，因其具体机制还未完全阐明，但可以确信微生态制剂在治疗IBD方面是一类非常有前景的药物。 参考文献 1 Rath HC，Herfarth HH，Ikeda JS，etluminal bacteria，especially Bacteroides species，mediate chronic colitis，gastritis，and arthritis in HLA-B27/human beta2microglobulin transgenicClin Invest，1996，98:945-953. 2 Rath HC，Wilson KH，Sartorinduction of colitis and gastritis in HLA-B27transgenic rats selectively colonized with Bacteroides vulgatus or EscherichiaImmun，1996，67:2969-2974. 3 Waidmann M，Allemand Y，Lehmann J，etreactive IL10producing regulatory T cells are present in the colon of IL2deficient mice but lack efficacious inhibition of IFN-gamma and TNF-alpha ，2002，50:170-179. 4 Sellon 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